Analyse en temps réel la pression-volume de l’infarctus aigu du myocarde chez la souris

Résumé

Infarctus aigu du myocarde chez la souris induit des changements aigus mais incomplètement caractérisées en fonction du ventricule gauche (VG). LV cathétérisme chez les souris subissant l’occlusion de l’artère coronaire est une nouvelle méthode pour une évaluation en temps réel de la fonction ventriculaire.

Résumé

Infarctus aigu du myocarde peut conduire à une insuffisance cardiaque aiguë et un choc cardiogénique. L’évaluation de l’hémodynamique est critique pour l’évaluation de toute approche thérapeutique potentielle dirigée contre la dysfonction ventriculaire gauche aiguë de (LV). Modalités d’imagerie actuelles (e.g., échocardiographie et imagerie par résonance magnétique) présentent plusieurs limites puisque impossible de mesurer directement les données de pression de LV. LV cathétérisme chez les souris subissant l’occlusion de l’artère coronaire pourrait constituer une nouvelle méthode pour une évaluation en temps réel de la fonction ventriculaire.

Au début de la procédure, les souris ont été anesthésiés suivie d’une intubation endotrachéale. Au cathétérisme LV, l’artère carotide droite a été exposée par incision de milieu-cou. Le cathéter a été introduit et placé dans la cavité de LV. Thoracotomie a été réalisée et l’artère coronaire principale gauche (LCA) a été ligaturé. Pour induire la reperfusion, la suture est sortie après que 45 min. pression-volume données ont été enregistrées en permanence.

Ligature de la LCA provoqua une diminution de la fonction systolique VG comme en témoigne une réduction de 30 % en volume systolique, la fraction d’éjection (Fe) LV et le débit cardiaque. DP/dt maximal comme paramètre pour la contractilité LV a été également significativement réduite et de la fonction diastolique a été sévèrement réduite (dP/dt minimum -40 %). Reperfusion sur une période de 20 min ne conduit pas à un rétablissement complet de la fonction ventriculaire.

Analyse en temps réel la pression-volume a servi une procédure valide pour surveiller la fonction cardiaque au cours de l’infarctus aigu du myocarde chez les souris. Maintien d’anesthésie stable et une approche chirurgicale standardisée a été cruciale pour assurer la validité des résultats. Comme la phase précoce de l’infarctus aigu du myocarde est essentielle pour la morbidité et la mortalité, la méthode délimitée pourrait être bénéfique pour l’évaluation préclinique de nouvelles stratégies pour la cardioprotection.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont la cause la plus fréquente de décès dans la civilisation occidentale¹. Infarctus aigu du myocarde est un événement critique, qui est lié à la forte mortalité aiguë et chronique². Même si la revascularisation est obtenu par l’intermédiaire d’urgence intervention coronarienne percutanée (ICP), la mortalité reste élevée, en particulier dans les premières 48 h après l’apparition des symptômes chez les patients atteints d’infarctus aigu du myocarde³. Le Choc cardiogénique causé par la réduction aiguë de la fonction du ventricule gauche (VG) est une cause majeure de mortalité hospitalière dans ces patients³. Cette réduction précoce en fonction ventriculaire est causée par des lésions du myocarde après ischémie et reperfusion. Ce que l'on appelle ischémie/reperfusion (je / R) blessure est médiée par des changements cellulaire métabolome comme production exagérée de de^4,espèces réactives de l’oxygène⁵.

Pour explorer les mécanismes de protection possibles conduisant à une diminution des dommages myocardiques en milieu préclinique, modèles murins fiables sont essentielles, y compris les méthodes d’évaluation de poteau-I/R LV fonction⁶. Dans ce cadre, l’échocardiographie transthoracique⁷ et l’imagerie par résonance magnétique (IRM)⁶ sont largement utilisés pour phénotypage fonctionnel^8,9. Cependant, ces méthodes ne conviennent pas pour l’évaluation de grave dysfonctionnement VG et un choc cardiogénique dans un infarctus aigu du myocarde en cours et ne peut pas afficher directement les données sur la pression VG. L’appareil de Langendorff utilisant des coeur isolé dans un test ex vivo fournit des informations sur le sous-jacent pathomécanismes des premières phases I / R blessure¹⁰. Cette méthode est limitée en raison de son incapacité à reproduire in vivo des mécanismes d’adaptation tels que la régulation du système nerveux autonome ou régulation hormonale et homéostasie d’acide-base. Aucune méthode n’est actuellement disponible pour un phénotypage fonctionnel complet de choc cardiogénique et dysfonction ventriculaire gauche durant un cours myocardique je / blessure de R.

Une approche synchronisée avec combinaison de cathétérisme de pression-volume (PV) et l’occlusion transitoire chirurgicale principale artère coronaire gauche (LCA) pourrait être bénéfique, mais techniquement exigeantes. Stabilité hémodynamique extracardiaque durant j’ai / blessure R sont essentielles pour la validité des résultats depuis unstable anesthésie ou perte de sang pourrait fortement influencer les résultats. Un roman approche pour le phénotypage hémodynamique d’I / R blessure via PV LV cathétérisme et transitoires LCA occlusion pourrait apporter de nouveaux aperçus sur le choc cardiogénique et dysfonction VG dans l’infarctus aigu du myocarde et sert de méthode pour des analyses sur cardioprotection.

Protocole

Toutes les expériences ont été achevées en conformité et le respect de tous les règlements pertinents (« Convention européenne pour la Protection des animaux vertébrés utilisés pour expérimental et d’autres fins scientifiques (Directive 2010/63/UE) et les soins aux animaux était en conformément aux lignes directrices. Toutes les expériences ont été réalisées avec les souris C57BL/6JRj mâles à l’âge de 6 mois.

1. préparation

1. Préparer un microscope chirurgical et un coussin chauffant ainsi qu’une sonde rectale pour surveiller la température du corps. Nettoyer et stériliser tous les instruments chirurgicaux.
2. Préparer 2 morceaux de 10 cm de fil de soie de 5-0 pour ligature de navire, 5 cm de fil en polypropylène 6-0 et tube silicone 2 mm pour la ligature de la LCA.
3. Préparer la cupule de calibrage de cathéter de PV de préchauffage à 37 ° C et préparer un 100µl Hamilton seringue remplie de 15 % de chlorure de sodium (NaCl) dans H₂O pour étalonnage saline.
4. Cathéter de place le PV (3 cm, F 1,4) à 37 ° C préchauffé à 0,9 % NaCl en H₂O (solution saline) au moins 30 min avant la mesure. Raccorder le cathéter sur le matériel d’acquisition de données et connectez le périphérique à un convertisseur analogique/numérique. Connecter les deux périphériques à un ordinateur.
5. Configurer le logiciel. Effectuer calibration guidée logiciel pression et étalonnage de conductance comme exigé par le guidage logiciel de flux de travail⁸.

2. anesthésie et analgésie

1. Anesthésier la souris à l’aide de kétamine 100 mg/kg de poids corporel et de xylazine chlorhydrate 10 mg/kg de poids corporel par injection intrapéritonéale. Au début d’I / chirurgie R, administrer des corps de 0,05 mg/kg poids buprénorphine par voie intrapéritonéale pour maintenir une analgésie.
2. Après 10 min, effectuer une intubation endotrachéale à l’aide d’un cathéter (iv) par voie intraveineuse de 20 G et ventilez la souris avec 40 % d’oxygène (O₂) et 2 % (v) l’isoflurane. Définir les paramètres de ventilation approprié (par exemple, 220 µL AVC volume, 150/min pour une souris C57BL/6JRj de 25-30 g).
3. Surveiller en permanence le corps température par sonde rectale. Fixer la souris sur la plaque chauffée avec la tête dirigée vers l’enquêteur. Température normale du corps de la souris est de 36,5-38 ° C. Maintenir la température corporelle au sein de 1 degré par réglage de la température de la plaque chauffante.

3. gauche cathétérisme ventriculaire

1. Désinfecter la poitrine et le cou avec trois gommages alternance de bétadine et 70 % d’alcool.  Attendez de désinfectant de la peau de sécher. Enlever les poils du torse en utilisant un système de petits animaux rasage.
2. Effectuer une incision médiane longitudinale de 10 mm 5 mm sous la lèvre inférieure vers le sternum à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux.
3. Disséquer la partie gauche et droite de la glande sous-maxillaire via émoussé préparation à l’aide d’une pince. Séparer le tissu de muscle et la graisse dans la région de paratrachéal droit d’exposer l’artère carotide commune droite. Mobiliser et séparer le navire d’une longueur totale de 5 à 10 mm de tissu conjonctif via une préparation soigneuse émoussé aux côtés du navire avec une pince courbée.
   NOTE : Éviter une manipulation mécanique du nerf ou le glomus carotidien en tout temps car cela peut provoquer une bradycardie et une hypotension grave.
4. Passer les deux fils de soie disposés sous le bateau. Ligaturer le vaisseau distal avec un nœud serré et placer un noeud lâche sur la région proximale exposée qui permet encore le passage du cathéter.
5. Fixer les fils du noeud crânien (serré) à côté de la tête des souris pour appliquer une légère tension sur le navire que cela facilitera la mise en place du cathéter. Placer une pince vasculaire Surgicel bord proximal proximale du nœud lâche de façon réversible obstrue l’écoulement du sang.
6. Effectuer une incision en forme de coin 1 mm proximal au noeud crânien pour ouvrir le navire avec des ciseaux micro.
   NOTE : Une petite goutte de sang indiquera la bonne exécution de cette étape.
7. Insérer le cathéter soigneusement pour 10 mm. démarrer l’enregistrement des données de cathéter.
   Remarque : S’étendant de l’incision avec une pince peut rendre ce processus plus facile.
8. Extrait de la pince vasculaire. Ajouter 1 à 2 gouttes de solution saline à l’incision pour faciliter le déplacement du cathéter. Continuer à introduire le cathéter pour un autre 10 mm environ. Après avoir passé le noeud proximal avec l’embout du capteur, attacher le noeud avec soin juste assez pour empêcher le sang reflux aux côtés des parties les plus minces du cathéter sans entraver le déplacement du cathéter.
   Remarque : La taille du capteur à l’extrémité du cathéter empêche le reflux du sang lors de l’extraction de la pince vasculaire.
9. Doucement continuez à insérer le cathéter jusqu'à ce que la pression analyse montre la pression sanguine artérielle profil indiquant que le cathéter est placé dans l’aorte (Figure 3 a).
   Remarque : Le cathéter pour atteindre la valve aortique s’accompagnera par résistance légère et le mouvement synchronisé à l’impulsion du cathéter.
10. En éprouvant la résistance essayant de faire progresser à travers la valve aortique, retirer le cathéter arrière 5 mm et avance à nouveau jusqu'à ce que le cathétérisme LV sera indiqué un changement dans l’analyse de PV comme pression diastolique atteindra 0 - 20 mmHg (Figure 3 b). Noter les changements dans le volume de contrôle pour confirmer les placement ventriculaire gauche de la pointe du capteur (Figure 3). Fixer le noeud proximal plus étroitement pour éviter tout mouvement de cathéter.

4. ischémie/Reperfusion chirurgie

1. Inciser peau de bréchet caudale vers l’aisselle gauche pour une longueur totale de 15 mm. Procédez avec préparation émoussée des couches deux musculaires jusqu'à ce que les côtes peuvent être visualisées.
2. Ouvrir la thorax par incision entre les troisième et quatrième côtes gauche. Utilisez les crochets chirurgicaux pour accéder au péricarde. Résection du péricarde au-dessus du cœur. Avant de continuer avec la ligature de LCA, attendre 30 s sans toucher l’animal pour enregistrer des données de PV pour analyse valable.
3. Localiser l’ACV émergeant dans l’oreillette gauche et descendant sur le côté gauche du cœur vers l’apex. Utilisez une suture en polypropylène de 6-0 pour encercler l’artère avec une boucle de 2 mm sous l’oreille gauche. Placer un tube de silicone petit sous la boucle et un nœud serré ci-dessus.
   NOTE : Gris myocarde distale sert de témoin positif de LCA occlusion⁶. J’ai une chirurgie R doit être effectués moins de 5 min indépendamment de l’enquêteur d’exploitation.
4. Couper la suture à 1 mm de longueur. Libérer les crochets chirurgicaux et fermer manuellement les couches musculaires au-dessus de l’incision. Attendre 45 min tout en enregistrant en continu les données PV.
5. Après 45 min, ré-ouvrir l’incision et retirer le tube de silicone pour induire la reperfusion. Enregistrer des données pendant 20 min.
   Remarque : Un changement d’une couleur rouge comme on le voit avant l’ischémie indique reperfusion réussie.

5. Etalonnage

Remarque : Le calibrage du système PV cathéter se compose de 4 étapes obligatoires, dont deux doivent être effectuées après la mesure. Étalonnage doit être répétée après chaque expérience pour assurer la validité des résultats.

1. Effectuer le calibrage de la pression et l’étalonnage de la conductance avant l’expérience, tel que décrit à l’étape 1.5.
2. Procéder au calage du salin lorsque le cathéter est toujours placé dans le ventricule gauche, une fois terminée l’expérience elle-même. Localiser le latéral droit veine jugulaire de l’artère carotide dans la zone préparée. Injecter 10 µL 25 % NaCl en H₂O via un Hamilton seringue tandis que l’enregistrement des données.
3. Calculer l’étalonnage à l’aide du logiciel d’acquisition en mettant en évidence la phase ascendante de la courbe de volume (Figure 5). Répétez ce processus pour un total de 3 fois. Éviter la perte de sang après extraction de la seringue en utilisant une pince vasculaire pour compresser rapidement le pneu crevé.
4. Procéder au calage du volume pour étalonner l’acquisition de données de volume par l’analyse des volumes normalisés. Obtenir le sang de souris environ 500 µL de ponction cardiaque avec une seringue héparinée légèrement 1 mL (p. ex., 5 µL par héparine 200 de IE). Retirer le cathéter PV 10-15 mm pour éviter d’endommager le cathéter.
5. Remplir le sang obtenu dans la cupule de calibration préchauffé de 37 ° C (Figure 5 a). Évitez les bulles car il peut interférer avec les résultats. Ajouter l’extrémité du cathéter dans chaque puites et enregistrements des données. Obtenir une courbe d’étalonnage par analyse guidée par logiciel (Figure 5 b). Répétez le processus pour un total de 3 fois.
6. Euthanasier souris par exsanguination ou dislocation cervicale alors que l’anesthésie isoflurane suffisante est maintenue en tout temps.

6. analyse de données

1. Après avoir terminé les étapes d’étalonnage, effectuer une analyse de données guidée par logiciel. Donc, mettez en surbrillance la section appropriée (au moins dix cycles) au sein de la section de l’analyse du Flux de travail de PV et effectuer une analyse de base. Exclure des cycles avec des déviations en raison de la ventilation ou la manipulation si nécessaire (Figure 3D).
2. Effectuer l’analyse de base de PV avant le passage de la valve aortique (pression artérielle), immédiatement avant et après l’occlusion de l’ACV. Continuez en effectuant l’analyse de base de PV et à des intervalles de 5 min. pendant l’ischémie et après la reperfusion. À la fin de l’expérience, effectuer une analyse de données de pression après retrait du cathéter du ventricule gauche (pression artérielle).
3. Analyser au moins 10 cycles consécutifs afin d’éviter l’erreur d’échantillonnage. Quand une perturbation importante de l’expérience obtenu les valeurs avec la ventilation, l’interruption temporaire de la ventilation pour un maximum de 5 s sont envisageables.
4. Utilisez les paramètres suivants qui sont calculés en Analyse de base (Figure 3D) pour caractériser la fonction VG :
   1. Volume systolique (µL)
   2. Fraction d’éjection : volume de course / fin de diastole volume (%)
   3. Débit cardiaque : volume de course * fréquence cardiaque (µL/min)
   4. Index cardiaque : débit cardiaque / body superficie (µL/(min*cm²)
   5. Temps de travail : zone intérieure de la courbe de PV (mmHg * µL)
   6. Pression maximale (Pmax) ; Pression moyenne (Pmoy)
   7. dP/dt Max (mmHg/s) en tant que paramètre de la fonction systolique ventriculaire
   8. min dP/dt (mmHg/s) comme paramètre pour la conformité LV
   9. Constante de temps de relaxation isovolumétriques : Tau (ms)

Résultats

Après cathétérisme de LV, ligature de LCA réversible fut jouée pendant 45 min, suivie d’une reperfusion de 10 min. PV des données a été enregistrées à tous les fois (Figure 1).

Mise en place correcte du cathéter PV a été confirmé en obtenant le graphe caractéristique de PV LV (Figure 2 a). Placement de cathéter LV a montré la gamme typique de la pression ventriculaire a...

Discussion

PV de surveillance de l’hémodynamique LV dans l’infarctus aigu du myocarde sert une nouvelle méthode pour en temps réel en vivo évaluation de choc cardiogénique et insuffisance LV dans I / blessure de R. Cathétérisme de PV peut fournir un large éventail de paramètres en ce qui concerne la fonction systolique et diastolique ventriculaire. Outre les paramètres volumétriques de LV, généralement obtenues par échographie ou l’IRM (volumes de chambre, EF, volume systolique et débit cardiaque), l’analyse PV donne un pr...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Betaisodona Loesung	Mundipharma	4162-1606/89x30mm	Povidon-Iod
Cuvette d’étalonnage	Millar instruments	910-1049	Cuvette d’étalonnage
Tondeuse à cheveux professionnelle Contura	Wella	HS-60	Système de rasage pour petits animaux
Eclipse Needle 27G	BD	REF 305770	Aiguille 27G
Pince	FST	11203-25, 11069-08, 11616-15, 11506-12, 11051-10	Pince chirurgicale
Forceps	Aesculap Braun	BN731R, BD 311R	Pince chirurgicale
Foris FS2434	Eizo	0FTD2033	Monitor
Hamilton Seringue 100 µ ; l aiguille	Hamilton	80621	100µ ; l seringue avec aiguille
Chauffé Table OP pour petits animaux	Harvard Apparatus	15001	Table OP chauffée
Héparine-Natrium 25000	Ratiopharm	N68542.04	Héparine
Kétamine 10 % 100 mg/ml	bela-pharm	FS1670041	Ketamin
Labchart Pro 8 + Pro modules	AD Instruments	MLS260/8	Logiciel d’analyse de données PV
LAS EZ	Leica	LAS EZ	Microscope logiciel de caméra
Leica IC80 HD Leica		IC80	HD Caméra de microscope
Leica M80	Leica	M80	Microscope
Micro-tip transducteur de cathéter	Millar instruments	SPR-839	PV Cathéter
MiniVent	Harvard Apparatus	845	ventilation
MPVS Ultra	Millar instruments	Dispositif d’acquisition de données de cathéter PV	PL3508B48/M
Octenisept	Schü ; lke	20000832-A	désinfectant
Plastipak 1ml		REF 303172	seringue 1ml
PowerLab 8/35	AD Instruments	PL3508	convertisseur analogique/numérique
Prolene 6-0	Ethicon	XNEH7814. P31	Suture en polypropylène
Kit de rétraction	FST	18200-20	rétraction du situs chirurgical
Seraflex 5-0	Naila	IC108000	suture en soie
Petits et micro-ciseaux	FST Essen	14059-11, 15007-08, 14064-11	Ciseaux chirurgicaux
Petit tube en silicone	Reichelt Chemietechnik		tube pour occlusion ACV
Sodium Chlorure	Sigma-Aldrich	S7653	Chlorure de sodium
testo 108	testo	5631080	thermomètre rectal
Thinkcentre ordinateur de bureau	Lenovo	PC0EJS2V	Computer
Vasofix Safety 20G	Braun	4269110S-01	cathéter d’intubation
Windows 10	Microsoft	KW9-00240	Système d’exploitation
Xylazin 2 %	Ceva	6324464.00.00	Chlorhydrate de xylazine