Article de méthode

Ultra basse génome d’entrée séquençage bibliothèque préparation à partir d’un seul spécimen Tardigrade

DOI :

10.3791/57615

⸱

15 juillet 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Advanced Biosciences, Keio University, 2Systems Biology Program, Graduate School of Media and Governance, Keio University, 3Faculty of Environment and Information Studies, Keio University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Contamination pendant le séquençage génomique des organismes microscopiques demeure un grand problème. Ici, nous montrons une méthode pour séquencer le génome d’un tardigrade un seul spécimen avec aussi peu que 50 pg d’ADN génomique sans amplification du génome entier pour minimiser le risque de contamination.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tardigrades sont des animaux microscopiques qui entrent dans un état d’ametábolos appelé anhydrobiose face à la dessiccation et peuvent revenir à leur état d’origine lorsque l’eau est fournie. Le séquençage génomique des animaux microscopiques tels que la contamination bactérienne de risques tardigrades qui conduit parfois à des interprétations erronées, par exemple, au sujet de l’étendue du transfert horizontal de gènes chez ces animaux. Ici, nous fournissons une méthode d’entrée ultra basse pour séquencer le génome du tardigrade, Hypsibius dujardini, un seul spécimen. En employant l’exclusion de lavage et contaminant rigoureuse avec une extraction efficace de 50 ~ 200 pg d’ADN génomique d’un seul individu, nous avons construit une bibliothèque séquencée avec un instrument de séquençage de l’ADN. Ces bibliothèques ont été hautement reproductible et impartiale, et une analyse informatique des lectures séquencés avec autres génomes H. dujardini a montré une quantité minime de contamination. Cette méthode peut être appliquée à des tardigrades impossibles qui ne pourraient pas être séquencés à l’aide des méthodes précédentes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tardigrades sont des animaux microscopiques peuvent entrer dans un état d’ametábolos appelé anhydrobiose, face à la dessiccation. Ils récupèrent de l’absorption de l’eau1,2. Dans l’état d’ametábolos, les tardigrades sont capables de tolérer des divers environnements extrêmes, incluent des températures extrêmes pressions et3 4,5, une dose élevée de lumière ultraviolette6, rayons x et rayons gamma 7 , 8et9de l’espace cosmique. Données génomiques sont un fondement indispensable pour l’étude des mécanismes moléculaires d’anhydrobiose.

Les tentatives précédentes pour séquencer le génome de tardigrades ont montré des signes de contamination bactérienne10,11,12,13,14. Séquençage génomique de ces petits organismes nécessite un grand nombre d’animaux et est sujets à une contamination bactérienne ; donc, nous avons déjà établi un protocole de séquençage en utilisant une méthode de saisie ultra basse à partir d’un seul spécimen de tardigrade, pour minimiser les risques de contaminations15. En utilisant ces données, nous avons effectué davantage une renumérotation de haute qualité et le remontage du génome de H. dujardini16,17. Ici, nous décrivons en détail cette méthode de séquençage génomique d’un seul individu tardigrade ()Figure 1). La validation de cette méthode de séquençage est au-delà de l’objectif de ce document et a déjà été abondamment discutée dans notre précédent rapport16.

Cette méthode se compose de deux parties : l’isolement d’un tardigrade unique avec le plus bas possible de la contamination et l’extraction de la qualité des niveaux du pictogramme de l’ADN. Le tardigrade est affamé et rincée avec l’eau, mais aussi des antibiotiques et observé au microscope avec un grossissement de X 500 à garantir l’élimination de toute contamination bactérienne. Les mesures et les estimations précédentes montrent qu’un seul individu de tardigrade contienne environ 50-200 pg de génomique DNA16, qui en est extraite par craquage de l’exosquelette de chitine par cycles de gel-dégel ou par homogénéisation manuelle. Cet ADN génomique est soumis à la construction de la bibliothèque et séquencé sur un instrument de séquençage de l’ADN. Une analyse informatique supplémentaire montre séquençage de haute qualité, mais aussi de faibles niveaux de contamination par rapport aux précédents projets de séquençage tardigrade.

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Protocole

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1. préparation

  1. Préparer un gel d’agarose de 2 % avec de l’eau distillée (DW) comme solvant dans une boîte de Petri en plastique de 90 mm et 10 mL d’un cocktail avec DW 1 % pénicilline/streptomycine. Le gel peut être conservé pendant 2 à 3 semaines dans un incubateur à 18 ° C.
    NOTE : Éviter tout stockage du gel inférieures à 10 ° C, pour la basse température va diminuer le gel d’agarose, résultant dans un espace minuscule entre le gel et le mur plat de culture dans laquelle les tardigrades peuvent être pris au piège.

2. préparation des échantillons et Exclusion de Contaminant

  1. Recueillir un tardigrade unique, placez-le sur la gélose préparés et laver 2 x - 3 x avec DW pour éliminer les particules restantes.
  2. Incuber le tardigrade à 18-22 ° C pendant 24 h pour enlever tout excès de nourriture des intestins.
  3. Placez le tardigrade affamée en antibiotiques pénicilline/streptomycine pour 2 à 6 h enlever toute contamination bactérienne et de placer l’animal décontaminé sur un verre de lame propre à l’aide d’une pipette de P10.
  4. Observez le tardigrade au microscope au grossissement de X 500 et confirmer qu’il n’y a pas de bactéries restantes.
    Remarque : Le fort grossissement avec un stéréomicroscope est optimal, mais un microscope optique peut être utilisé alternativement sans appliquer un lamelle couvre-objet.
  5. Recueillir l’individu à l’aide d’une pipette de P10 avec un maximum de 5 µL de liquide, placez-le dans un tube à faible liaison polymérase chain reaction (PCR) et enlever le liquide en excès autant que possible.
    Remarque : Les microtubes, tubes PCR et des pointes de pipette doivent tous être faible liaison pour minimiser la perte de l’ADN.
    Remarque : Effectuer une homogénéisation dès que possible, à la dessiccation rapide ou mort de l’animal peut endommager considérablement de l’ADN génomique.

3. l’homogénéisation et l’Extraction d’ADN

  1. Homogénéiser l’animal pour obtenir son ADN génomique (ADNg) avec l’une des méthodes suivantes.
    Remarque : Il est essentiel d’utiliser le kit spécifié montré dans la Table des matières dans les étapes d’extraction ADN suivantes, pour les autres kits (soit colonne et perle basé) ne sont pas efficaces à cette entrée extrêmement faible. Le tampon de lyse génomique a été livré avec 0,5 % bêta-mercaptoéthanol avant de l’utiliser.
    1. Homogénéiser l’animal avec des cycles de gel-dégel,18.
      1. Immédiatement après étape 2.5, ajouter 100 µL de tampon de lyse dans le tube PCR contenant le tardigrade.
      2. Placer le tube PCR dans l’azote liquide pendant 10 min et, pendant 10 min, déplacer vers un bloc chauffant chauffé à 37 ° C. Répétez cette étape 2 x.
        Remarque : Cette étape peut être répétée lorsque l’homogénéisation ne suffit pas ou peut être réalisée après le broyage manuel.
    2. Manuellement, écraser l’animal.
      1. Immédiatement après l’étape 2.5, sous un stéréomicroscope, écraser l’individu avec la pointe de P10 de la pipette en appuyant sur l’animal contre la paroi du tube PCR et immédiatement ajouter 100 µL de tampon de lyse.
        Remarque : Il est essentiel de respecter cette procédure sous un stéréomicroscope, parce que le tardigrade peut facilement éclipser et inefficace de concassage se traduira par un échec pour extraire l’ADNg. Assurez-vous que la cuticule tardigrade est cassée afin que le tampon de lyse peut s’infiltrer dans l’organisme.
  2. Incuber le tube pendant 30 min à température ambiante pour la lyse de se produire.
    Remarque : Il faut un minimum de 30 min pour une lyse efficace, mais l’incubation peut être plus longue.
  3. Transférer le volume complet (100 µL) du mélange lyse à un microtube de liaison faible propre 1,5 mL.
  4. Ajouter 100 µL de tampon de lyse dans le tube PCR de liaison faible qui a été utilisé pour l’homogénéisation et est maintenant vide et après avoir effectué le mélange, transférez-le à faible liaison microtube 1,5 mL utilisé à l’étape 3.3. Répétez cette étape 2 x.
  5. Comme à l’étape 3.4, ajouter 300 µL de tampon de lyse dans le tube PCR de liaison faible, et, après avoir effectué, passer le mélange à basse-liaison microtube 1,5 mL. Microtube 1,5 mL faible liaison doit contenir 600 µL du mélange après cette étape.
    Remarque : Ces étapes sont pour minimiser la perte de l’ADNg lié à la paroi du tube PCR, en lavant l’échantillon plusieurs fois.
  6. Additionnez le total de 600 µL du mélange de la lyse de la colonne placée dans un tube de prélèvement et il centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min.
  7. Réappliquez le débit à travers la colonne et il centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min.
    Remarque : Cette étape est essentielle pour assurer que la majeure partie de l’ADNg est lié à la colonne.
  8. Ajouter 500 µL de tampon de lavage à la colonne et il centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min. transfert de la colonne à un microtube 1,5 mL propre.
  9. Appliquer 20 µL de 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, à la colonne, attendre 5 min à température ambiante et il centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min.
    Remarque : La mémoire tampon d’élution ne doit pas contenir de EDTA, car il interfère avec les enzymes de préparation de bibliothèque.
  10. Ré-appliquez le flux par le biais de la colonne et après 5 min d’incubation à température ambiante, il Centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g.
    Remarque : Cette étape est essentielle pour assurer l’élution maximale de l’ADNg lié à la colonne.

4. Bibliothèque Construction séquence

  1. Fragmentation de l’ADN
    1. Transférer 15 µL de l’éluant ADNg dans un microtube 15 µL de fragmentation de l’ADN et centrifuger le tube pendant 1 min à l’aide d’une micro-centrifugeuse sur table.
      Remarque : Le microtube spécifié indiqué dans la Table des matières est optimal pour un apport réduit. La fragmentation avec faible volume sonication est essentielle, et cela ne peut pas être substitué par fragmentation enzymatique en raison de la très faible concentration d’ADN.
    2. Fragmenter l’ADNg à 550 bp.
      Remarque : Les paramètres bp 550, nous avons utilisé sont comme suit : puissance incidente de crête = 30 W, facteur d’utilisation = 20 %, cycles par burst = 50, durée du traitement = 23 s.
    3. Après une minutieuse pipetage, transférer 10 µL du mélange ADN fragmenté dans un tube PCR de propre liaison faible.
      NOTE : L’expérience peut être arrêtée ici. Préserver l’ADN à 4 ° C ou -20 ° C.
  2. Séquence de construction de bibliothèque
    Remarque : Il est absolument essentiel d’utiliser le kit spécifié dans la Table des matières dans les procédures suivantes, en raison de la faible quantité d’ADN d’entrée.
    1. Ajouter 2 µL de tampon modèle préparation et 1 µL de l’enzyme de préparation modèle et mélanger soigneusement avec une pipette.
    2. Effectuer la réaction de préparation de modèle sur un thermocycleur dans les conditions suivantes : 22 ° C pendant 25 minutes, 55 ° C pendant 20 min, attente de 4 ° C et un couvercle chauffé à 101-105 ° C. Une fois que la réaction est terminée, passez à l’étape suivante.
    3. Ajouter 1 µL de la mémoire tampon de synthèse Bibliothèque et 1 µL de l’enzyme de synthèse de bibliothèque pour le produit de réaction de préparation modèle et incuber le mélange à 22 ° C pendant 40 min (avec une cale de 4 ° C). Une fois que la réaction est terminée, passez à l’étape suivante.
    4. Ajouter 30 µL de bibliothèque amplification master mix (25 µL de la mémoire tampon l’amplification dans la bibliothèque, 1 µL de l’enzyme d’amplification de bibliothèque et 4 µL d’eau exempte de nucléase) et 5 µL de réactif d’indexation.
    5. Mélanger le tout soigneusement avec une pipette et centrifuger le mélange brièvement avec une centrifugeuse de table.
    6. Effectuer un PCR avec les conditions indiquées au tableau 1.
TempératureTempsCycles
72 ° C3 minutes
85 ° C2 minutes
98 ° C2 minutes
98 ° C20 secondes4 cycles
67 ° C20 secondes
72 ° C40 secondes
98 ° C20 secondes16 cycles
72 ° C50 secondes
4 ° CMaintenez

Tableau 1 : Conditions PCR.

  1. Purification des produits PCR
    Remarque : Cette étape peut être substituée avec d’autres méthodes de purification. Si une méthode alternative est utilisée, assurez-vous de vérifier la pureté de l’ADN résultant à l’aide d’un spectrophotomètre. Ratios d’absorbance de 260/280 et 260/230 doivent tous deux être au-dessus de 1,8.
    1. Ajouter 50 µL de billes magnétiques, déposer de la solution 10 x et il a centrifuger brièvement avec une micro-centrifugeuse sur table.
    2. Incuber la solution pendant 2 min à température ambiante.
    3. Il incuber sur un support magnétique pendant 5 min ou jusqu'à ce que la solution devienne complètement clair et éliminer le surnageant.
    4. Ajouter 200 µL d’éthanol à 80 % fraîchement préparés dans le tube PCR de liaison faible sur un support magnétique, attendre 30 s, puis enlever le surnageant. Répétez cette étape 2 x. Ne pas déranger les perles.
    5. En bref, centrifuger le tube de PCR de liaison faible avec une centrifugeuse de table et enlever tout excès d’éthanol sur le support magnétique. Sécher les perles mais éviter un séchage excessif.
    6. Remettre en suspension les perles avec 15 µL de 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, soigneusement déposer la solution afin que les billes magnétiques sont distribués de façon homogène, incuber le tube pendant 2 min à température ambiante et après une brève centrifugation, il incuber sur un support magnétique pour 2 min, jusqu'à ce que la solution est claire.
      Remarque : La mémoire tampon d’élution ne doit pas contenir de EDTA, car il interfère avec la chimie de séquençage.
    7. Transférer le surnageant, sans déranger le culot, dans un nouveau tube PCR de liaison faible.
      NOTE : L’expérience peut être arrêtée ici. Préserver l’ADN à 4 ° C ou à-20 ° C pour le stockage de longue durée.

5. quality Check, la Quantification et la séquence de l’ADN

Remarque : La vérification de qualité n’est pas effectuée avant cette mesure en raison de la faible quantité d’ADN.

  1. Validation de la distribution de taille de bibliothèque ADN
    Remarque : Les autres systèmes d’électrophorèse en haute sensibilité avec un rapport numérique de la distribution peuvent être utilisés.
    1. Retourner le réactif de tampon d’électrophorèse et gel cartouche (25-1 000 bp dans la gamme) à température ambiante.
    2. Ajouter 3 µL de réactif de tampon d’électrophorèse avec 1 µL de la bibliothèque de séquençage et mélangez-les soigneusement pendant 1 min avec un vortex et les centrifuger brièvement avec une centrifugeuse de table.
    3. Procéder à l’électrophorèse et valider la granulométrie de bibliothèque avec le logiciel associé. Le pic principal fragment doit être largement allant d’environ 300 à 1 000 bp.
  2. Quantification de l’ADN
    Remarque : Autres méthodes axées sur la fluorescence ou la PCR quantitative peut également être utilisé, mais spectrophotométrie devrait être évitée, car il n’est pas assez précis pour quantifier les bibliothèques de séquençage.
    1. Ajouter 796 µL de solution tampon et 4 µL de réactif fluorescent et mélangez-les soigneusement. Diluer 190 µL de la solution de travail à deux tubes de dosage avec 197 µL à un tube d’essai.
    2. Ajouter 10 µL de normes avec des concentrations connues de l’ADN de chaque tube à essai contenant 190 µL de la solution de travail et 3 µL de la bibliothèque de prête dans le tube de dosage contenant 197 µL de la solution de travail.
    3. Vortex les tubes brièvement et centrifuger à eux sur une centrifugeuse de table. Quantifier l’ADN à l’aide d’un fluorimètre avec réglages 3 µL.
  3. Séquence de bibliothèque d’ADN
    Remarque : La plate-forme de séquençage doit être compatible avec le kit de construction de la bibliothèque spécifiée.
    1. Préparer la bibliothèque de séquençage basée sur le protocole du fabricant.
    2. La valeur de la cellule de cassette et le débit du réactif dans l’instrument de séquençage et entrez le séquençage, exécutez informations suivant le protocole du fabricant.
    3. Exécutez le séquençage.
      NOTE : Nous avons mené deux séries de séquençage : un échantillon/exécuter, ainsi que quatre échantillons multiplexés en un seul passage.

6. calcul analyse

  1. Base-appel et, le cas échéant, démultiplexer les lectures.
  2. Valider la qualité des données de séquence avec FastQC19.
    Remarque : Pour une validation plus approfondie des données obtenues, consultez notre précédent rapport16.

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Résultats

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Exclusion de contaminant :

Ce protocole implique un lavage complet de la Tardigrada et une stérilisation avec un traitement d’antibiotiques pour minimiser la contamination. Elle comporte également un processus de vérification visuel pour s’assurer de la conformité de ces processus. Une image microscopique faite lors de la validation (étape 2.4 du protocole) est illustrée à la Figure 2

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La contamination bactérienne constitue une menace pour le séquençage génomique des organismes microscopiques. Alors que des études antérieures sur le séquençage du génome tardigrade ont filtré de contamination en utilisant une vaste informatique méthodes12,20, ils ont séquencé le génome d’un seul individu pour minimiser les risques de contaminations. Comme un tardigrade individuel contient environ 50-200 pg d’ADN génomique16 et soit revêtu...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Nozomi Abe, Yuki Takai et Nahoko Ishii pour leur soutien technique dans le séquençage génomique. Ce travail a été soutenu par la subvention pour la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) Research Fellow, KAKENHI subvention des jeunes scientifiques (No.22681029) et KAKENHI subvention pour la recherche scientifique (B), n° 17 H 03620 de la JSPS, par un Subventions pour projets de recherche base scientifique de la Fondation Sumitomo (No.140340) et en partie par le Fonds de recherche du gouvernement Yamagata de la préfecture et ville de Tsuruoka, Japon. Chlorella vulgaris utilisé pour nourrir les tardigrades était une gracieuseté de Chlorella Industry Co. Ltd.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope SZ61OLYMPUS
BactoAgarDifco Laboratories214010
Pénicilline Streptomycine (10 000 U/mL)Gibco by life technologies15140-148
VHX-5000 SystemKeyence
0.2mL Tube de revêtement en siliconeBio Medical ScienceBC-bmb20200
Quick-DNA Kit de micropréparationZYMO ResearchD3021L’utilisation de ce kit est absolument critique ; voir étape 3.1
Granulomètre à microtubes de 1,5 mLbio-one616-201Voir 4.1.1
Microcentrifugeuse réfrigérée à haute vitesseTOMYMX-307
Covaris M220Covaris Inc.
Kit ThruPLEX DNA-SeqRubicon GenomicsCAT. NO. R400406L’utilisation de ce kit est absolument critique ; voir étape 4.2
ThermocycleurBioer TechnologyTC-96GHbC
Réactif AMPure XPBECKMAN COULTER Life ScienceA63881
ÉthanolWako054-027335
Tampon EBQIAGEN19086
2200 TapeStationAgilentG2965AA
D1000 RéactifsAgilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
Qubit dsDNA BR Tampon/RéactifThermoFisher ScientificQ32850
Cubee Mini-CentrifugeRecenttecGenereachR5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3Illumina Inc.MS-102-3003
Séquenceur MiSeqIllumina Inc.SY-410-1003
4482277

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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