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Article de méthode

Injections de lipopolysaccharides dans souris pour imiter l’entrée des produits d’origine microbienne après rupture de la barrière intestinale

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DOI :

10.3791/57610

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2 mai 2018

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1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital of Basel

Dans cet article

Avis d’erratum

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Résumé

Un protocole pour simuler l’entrée de composés d’origine bactérienne après rupture de la barrière intestinale est présenté ici. Une faible dose de lipopolysaccharide a été injectée systémique chez la souris, qui ont été observées pendant l’injection après 24 h. L’expression des cytokines pro-inflammatoires était déterminée à plusieurs moments dans la rate, du foie et du colon.

Résumé

La barrière épithéliale intestinale sépare l’hôte de la microflore est normalement tolérée ou ignorée. La violation de cette barrière se traduit par l’entrée de bactéries ou de produits dérivés de bactéries dans l’hôte, l’accès à la circulation de l’hôte et les organes internes menant à l’inflammation incontrôlée, comme observé chez les patients atteints de la maladie intestinale inflammatoire (MII), qui sont caractérisés par une augmentation de la perméabilité épithéliale intestinale.

Pour simuler l’entrée de composés d’origine bactérienne dans l’hôte, un modèle endotoxémie a été adoptée par les lipopolysaccharides (LPS), un composant de la paroi externe des bactéries Gram-négatives, ont été injectées à des souris. Dans cette étude, une dose de LPS a été injectée par voie intrapéritonéale et les souris ont été suivis par la suite pendant 8 h, à l’aide d’un score de maladie. En outre, l’expression taux de cytokines inflammatoires Il6, Il1b et Tnfa ont été analysés dans la rate, le foie et le colon de qPCR à des moments différents après injection de LPS. Ce modèle pourrait être utile pour les études portant sur l’étude des réponses immunitaires après l’invasion de micro-organismes ou de produits dérivés bactérien causés par un manquement de la barrière de la surface du corps.

Introduction

L’intestin humain est colonisé avec un grand consortium de micro-organismes qui forme le microbiote, qui a développé une relation mutuellement bénéfique avec l’hôte au cours de l’évolution. Dans cette relation, l’hôte fournit un créneau sûr pour la microflore, tandis que le microbiote fournit des vitamines, de la digestion des éléments nutritifs et de protection contre les agents pathogènes à l’hôte, où le microbiote réside1. Lorsque cette relation positive entre l’hôte et le microbiote est perturbée, les maladies peuvent se développer, tels que les maladies inflammatoires de l’intestin (MII). EIA est une maladie inflammatoire chronique multifactorielle de l’intestin causée par des facteurs génétiques et environnementaux qui se produisent sous deux formes principales, (CD) de la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse (Cu). Malgré les similitudes entre les deux formes de l’EIA, elles sont caractérisées par certaines différences dans la localisation et la nature des modifications inflammatoires. CD est une affection inflammatoire de rechute transmurale qui peut potentiellement s’étendre à n’importe quelle partie du tube digestif, tandis que l’UC est non transmural et est limité à du côlon. En outre, les mutations de liaison nucléotidique oligomérisation domaine protéine 2 (NOD2), un récepteur de reconnaissance de modèle (PRR) qui reconnaît MURAMYLE dipeptide (MDP), un composant de la paroi cellulaire des bactéries plus Gram positifs et - négatifs, est associé à CD2. En outre, Escherichia coli (e. coli), Listeria et streptocoques et leurs produits tous se trouvaient dans les macrophages chez les patients de CD qui sont entrés dans l’hôte après une barrière violent3. Lorsque les bactéries ou leurs produits dans l’hôte pendant l’élaboration du CD, le système immunitaire développe une réaction conduisant à la production d’anticorps anti-bacterial4en circulation. Peut-être, la preuve la plus convaincante pour le rôle de la microflore dans la pathogenèse de l’IBD provient de modèles murins. Lorsque les animaux est traités avec des antibiotiques, ou lorsque les souris sont maintenues dans des conditions sans germe (GF), la sévérité de la maladie est réduite dans la plupart des modèles de colite, comme dans IL 10-souris-/-qui ne se développent pas colitis en GF installations5,6. En outre, la colite perturbe également la composition de la microflore, qui se caractérise par une composition déséquilibrée et réduit la richesse appelé dysbiose7. La conséquence de l’IBD peut être une augmentation de la perméabilité intestinale pouvant mener à l’entrée de microbes et de produits d’origine microbienne dans l’hôte.

Chez les animaux, l’application de Dextran Sulfate de Sodium (DSS) a induit une atteinte épithéliale intestinale conduisant à une augmentation de la perméabilité de la barrière épithéliale8. Portail LPS concentrations sont élevées chez les animaux souffrant de colite DSS9. Fait intéressant, animaux manquant le C type lectine du récepteur spécifique adhérence intracellulaire molécule 3 saisissant nonintegrin liée au homologue 1 (signe-R1) sont protégés contre colite DSS et induite par LPS endotoxémie10. Pour diffuser dans l’hôte, les bactéries ou les bactéries provenant de produits doivent passer la barrière vasculaire11, la cavité péritonéale, où se trouve le petit et grand intestin, les ganglions lymphatiques mésentériques et/ou le foie12. Pour réduire la complexité de ce système, un composé dérivé de bactéries défini a été utilisé. LPS, ce qui provoque l’endotoxémie après voie intrapéritonéale ou par voie intraveineuse (i.v.) injection13 a été injectées à des souris, pour étudier l’expression de l’interleukines Il6 et Ilb et la cytokine Tnfa en réponse au LPS.

LPS est un motif moléculaire micro-organismes pathogènes associés (PAMP) exprimé en un composant de paroi cellulaire de bactéries à Gram négatif, consistant en lipide A (le PAMP principal dans la structure de LPS), un oligosaccharide de noyau et un O côté chaîne14. Récepteur de type Toll 4 (TLR4) exprimé par les cellules dendritiques, les macrophages et les cellules épithéliales reconnaît LPS15, nécessitant des corécepteurs de liaison appropriée. La phase aiguë, la protéine liant le LPS (LBP) lie LPS pour former un complexe qui transfère le LPS au cluster de différenciation 14 (CD14), une protéine membranaire glycosylphosphatidylinositol-ancré. CD14 autres navettes LPS à l’antigène des lymphocytes 96 ou également connu sous le nom de MD-2, qui est associé avec le domaine extracellulaire de TLR4. La liaison du LPS à MD-2 facilite la dimérisation de TLR4/MD-2 pour induire des changements de conformation de recruter des molécules d’adapteur intracellulaire pour activer l’aval signalisation voie14, qui comprend la principale différenciation myéloïde gène de réponse 88 (MyD88) - voie dépendante et le TIR contenant du domaine adaptateur induisant l’interféron β (FTBC) - dépendant voie16. La reconnaissance du LPS par le TLR4 puis active la voie NF-κB et induit l’expression des cytokines pro-inflammatoires, telles que le TNFα, IL-6 et IL-1β17.

En particulier, lorsque le LPS est injecté dans des animaux, la concentration de LPS donné aux animaux, le bagage génétique de l’animal et le régime alimentaire doit être considérée. Des concentrations élevées de LPS conduit à un choc septique, caractérisée par une hypotension et des défaillances d’organes multiples et enfin à la mort de18. Souris sont moins sensibles aux LPS par rapport à l’homme, où les concentrations de LPS entre 2 à 4 ng/kg de poids corporel (PC) sont capables d’induire une tempête de cytokines19. Pour les souris, la dose létale (DL50), qui provoque la mort dans la moitié des gammes souris de 10 à 25 mg/kg de poids vif de20 selon la souche de souris utilisée. Pour les souches de souris couramment utilisés, C57Bl/6 et BALB/c, la dose létale 50 % (DL50) est de 10 mg/kg de poids vif. En revanche, les souches C3H/HeJ et C57BL/10ScCr sont protégés des LPS induits endotoxémie, qui est due à des mutations dans le Tlr421. En conséquence, les souris déficientes Tlr4 sont hyporéactivité à injections avec LPS22. Autres lignées de souris génétiquement modifiés, tels que les souris PARP1-/-23 sont résistantes au choc toxique induite par LPS.

Le modèle murin décrit ici utilise une dose de LPS administré systématiquement pour imiter les conséquences de la diffusion de LPS après une rupture de la barrière des surfaces du corps. La concentration choisie de LPS (2 mg/kg de poids vif) n’induit pas de mortalité chez des souris C56Bl/6, mais la libération induite par des cytokines pro-inflammatoires.

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Protocole

Souris ont été élevés et gardés sous exempts de micro-organismes pathogènes (SPF) des conditions spécifiques à l’animalerie du département de biomédecine, Université de Bâle (Bâle, Suisse). Toutes les expériences de souris ont été effectuées conformément aux règlements cantons (numéro de protocole animaux 2816 [Canton de Bâle-ville]) et fédéral suisse.

1. préparation de la Solution de LPS

  1. Ouvrez le stock de LPS purifié à partir de 0111:B4 d’Escherichia coli dans des conditions stériles et reconstituer dans l’eau à la concentration de 5 mg/mL.
  2. Diluer le stock de LPS avec la saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à la concentration du travail de 0,2 µg/µL.

2. intrapéritonéale de LPS chez la souris

  1. Aspirer les LPS en solution une seringue 0,5 mL avec une aiguille de 30 G dans un flux d’air laminaire.
  2. Peser les souris C57Bl/6 femelles (6 à 10 semaines d’âge) et de calculer le montant de LPS qui sera injecté : 10 µL (2 µg) / g corps de poids.
    NOTE : par exemple, si une souris pèse 20 g, puis 20 g x 10 µL = 200 µL LPS travaillant les besoins de la solution à doser.
  3. Manipuler la souris doucement mais fermement et immobiliser l’animal dans une main. Veiller à ce que l’animal est capable de respirer normalement, mais pas de tordre et tourner au cours de la retenue.
  4. Incliner le nez de souris légèrement vers le sol pour exposer l’abdomen pour injection. Localiser la ligne médiane de l’abdomen et l’endroit de l’injection dans le bas ventre à gauche ou à droite de la ligne médiane. I.p. PBS au lieu de LPS injecter des souris témoins.
  5. Avec la main libre, injecter le volume approprié (le volume calculé à l’étape 2.2) des LPS, solution de travail. S’assurer que l’aiguille est entrée dans la cavité péritonéale comme dans le cas contraire, mauvaise injections dans la couche musculaire abdominale peuvent se produire. Pourtant, n’allez pas trop profondément avec l’aiguille dans la cavité péritonéale pour ne pas blesser les organes intérieurs situés dans cette zone.
  6. Retourner l’animal soigneusement à la cage avec la souris jusqu'à 5 par cage.

3. surveiller les souris

  1. Surveiller les animaux au moment de l’injection et toutes les 2 h après l’injection pendant 8 h pour la fréquence et la gravité de l’endotoxémie. Par conséquent, utiliser une feuille de pointage (tableau 1) qui a été adaptée à partir d’un manuscrit précédemment publié 24.
  2. Marquer les souris injectées LPS pour les paramètres suivants énumérés au tableau 1
    1. Vérifier l’apparence de la fourrure qui est normalement lisse. Si la fourrure apparaît fourrure hérissée, hérissé ou gonflé qui indique l’inconfort ou douleur, leur score comme 1, 2 ou 3.
    2. Vérifier l’activité de la souris.
      NOTE : Souris normalement circuler librement autour de la cage toute manger, boire, escalade, mais supprimée ou restreinte l’activité pourrait être un signe de douleur.
    3. Vérifier le niveau de conscience.
      Remarque : Les souris sont très curieux et qu’ils se déplacent normalement la cage enquêter sur l’entourage. Le manque d’ou mouvement réduite peut suggérer la douleur et l’inconfort.
    4. Vérifier les yeux.
      Remarque : Les yeux pleinement ouverts sont attendus chez la souris, mais partiellement ou entièrement clos yeux, éventuellement avec sécrétion, peut être une indication de la douleur.
    5. Vérifier le taux de respiration.
      Remarque : Chez la souris ont généralement un taux de respiration normale et rapide, un taux réduit de la respiration pourrait être une indication d’inconfort).
    6. Vérifiez la qualité de la respiration.
      NOTE : Respiration difficile avec ou sans halètement est un signe de douleur.

4. prélèvement de pour l’Extraction de l’acide ribonucléique (ARN) et homogénéisation

  1. Préparer les tubes de collection/homogénéisation : ajouter 1 mL de réactif isolement de seule étape RNA à tubes de 2 mL remplie au préalable avec les sphères en céramique de 1,4 mm.
  2. Aux points de temps approprié (avant (0 h) et 2 h, 4 h et 8 h après l’injection de LPS) euthanasier la souris avec surdosage anesthésique (isoflurane) suivi d’une exsanguination et procéder à la dissection.
  3. Couper la peau et la couche musculaire, exposant ainsi la cavité abdominale avec les organes internes avec une paire de ciseaux.
  4. Soigneusement disséquer la rate, le foie et le colon, nettoyer les organes de la graisse et les conserver dans du PBS sur la glace.
  5. Découper un petit morceau (environ 0,5 cm de longueur) de chacun des organes à l’aide de ciseaux ou un scalpel.
    Remarque : Il est important de toujours prendre la pièce d’environ la même partie de l’organe dans chaque souris (même lobe d’une partie du foie, proximale et distale du côlon).
  6. Peu de temps, sécher le tissu sur un morceau de mouchoir en papier et placez-le dans le tube de collecte/homogénéisation en vous assurant qu’il est complètement immergé en réactif d’isolement ARN.
  7. Homogénéiser le tissu dans un homogénéisateur de benchtop à grande vitesse. Pour les tissus mous comme rate, le foie et le colon, utilisent 1 cycle d’homogénéisation à vitesse 6,00 pendant 30 s.
  8. Incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante.
  9. Placer soigneusement le tube dans l’azote liquide pour aimanter gel le tissu lysat. Stocker le composant logiciel enfichable congelé lysat à-80 ° C jusqu'à ce que l’ARN.

5. RNA Extraction du tissu

NOTE : RNA isolation réactifs, chloroforme et alcools sont considérés comme des matières dangereuses. Effectuer l’extraction de l’ARN sous une hotte chimique. Utilisation certifiée exempte de RNase réactifs et équipements pour maintenir un environnement exempt de RNase.

  1. Séparation de phase
    1. Décongeler le lysat de tissus congelés sur la glace.
    2. Centrifuger l’échantillon sur 1 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour granuler les particules restantes de tissus qui pourraient ne pas être.
    3. Transférer le surnageant dans un nouveau tube sans nucléase 1,5 mL.
    4. Ajouter 200 chloroforme glacée de µL par isolement 1 mL RNA réactif et agiter vigoureusement à la main pendant 10-15 s.
    5. Incuber pendant 2-3 min à température ambiante.
    6. Centrifuger à 12, 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
      Remarque : L’échantillon contient maintenant 3 phases : abaisser le rouge de phénol-chloroforme, l’interphase et la phase aqueuse incolore supérieure. L’ARN est présent dans la phase aqueuse supérieure.
    7. Recueillir la phase aqueuse supérieure (50 % du volume total) et le transfert dans un nouveau tube sans nucléase 1,5 mL.
  2. Précipitation d’ARN
    1. Ajouter 0,5 mL d’isopropanol glacée par 1 mL de réactif d’isolement RNA et mélanger doucement en retournant le tube 5 - 6 fois.
    2. Incuber pendant 10-15 min à température ambiante.
    3. Centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
      NOTE : Pellet RNA devrait être visible à ce stade.
  3. Lavage des granulés de RNA
    1. Supprimer complètement le surnageant contenant l’isopropanol sans déranger le culot.
    2. Laver le culot avec 1 mL d’éthanol 75 % glacée par 1 mL de réactif d’isolement RNA utilisé pour provoquer la lyse initiale.
    3. Vortex l’échantillon brièvement.
    4. Centrifuger l’échantillon à 7 500 (ou 12 000) x g pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Dissolution des ARN
    1. Supprimer complètement l’éthanol dans le liquide surnageant sans déranger le culot.
    2. Maintenir le tube ouvert sous la hotte chimique pendant 3-5 min sécher le culot de RNA à température ambiante (ne pas trop sécher car dans ce cas, il sera difficile de dissoudre le RNA).
    3. Dissoudre le culot de RNA dans 20 à 50 µL eau exempte de nucléase de pipetage soigneusement de haut en bas.
    4. Incuber les échantillons à 55 ° C pendant 10-15 min d’améliorer encore la solution de l’ARN.
      Remarque : À ce stade, les RNA peut être stockée à-80 ° C jusqu'à une analyse plus approfondie.

6. la digestion de l’ADN restant

  1. Mesurer la concentration en ARN avec un spectrophotomètre en pipettant également, une partie aliquote (2 µl) dans le spectrophotomètre et ajustez la concentration recommandée.
  2. Commencer la digestion de contamination ADN par max. 10 µg RNA dans l’eau sans nucléase 50 µL.
  3. Ajouter 0,1 volume de 10 x la DNase I mettre en mémoire tampon et 1 µL rDNase j’ai par exemple et mélanger doucement en pipettant également, haut et bas.
  4. Incuber à 37 ° C pendant 20-30 min.
  5. Réactif de l’Inactivation de DNase vortex et ajouter 0,1 volume de l’échantillon de mélange bien avec la pipette.
  6. Incuber 5 min à température ambiante, mêlant parfois à la main.
  7. Centrifuger à 10 000 g pendant 1,5 minutes.
  8. Transférer le surnageant contenant sans ADN ARN dans le nouveau tube d’exempte de nucléase.
  9. Mesurer la concentration d’ARN et de la qualité par le spectrophotomètre.

7. Transcription inverse

  1. Utiliser un kit de transcription inverse (RT) disponibles dans le commerce d’acide désoxyribonucléique ADNc pour la transcription inverse.
    NOTE : Ici, du jusqu'à 2 µg d’ARN peut être inversé transcrit.
  2. Calculer le volume, qui contient 2 µg RNA. Pipeter 2 µg RNA dans un nouveau tube PCR.
  3. Ajouter l’eau exempte de nucléase à l’échantillon dans le tube PCR pour le volume final de 10 µL.
  4. Préparer 2 x Master Mix en mélangeant les éléments suivants énuméré dans le tableau 2
  5. Ajouter 10 µL 2 x Master Mix à 10 µl RNA pour obtenir 1 x Master Mix du volume total de 20 µL.
  6. Fermer le tube de polymerase chain reaction (PCR) et la Centrifuger l’échantillon brièvement.
  7. Placer les échantillons dans un thermocycleur PCR et définissez les paramètres répertoriés dans le tableau 3.
  8. Stocker l’ADNc généré à-20 ° C pour une analyse ultérieure.

8. quantitative PCR (qPCR)

  1. Effectuer la réaction de qPCR avec un kit disponible dans le commerce.
  2. Se concevoir et tester les amorces couvrant intron, avant utilisation, avec différentes concentrations de cDNA de modèle. Analyser l’efficacité de l’amorce en créant une courbe standard et utiliser les amorces avec grande efficacité et des courbes de fusion correctes.
    Remarque : Les séquences des amorces utilisées dans cette expérience sont répertoriés dans le tableau 2.
  3. Préparer la réaction en chaîne (qPCR) polymérase quantitative dans la plaque 384 puits avec l’installation de la réaction décrite dans le tableau 4.
  4. Garder toutes les solutions et la plaque sur la glace à l’aide de papier d’aluminium pour empêcher le plat se mouiller lorsque le mélange réactionnel est préparé.
  5. Effectuer toutes les réactions en géométrie.
  6. Effectuer la réaction de PCR sur un thermocycleur en utilisant le paramètre répertorié dans le tableau 5.
  7. Calculer la valeur moyenne de Ct pour toutes les réactions de la géométrie. Normaliser tous les gènes cibles pour le niveau d’expression de la glycerinealdehyde-3-phosphate-déshydrogénase (Gapdh) gène de ménage en calculant 2^(-ΔCt).
    Remarque : Tous les gènes cibles avec le Ct moyen > 35 ont été considéré comme étant sous la limite de détection.

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Résultats

Pour simuler les conséquences pour l’hôte après l’entrée des bactéries ou des produits d’origine bactérienne qui se produit après la rupture de la barrière intestinale, LPS a été injecté à des souris C57Bl/6 en une dose (2 µg/g de poids corporel). Chaque souris a été surveillée et orchestrée pour l’occurrence de l’endotoxémie avec paramètres énumérés dans la feuille de pointage qui comprend, l’apparition des souris, l’activité des animaux, la condition des yeux et le taux de respiration e...

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Discussion

Ce protocole imite des processus immunologiques qui se produisent après l’invasion de produits d’origine microbienne. Étapes critiques au sein du protocole sont la sélection de la lignée de souris, l’état d’hygiène des souris, la dose de LPS, la surveillance des animaux pour l’occurrence de l’endotoxémie et le point dans le temps de la fin de l’expérience. Plus important encore, le bagage génétique de la souche de souris doit être considérée. Souches de souris différents ont une sensibilité différente au LPS. Par exemple...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Patrick est pris en charge par la Fondation National Suisse (FNS 310030_146290).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-UnisK1081
Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité,Applied Biosystems, Foster City, CA, États-Unis4368813
Ensemble de DNase sans RNase,Qiagen, Hilden, Allemagne79254
LPS Escherichia coli O111 :B4Invivogen, San Diego, CA, États-Unis.tlrl-eblps
Omnican 50 Seringue à insuline à usage uniqueB. Braun Melsungen, Melsungen, Allemagne9151125
Bioanalyseur 2100Agilent Technologie, Santa Clara, États-Unissans objet
Centrifugeuse 5430Eppendorf, Hambourg, Allemagnesans objet
Centrifugeuse Mikro 220RHettich, Kirchlengern, Allemagnesans objet
Outils de dissectionAesculap, Tuttlingen, Allemagnenon applicable
Système de préparation d’échantillons Fast-Prep-24 5GM.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, États-Unisnon applicable
NanoDrop ND-1000NanoDrop Products, Wilmington, DE, États-Unisnon applicable
Réactif TRIZymo Research, Irvine, CA,États-Unis R2050-1

Références

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Réimpressions et autorisations

Erratum


Formal Correction: Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach
Posted by JoVE Editors on 8/04/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

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Katarina Raduolovic

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Katarina Radulovic

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Injections de lipopolysaccharides dans souris pour imiter l’entrée des produits d’origine microbienne après rupture de la barrière intestinale
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