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Article de méthode

Murine colostomie distale, un nouveau modèle de colite détournement chez les souris C57BL/6

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DOI :

10.3791/57616

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12 juillet 2018

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1Department of General Surgery, Visceral, Thoracic and Vascular Surgery, Universitätsmedizin Greifswald, 2Institute of Pathology, Universitätsmedizin Greifswald

Dans cet article

Résumé

Colostomie distale murin fournit un modèle murin pour la colite détournement humaine, une colite lymphocytaire principalement dans le segment du côlon exclus du flux de matières fécal.

Résumé

Colite de dérivation (DC) est une condition clinique fréquente survenant chez les patients avec des segments d’intestin exclus du flux fécal par suite d’une entérostomie détourner. L’étiologie de cette maladie reste mal définie mais semble différer de celle des maladies classiques inflammatoires de l’intestin comme la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. Recherches visant à décrypter les mécanismes physiopathologiques menant au développement de cette maladie a été gravement entravée par l’absence d’un modèle murin approprié. Ce protocole génère un modèle murin de DC qui facilite l’étude du rôle du système immunitaire et son interaction avec le microbiome dans le développement de DC. Dans ce modèle à l’aide de C57BL/6 animaux, parties distales du côlon sont exclus du flux de matières fécal en créant une colostomie distale, en déclenchant le développement de légère à modérée de l’inflammation dans les segments de l’intestin exclus et en reproduisant les lésions de la marque distinctive de l’homme DC avec une réponse inflammatoire systémique modérée. Contrairement au modèle de rat, il existe un grand nombre de modèles murins génétiquement modifié sur le fond de C57BL/6. La combinaison de ces animaux avec notre modèle permet les rôles possibles de différentes cytokines, chimiokines ou récepteurs de molécules bioactives (p. ex., interleukine (IL) -17 ; Il-10, chemokine CXCL13, récepteurs de chimiokines CXCR5 et CCR7 et le récepteur de la sphingosine-1-phosphate 4) à évaluer dans la pathogenèse de la DC. La disponibilité de souches congéniques de souris C57BL/6 antécédents facilite grandement les expériences de transfert afin d’établir les rôles de types cellulaires distincts impliqués dans l’étiologie du DC. Enfin, le modèle offre la possibilité d’évaluer l’influence des interventions locales (p. ex., modification du microbiome local ou un traitement anti-inflammatoire local) sur l’immunité mucosale dans les segments concernés et non concernés de l’intestin et le sur homéostasie immunitaire systémique.

Introduction

Ces dernières années, un nombre important d’entités non infectieuses colite différents de maladies inflammatoires de l’intestin classique (DBI ; i.e., ulcéreuse ou colite de Crohn) ont été caractérisés sur le plan clinique et histopathologique chez l’homme. Les mécanismes physiopathologiques menant au développement de ces formes de colite ne sont pas complètement compris partiellement parce que les modèles animaux appropriés sont rares. Colite de détournement est une de ces entités récemment décrites. Bien que le terme a été inventé en 1980 par Glotzer1, la description initiale d’un phénotype similaire a été donnée en 1972 par Morson2. La maladie se développe dans 50 % à 91 % des patients atteints de détourner entérostomie et son intensité clinique varie de3,4. Compte tenu de l’incidence annuelle d’environ 120 000 patients de colostomie dans les États-Unis d’Amérique, cette entité maladie constitue un problème de santé important.

L’objectif général du développement de ce protocole devait fournir un modèle murin de DC qui repose sur un déclencheur de colite similaire à celui observé chez l’humain DC et qui reprend les principales caractéristiques histopathologiques de la maladie humaine. Contrairement aux autres modèles murins de la colite, induction de colite dans notre modèle ne nécessite pas d’animaux génétiquement modifiés (par exemple, les souris transgéniques IL-7, N-cadhérine dominant négatifs souris ou souris- / - de TGFβ), l’application de chimiquement irritant des substances (p. ex., dextran sulfate sodium (DSS) - colite induite ou trinitrobenzène sulfonique (TNBS) - induced colitis), ou le transfert de populations de cellules spécifiques chez les souris déficientes immunitaires (comme dans le transfert dehaute CD45RB modèle de colite) (pour un compte-rendu, voir5). Contrairement aux autres modèles, le système immunitaire intact de notre modèle DC permet d’évaluer le mécanisme immunologique impliqués dans le développement de DC. La limitation de l’inflammation des muqueuses au segment exclus de l’intestin permet d’évaluer sa répercussion sur l’immunité mucosale dans d’autres parties du tractus gastro-intestinal, sur l’homéostasie immunitaire dans les autres compartiments immunitaires du tractus intestinal (par exemple , Mesenteriale ganglions lymphatiques et des patchs de Peyer) et sur l’homéostasie immunitaire de l’organisme tout entier. Enfin, notre modèle constitue un outil approprié pour étudier les mécanismes qui contrôlent les stimuli inflammatoires locales provenant de changements dans l’environnement local normal pour le microbiome local tant que les antigènes alimentaires.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’autorité vétérinaire (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, LALLF M-V).

1. préopératoire soins et préparation de l’Animal

  1. À son arrivée à l’animalerie, divise les animaux (C57Bl/6) en groupes de taille similaire, chaque groupe en cage ensemble et maintenir les groupes constante au cours des expériences.
    Remarque : Utilisez des animaux du même sexe. Les résultats présentés ont été obtenus avec des souris mâles.
    Remarque : Si les animaux mâles sont utilisés, les groupes de cage à partir ensemble lorsqu’ils sont âgés de 7 semaines afin qu’une hiérarchie peut être établie, ce qui minimise le risque d’un comportement agressif au cours d’expériences.
  2. Au moins une semaine avant la chirurgie, passer à une énergie élevée (> 14 MJ/kg) et riche en protéines (> 20 %) contenant tous les oligo-éléments et les vitamines d’alimentation (pour plus de détails, voir la liste des matériaux).
    NOTE : S’assurer toutes les souris peser au moins 25 g lorsque la chirurgie est pratiquée.
  3. Induire l’anesthésie et analgésie par injection intrapéritonéale de kétamine (i.p. 87 mg/kg) et de xylazine (i.p. de 13 mg/kg). Attendez que la souris tolère une stimulation mécanique, p. ex. orteil pitch, sans réponse motrice.
  4. Fixez la souris narcotisée avec bandes en position couchée sur une sous-couche de chaleur placée à la réception de l’opération, garantissant le positionnement au cours de l’opération stable et en évitant une très grande perte de chaleur corporelle.
    Remarque : La sous-couche de chaleur doit avoir une température de 36 ° C à 40 ° C ; la température de la salle d’opération doit être de 21 ° C.

2. opération de colostomie distale

  1. Se raser les cheveux abdominaux. Avant de commencer la chirurgie, désinfecter le champ de l’opération trois fois avec de l’alcool 70 % et un iodophore. Drapez le champ d’opération afin de garantir des conditions d’asepsie.
  2. Effectuer une laparotomie médiane de 15 mm par incision des muscles abdominaux et le péritoine le long de la linea alba, minimisant ainsi les pertes sanguines.
  3. Utiliser deux pinces atraumatiques de DeBakey, retirez avec précaution le caecum, l’iléon terminal et ascendant et côlon transverse de la cavité péritonéale.
    Remarque : Veillez à limiter strictement la manipulation mécanique de l’intestin pour prévenir les blessures aux structures mésentériques.
  4. Identifier le pôle caecum, le côlon ascendant et l’intestin grêle (Figures 1 a et 1 b).
    Remarque : Une identification correcte du côlon ascendant est fondamentale pour la mise en place correcte de la colostomie. Dans les cas où l’anatomie de la région iléo-caecale est ambiguë, la présence de plaques de Peyer identifie l’intestin grêle, et la présence de selles formées caractérise le côlon.
  5. Utilisez une règle pour déterminer la position de la colostomie future. Il doit être placé 20 mm distal de la valve iléo-caecale pour une colostomie distale.
  6. Pratiquez une seconde incision de 3 mm de la paroi abdominale dans le quadrant supérieur droit. Tirez sur le segment du côlon précédemment identifiés par cette incision pour former une boucle, en veillant à ne pas fausser la boucle.
  7. Soigneusement passer une canule de calibre 22 i.v. souple par le biais du mesocolon. Prendre soin de ne pas pour endommager les structures vasculaires mésentériques.
  8. Retourner l’intestin dans la cavité péritonéale.
  9. Fixer les deux extrémités du tube flexible pour la peau à l’aide de points simples et une suture résorbable (p. ex., polyglactine 910 ou polyfil 4-0 1/2C).
  10. Avant de fermer la laparotomie, effectuer la réanimation liquidienne, à l’aide d’une injection intrapéritonéale de solution saline à 0,9 % 0,5 mL.
  11. Fermer le péritoine et la couche musculaire avec une suture continue à l’aide d’une suture résorbable (p. ex., polyglactine 910 ou polyfil 4-0 1/2C). Fermer la peau avec une suture continue à l’aide d’une suture résorbable (polyglactine 910 ou polyfil 4-0 1/2C).
  12. Ouvrir la boucle du côlon extériorisés en effectuant une transection sous-total à l’aide de ciseaux fine. Éviter toute blessure du mésentère. Transect pas complètement le côlon.
  13. Difficulté à chaque ouverture de colostomie à l’aide de trois points de pleine épaisseur unique pour le péritoine et la peau en utilisant un monofil résorbable (p. ex., le polydioxanone ou monofil 6-0 3/8 s). La boucle afférente, qui est une fin-colostomie fonctionnelle, et la boucle efférente, qui est une fistule mucuse, sont clairement séparées à ce stade (Figure 1C).
    Remarque : Les temps de fonctionnement doit être moins de 20 minutes pour limiter les pertes de fluides et thermiques.
  14. Après finition chirurgie, désinfecter les instruments utilisant une solution de désinfection aldéhyde dans un bain à ultrasons conformément aux instructions du fabricant.

3. sham opération (Colotomy)

  1. Effectuez les étapes 1.1. par le biais de 2.4.
  2. Utilisez une règle pour déterminer la position de la future colotomy. Le colotomy doit être placé à la même distance de la valve iléo-caecale que la colostomie dans le groupe expérimental.
  3. Ouvrez les deux points au moins deux-tiers sa circonférence à l’aide des ciseaux.
  4. Fermer la colotomy avec une seule couche, pleine épaisseur interrompu suture utilisant une suture résorbable monofil (p. ex., le polydioxanone, monofil 6-0 3/8 s).
    Remarque : La durée de fonctionnement doit être moins de 20 minutes pour un chirurgien expérimenté, limitant les pertes de fluides et thermiques.
  5. Effectuez les étapes 2.10. , 2.11. et 2.14.

4. postopératoire soins

  1. Retour animaux de leurs cages. Offrent une atmosphère bien tempérée de 37 ° C (par exemple, avec une lampe à infrarouge) jusqu'à ce que les souris sont tout à fait réveillés. Puis, continuez à souris dans un environnement réglementé de température et d’humidité (21 ° C, humidité relative de 30 % ± 10 %). Permettre un accès libre à la nourriture et l’eau potable. Pour faciliter l’absorption de liquide, fournissent des aliments pour animaux imbibées d’eau supplémentaires.
  2. Commencer l’analgésie postopératoire par l’injection de corps de 0,1 mg/kg poids buprénorphine s.c. lorsque les animaux de la réponse à la stimulation mécanique. Soyez prudent afin d’éviter une dépression respiratoire.
  3. Supplément eau potable avec 1 mg/mL tramadol pour l’analgésie continue durant la première semaine post-opératoire.
  4. Pour compenser une diminution apport liquidien due à mobilité réduite, fournir une plateforme de boire solide dans la cage pendant la première semaine post-opératoire.
  5. Peser les animaux et le score de comportement animal tous les jours pendant la première semaine, tous les deux jours pendant le reste du premier mois et tous les trois jours au cours du deuxième mois en utilisant le score de gravité de la maladie décrit dans Kleinwort et al. 6.

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Résultats

La chirurgie est bien tolérée tant expérimental (colostomie) et groupes d’imposture (colotomy). La mortalité péri-opératoire ne doit pas dépasser 10 % lorsque la chirurgie et périopératoires sont correctement gérées. Dans la première semaine post-opératoire, perte de poids significative est vu dans les deux groupes expérimentaux et sham. Animaux du groupe fictif atteindre leur nadir poids habituellement vers le quatrième jour postopératoire, mais il se produit un jour plus tard dans le gr...

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Discussion

Le modèle murin de DC présentée dans le présent protocole fiable reproduit les caractéristiques histopathologiques des DC humaine (p. ex., développement de novo des follicules lymphoïdes dans la sous-muqueuse des segments de l’inflammation de l’intestin, crypte raccourcissement et réductions nombre de cellules caliciformes). En dehors de cet avantage, ce modèle est induit par un facteur de déclenchement très similaire et présente une évolution clinique modérée à gravité légère comme c’est le cas chez le...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériel de fonctionnement
heat sous-couche, 6 wattsThermoLux, Witte + Sutor GmbH461265
Éthanol 70 % (avec méthyléthylcéton)Pharmacie de l’hôpital universitaire de Greifswald
Applicateurs en bois, petite tête en coton unilatérale, bâton en bois, longueur 150 mmCentramed GmbH, Allemagne8308370pour la désinfection du champ d’opération
CiseauxAesculap (BRAUN)BC064R
Pince Atraumatique DeBakeyAesculap (BRAUN)OC021R
Porte-aiguilleAesculap (BRAUN)BM012R
Vasofix Safety i.v. canule 22GBraun Melsungen AG, Allemagne4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet tressé ; V-5 17 m 1/2c ; 70 cmETHICON, Inc.
monofil PDS II 6-0 ; V-18 13 mm 3/8c ; 70 cmETHICON, Inc.Z991H
BD Plastipak 1 mL (Seringues avec aiguille avec intérieur stérile)BD Medical305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin)ANTISEPTICA, Allemagne18824-01désinfection des instruments chirurgicaux dans le bain à ultrasons
Médicaments
kétamine 10 %, 100 mg/mL (chlorhydrate de kétamine)selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH9089.01.0087 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (chlorhydrate de xylazine)selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH400300.00.0013 mg/kg i.p.
NaCl 0,9 %Braun Melsungen AG, Allemagne6697366.00.00
Buprenovet 0,3 mg/mL (buprénorphine)Bayer, AllemagnePZN : 014988700,1 mg/kg s.c.
Tramal Gouttes, 100 mg/mL (chlorhydrate de tramadol)Grü ; nenthal GmbH, Allemagne101168381 mg/mL d’eau potable
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  ;Cephasaar GmbH, AllemagnePZN : 0884425225 mg/kg de poids corporel i.p.
metronidazole 5 mg/mLBraun Melsungen AG, AllemagnePZN : 0554351512,5 mg/kg de poids corporel i.p.
>Food
ssniff M-Z Ereichssniff, Allemagne  ; V1184-3
Boisson Solide Dehyprev Vit BIO, sachetsTripleATrading, Pays-BasSDSHPV-75
Équipement
Nikon Eclipse Ci-LNikon Instruments Europe BV, AllemagneMicroscopie
optique VetScan HM 5  ;Abaxis, USA770-9000Analyseur d’hématologie vétérinaire de 50 µ ; l sang EDTA veineux
Bandelin SONOREX (Bain à ultrasons)Bandelin electronics, AllemagneRK 100 Hdésinfection des instruments chirurgicaux
Software
NIS-Element BR4 softwareNikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6GraphPad Software, Inc.
VCP994H

Références

  1. Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
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