Nous présentons ici un protocole pour la modulation du système nerveux autonome intracardiaque et l’évaluation de son influence sur l’électrophysiologie fondamentale, arythmogenèse et cAMP dynamique en utilisant une configuration de Langendorff ex vivo .
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Article de méthode
Impact des neurones intracardiaques sur l’électrophysiologie cardiaque et arythmogenèse dans un système de Langendorff Ex Vivo
Dans cet article
Résumé
Résumé
Depuis son invention à la fin du 19ème siècle, le système de perfusion Langendorff ex vivo le cœur continue d’être un outil pertinent pour étudier un large éventail de paramètres physiologiques, morphologiques, biochimiques et pharmacologiques coeurs au centre dénervés. Nous décrivons ici une configuration pour la modulation du système nerveux autonome intracardiaque et l’évaluation de son influence sur l’électrophysiologie fondamentale, arythmogenèse et dynamique de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc). Système nerveux autonome intracardiaque est modulé par la dissection mécanique de graisse auriculaire tampons-dans les ganglions murines sont situées principalement — ou par l’utilisation d’interventions pharmacologiques ciblées mais aussi mondiales. Un cathéter électrophysiologiques octapolar est introduit dans l’oreillette droite et le ventricule droit et tableaux multi-électrode épicardique placés (MEA) pour la cartographie à haute résolution sont utilisés pour déterminer l’arythmogenèse et électrophysiologie cardiaque. Transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) d’imagerie est réalisée pour la surveillance en temps réel du taux d’AMPc dans différentes régions cardiaques. Neuromorphology est étudié au moyen d’anticorps-basée la coloration des coeurs entiers à l’aide de marqueurs neurones pour guider l’identification et la modulation des objectifs spécifiques du système nerveux autonome intracardiaque dans les études effectuées. La configuration de Langendorff ex vivo permet pour un grand nombre d’expériences reproductibles en peu de temps. Néanmoins, la nature en partie ouverte de l’installation (p. ex.., pendant les mesures de la MEA) contrôle de température constante est difficile et doit être maintenue à un minimum. Cette méthode décrite permet d’analyser et de moduler l’intracardiaque système nerveux dans les coeurs décentralisé.
Introduction
Le système de perfusion Langendorff ex vivo le cœur continue d’être un outil pertinent pour effectuer un large éventail de morphologiques, biochimiques et physiologiques, et des études pharmacologiques dans dénervé centralement coeurs1,2 ,3,4,5 depuis son invention en fin 19ème siècle6. A ce jour, ce système est encore largement utilisé pour divers sujets (p. ex.., ischémie reperfusion) ou étudier cardiaque pharmacologique effets7....
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Protocole
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par les autorités locales des comités de l’utilisation, soins aux animaux de l’Université de Hambourg et l’état de Hambourg.
1. préparation de l’appareil de Langendorff
NOTE : Un système de perfusion Langendorff commercialement disponible est utilisé.
- Préparer une solution de Krebs-Henseleit modifiée (119 mM de 25 mM de bicarbonate de sodium, 4,6 mM de 1,2 mM de phosphate de potassium monobasique, 1,1 mM de sulfate de magnésium, 2,5 mM de chlorure de calcium, 8,3 mM de glucose et de 2 millimètres de sodium, le chlorure de potassium, le chlo....
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Résultats
La figure 1 montre une image de l’installation de Langendorff dont 2 rangées d’électrodes multiples (AME). Avant l’expérience, le cathéter intracardiaque est positionné à proximité de la canule pour faciliter une insertion rapide et facile dans le ventricule droit atrium/droit tout en assurant une courte période de temps jusqu'à ce que l’équilibration peut commencer. La partie inférieure de la chambre peut être accrue (voir les flèches dans la
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Discussion
Dans ce manuscrit, le système de perfusion du Langendorff ex vivo coeur bien connu est présenté comme un outil pour étudier l’impact des neurones intracardiaques sur l’électrophysiologie cardiaque et arythmogenèse en utilisant la cartographie différente et les techniques de stimulation y compris les approches endocardiques et épicardiques.
Plusieurs parties du protocole sont cruciales pour le programme d’installation. Tout d’abord, il est important d’utiliser une technique de préparat.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs aimeraient remercier Hartwig Wieboldt pour son excellente assistance technique et l’UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) du centre médical universitaire Hamburg-Eppendorf de fournir microscopes et soutien. Cette recherche a été financée bythe Förderverein des universitaire Herzzentrums Hamburg e.V. et par le DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire) [FKZ 81Z4710141].
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chlorure | de sodium Sigma-Aldrich | S3014 | Solution de Krebs-Henleit modifiée |
| Hydrogénocarbonate de sodium | Sigma-Aldrich | 401676 | Solution modifiée de Krebs-Henleit Chlorure |
| potassium | Sigma-Aldrich | P5405 | Solution de Krebs-Henleit modifiée |
| Phosphate de potassium monobasique | Sigma-Aldrich | P5655 | Krebs-Henleit modifié solution |
| Sulfate de magnésium heptahydraté | Sigma-Aldrich | M1880 | Solution Krebs-Henleit modifiée Chlorure |
| calcium dihydraté | Sigma-Aldrich | C7902 | Solution Krebs-Henleit modifiée |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Solution Krebs-Henleit modifiée |
| Pyruvate de sodium bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Krebs-Henleit modifié solution |
| Carbogen (95 % O2 / 5 % CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Allemagne | Solution Krebs-Henleit | |
| Filtre stérile steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Solution Krebs-Henleit modifiée |
| d’atropine | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Chlorure d’hexaméthonium | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Base libre de nicotine 98-100 | %Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Solution de formol neutre tamponnée 10 % | Sigma-Aldrich | HT501128 | Coloration de monture entière |
| Tris(hydroxyméthyl)aminométhane | Sigma-Aldrich | 252859 | Coloration de monture entière |
| Méthanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Coloration à montage entier |
| Solution de peroxyde d’hydrogène à 30 % (p/p) dans H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Allemagne | H1009 | Coloration à montage entier |
| Diméthylsulfoxyde | Merck, KGA, Darmstadt, Allemagne | D8418 | Coloration à montage entier Comprimés |
| salins tamponnés au phosphate | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Coloration à |
| montage entierTriton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Coloration de monture entière |
| Albumine bovine fraction V | Biomol, Hambourg, Allemagne | 11924.03 | Coloration de monture entière |
| Poulet anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Coloration de monture entière |
| Lapin anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Coloration de monture entière |
| Chèvre anti choline acétyltransférase | EMD Millipore | AP144P | Coloration de montage entier |
| Âne & lapin IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Coloration de montage entier |
| Âne & chèvre IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Coloration de montage entier |
| Âne & poulet IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Allemagne | AP194SA6 | Entier Coloration de montage |
| Âne conjugué à la biotine et alpha Lapin igG | R& D Systems | AP182B | Coloration de l’ensemble de la monture |
| Biotine âne & alpha conjugué Chèvre igG | R& D Systems | AP192P | Coloration à montage entier |
| Biotine conjuguée chèvre &alpha ; poulet igY | R& D Systems | BAD010 | Coloration à monture entière |
| Support de montage Vectashield | Vector laboratories, Burlingame, CA, États-Unis | H-1000 | Immunohistochimie |
| Vectastain ABC | kit Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochimie |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Coloration à monture entière |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Allemagne | HS2002 | Immunohistochimie |
| BisBenzimide H33342 trichlorhydrate (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochimie |
| Vectashield HardSet support de montage | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochimie |
| Système de perfusion | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Allemagne | ; 73-4343 | Appareil Langendorff |
| Système d’acquisition de données et logiciel correspondant pour cathéter et paramètre physiologique | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, Nouvelle-Zélande | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Cathéter octapolaire | CIB' ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, États-Unis | configuration Langendorff | personnalisée |
| Générateur de stimulus | STG4002, Systèmes multicanaux, Reutlingen, Allemagne | STG4002-160µ ; A | Configuration de stimulation |
| Logiciel de stimulation | Systèmes multicanaux, Reutlingen, Allemagne | MC_Stimulus II | Configuration de stimulation |
| Système d’acquisition de données et logiciel correspondant pour électrogrammes épicardiques | Système ME128-FAI-MPA, Systèmes multicanaux, Reutlingen, Allemagne | USB-ME128 | Configuration MEA |
| Réseau multi-électrodes | MEA, EcoFlexMEA36, Systèmes multicanaux, Reutlingen, Allemagne | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Ciseaux | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne | 14110-15 | Préparation du cœur |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne | 11203-25 | Préparation du cœur |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne | 11080-02 | Préparation du cœur |
| Pince à motif étroit | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne | 11003-13 | Préparation du cœur |
| Pellicule plastique | Parafilm M, Bemis NA, basé à Neenah, WI, États-Unis | Matériaux consommables | |
| Stéréomicroscope | Leica M165FC ; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Allemagne | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, Royaume-Uni< | em>pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS | camera Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | Logiciel d’imagerie FRET |
| Micro-gestionnaire ; Vale Lab, Université de Californie à San Francisco, Californie, États-Unis Logiciel d’analyse | Fret | ||
| Logiciel Image J ; Domaine public, NIH, USA | FRET |
Références
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isola....
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