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Article de méthode

Un protocole en vue d’acquérir la Tenocyte dégénérative de l’homme

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DOI :

10.3791/57634

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9 juin 2018

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1Department of Orthopaedic Surgery, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine, 2Department of Pathology, Kyung Hee University Hospital at Gangdong, Kyung Hee University School of Medicine, 3Department of Physiology, CHA University School of Medicine, 4Department of Rehabilitation, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

In vitro utilisation de tenocytes dégénérative est essentielle lors d’enquêtes sur l’efficacité de nouveaux traitements sur tendinopathie. Toutefois, la plupart des études de recherche utilisent uniquement le modèle animal ou un tenocyte sain. Nous proposons le protocole suivant pour isoler tenocytes dégénératives humaines pendant la chirurgie.

Résumé

Tendinopathie, une affection douloureuse qui se développe en réponse à la dégénérescence du tendon, est en hausse dans les pays développés en raison de l’augmentation de l’activité physique et l’espérance de vie. Malgré l’augmentation de la prévalence, la pathogénie sous-jacente reste encore incertaine, et le traitement est généralement symptomatique. Récemment, de nombreuses options thérapeutiques, y compris les facteurs de croissance, les cellules souches et thérapie génique, ont été étudiées dans l’espoir d’améliorer la puissance de guérison du tendon dégénératif. Cependant, la majorité de ces études ont été menée que sur des modèles animaux ou tenocytes humain sain. Malgré certaines études sur le tenocytes pathologique, au meilleur de notre connaissance il n’y a actuellement aucun protocole décrivant comment obtenir tenocytes dégénératives humaines. Le but de cette étude est de décrire un protocole standard pour l’acquisition humaine tenocytes dégénérative. Au départ, le tissu tendineux a été récolté chez un patient présentant l’epicondylitis pendant la chirurgie. Puis biopsies ont été prises depuis le tendon extenseur carpi radialis brevis correspondant aux changements structurels observées au moment de la chirurgie. Tous les tendons récoltés semblent terne, gris et friable, et oedémateux, qui fait visuellement distinctes de celles en bonne santé. Tenocytes ont été cultivés et utilisés pour des expériences. Pendant ce temps, la moitié des tissus récoltés ont été analysée sur le plan histologique, et il a été démontré qu’ils partageaient les mêmes caractéristiques principales de tendinopathie (angiofibroblastic dysplasie ou hyperplasie). Une analyse secondaire par immunocytochimie a confirmé que les cellules cultivées ont été tenocytes avec la majorité des cellules ayant des taches positives pour les protéines mohawk et tenomodulin. Puis, les qualités de la nature dégénérative de tenocytes ont été déterminées en comparant les cellules avec le contrôle sain à l’aide d’une analyse de prolifération ou qRT-PCR. Le tenocyte dégénérative affiche un taux plus élevé de prolifération et similaires modèles d’expression de gène de tendinopathie correspondant à des rapports antérieurs. Dans l’ensemble, ce nouveau protocole pourrait constituer un outil utile pour les études futures de tendinopathie.

Introduction

Tendinopathie est un trouble musculo-squelettique dégénératif chronique qui se développe dans différentes parties du corps. Récemment, le nombre de cas de tendinopathie a augmenté considérablement dans les pays développés en raison de la participation aux sports de loisirs et l’espérance de vie accrue1,2de plus en plus. La cause de tendinopathie est considérée comme multifactorielle et ces causes incluent l’ischémie, blessures de radicaux libres d’oxygène, un déséquilibre entre les innervations vasoconstricteur et vasodilatateur, intérieur micro-déchire et modifications neuro-règlement3 ,4,5,6,7,8. La plupart des traitements pour tendinopathie seulement soulagent ses symptômes. En outre, traitements sans régénération tissulaire nécessitent une longue période de réadaptation et d’atteindre une réponse limitée de tendons blessés, qui impose un défi clinique pour médecins9.

L’incompétence des options thérapeutiques actuelles ainsi que le manque de capacité de tendon dégénératif d’auto-guérison a plomb chercheurs à s’intéresser à étudier les stratégies de traitement alternatif. Récemment, de nouvelles études ont signalé plusieurs des résultats prometteurs pour améliorer l’efficacité de guérison des tendons tendinopathie à l’aide de facteurs de croissance, base de cellules souches thérapie et thérapie de gène pour10,11,12.

À travers une revue de la littérature, nous avons constaté que les études concernées peuvent se diviser en deux catégories selon leur matériel d’analyse : modèles animaux comme un rat, une souris ou un lapin ; et des modèles humains. En ce qui concerne le modèle animal, il y a actuellement deux techniques populaires pour générer la tendinopathie : induction chimique de blessures ou de surcharger le modèle de mécanique. Toutefois, chaque modèle animal a été limitée dans la reproduction de la tendinopathie humain complexe pathologie13,14.

Plupart des papiers à l’aide d’échantillons humains étaient analysés sur le plan histologique ou effectuée l' in vitro expérience basée sur un tenocyte humain sain au lieu d’une tenocyte dégénérative15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. seulement quelques papiers a signalé qu’ils ont utilisé un humain tenocyte dégénérative, mais ils n’a pas décrit en détail le protocole utilisé pour obtenir le tenocyte dégénérative de l' humain22,23. Dans ce contexte, il convient de noter que des résultats positifs de la modèle animal ou le tissu sain/tenocyte peuvent prédire pas nécessairement efficacité humaine ou un dosage efficace parce que la dégénérescence du tendon est un processus compliqué et la pathogenèse pas encore pleinement compris.

Collectivement, il est nécessaire de décrire le protocole standard pour l’obtention de la tenocyte dégénérative de tissus humains sans provoquer d’effets indésirables pour le donateur. Cet article décrit un protocole sur la façon d’acquérir la tenocyte dégénérative humaine. Pour valider le protocole, les tissus récoltés ont été analysés sur le plan histologique. Puis, les cellules cultivées a été confirmé comme le tenocyte dégénérative en utilisant immunocytochimie (ICC), une réaction en chaîne en temps réel-polymérase quantitative (qRT-PCR) et une analyse de la viabilité.

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Protocole

Le protocole a été réalisé conformément à la déclaration d’Helsinki et le protocole a été approuvé par l’Institutional Review Board au CHA Bundang Medical Center.

1. dégénératifs tendineux récolte de tissus chez le Patient

  1. Diagnostiquer l’épicondylite latérale en prenant les antécédents médicaux et à l’aide des résultats de l’examen physique : sensibilité sur l’origine tendineuse à proximité de l’épicondyle latéral ; douleur évoquée par résisté à extension de l’articulation du poignet.
  2. Les critères d’inclusion suivants : plus de 18 ans ; une histoire de l’épicondylite latérale pendant au moins six mois ; récalcitrants pour traitement non opératoire ; au moins trois mois se sont écoulés depuis l’injection de corticostéroïdes, plasma riche en plaquettes ou toxine botulique
  3. Exclure ce qui suit : les femmes enceintes ; patients ayant des antécédents de maladie du rachis cervical, coude rhumatoïde, rhumatologiques, chirurgie autour de coude et syndrome de coincement du nerf ; patients refusant de faire un don de tissu.
  4. Technique chirurgicale
    Remarque : Voir la Figure 124.
    1. Après anesthésie générale par isoflurane et intubation endotrachéale, mettre le bras sur la table et appliquer un garrot. Appliquez alors agent de Bétadine sur le bras entier et drapé avec une feuille de chirurgie aseptique.
    2. Exposer le coude latéral par une incision de 3 à 5 cm avec n15 bistouri lame antéro juste à l’épicondyle latéral et proximale au niveau de l’articulation.
    3. Visuellement identifier l’extensor carpi radialis longus (ECRL) et l’extenseur aponévrose interface et pratiquer une incision de fendage 2 – 3 mm de profondeur entre l’aponévrose ECRL et extenseur avec une lame de bistouri n ° 15 à l’interface identifié.
    4. Extraire l’ECRL vers l’avant, qui amènera l’origine pathologique extensor carpi radialis longus brevis (MRD) ci-dessous en vue directe.
    5. Identifier visuellement les pathologiques dégénératifs par sa caractéristique couleur grisâtre terne et le habituellement oedémateux et friable tissu.
    6. Après identification, soigneusement résection tous les tissus dégénératifs brusquement à l’aide de bistouri n ° 15 et mini-lames.
    7. Incorporer le tissu réséqué (environ 1 cm3) dans en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) immédiatement et retirer tous les tissus environnants sauf le tissu tendineux soigneusement dans environ 10 mL de PBS dès que possible.
    8. En cas d’Exostose osseuse à l’épicondyle latéral, supprimer Exostose à l’aide d’un rongeur et lissez-le avec une râpe. Faites plusieurs trous de forage (diamètre 1,6 mm, environ 6 à 8 trous) dans le condyle antérolatérale pour améliorer l’apport vasculaire. Ceci est optionnel.
    9. Refermer la plaie couche par couche en utilisant le matériel de suture non résorbable.
  5. Contrôle sain tenocyte
    1. Obtenir tenocytes sain du tendon restant du tendon ischio-auto ou auto-rotule lors de la reconstruction du ligament croisé antérieur et utilisez-le comme le contrôle pour le suivant expérience25.
      Remarque : Le nombre d’échantillons utilisés dans cette étude ont été trois dans chaque groupe.

2. histologie

  1. Stocker environ la moitié du tissu récolté dans le formol tamponné neutre de 10 % dans une hotte chimique ou l’équivalent.
  2. Incorporer le tissu dans un bloc de paraffine (4 – 5 mL) et section, il en coupes de 4 – 5 µm du.
  3. Détachant des sections de contrôle et le tendon dégénératif avec coloration hématoxyline et éosine (H & E) et le bleu Alcian tache à un pH de 2,5. Effectuer H & E coloration dans une machine de tache automatisée comme suit.
    1. Déparaffiner à l’aide de xylène (3 fois, 5 min, respectivement).
    2. Hydrate d’alcools graduées à l’eau (100 % alcool, 4 min ; alcool à 100 %, 3 min ; 95 % d’alcool, 2 min ; alcool 70 %, 1 min ; eau, 2 min).
    3. Une coloration à l’hématoxyline pendant 5 min. Lavez bien dans l’eau pendant 2 min.
    4. Différencier l’acide alcool 1 % (1 % HCl dans l’alcool à 70 %) pendant 3 s. lavage bien dans l’eau pendant 3 min.
    5. Neutraliser les HCl par immersion dans l’ammoniac de 0,5 % pendant 10 s, suivie d’un lavage à l’eau 3 mn.
    6. Tache au Eosion pendant 5 min.
    7. Déshydrater à travers des alcools (alcool à 80 %, 30 s ; 95 % d’alcool, 1 min 100 % alcool 1 min, 100 % alcool 2 min).
    8. Claire dans le xylène (3 fois, 2 min, 2 min et 3 min, respectivement).
    9. Monter avec un toboggan de couverture.
  4. Exécuter immunohistochemitry (IHC) en utilisant le kit de liaison polymère affiner détection selon les instructions du fabricant avec des modifications mineures.
    1. Après déparaffinage xylène, effectuer une procédure de récupération d’antigène moyen de Bond de démasquage pendant 30 min à 100 ° C. Le démasquage de Bond contient un tampon citrate basé et agent tensio-actif (1 L, pH 5,9 à 6,1).
    2. Étancher les peroxydases endogènes en incubant le tissu avec du peroxyde d’hydrogène pendant 5 min.
    3. Incuber les sections à une température ambiante (21-22 ° C) pendant 15 minutes avec des anticorps primaires contre le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) (1 : 200), tenomodulin (1 : 200) ou mohawk (1 : 200).
    4. Effectuer l’anticorps secondaire de marquage avec un système conjugué de l’anticorps biotine polymère raifort peroxydase-linker.
      1. Utilisation secondaire lapin anti-IgG de souris en sérum animal 10 % (v/v) dans du tampon Tris saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one solution pour localiser des anticorps de souris.
      2. Utilisez anti-lapin de polymère Poly-HRP-IgG (< 25 µg/mL) contenant 10 % (v/v) de sérum animal dans du tampon Tris saline/0.09% pour localiser des anticorps de lapin.
      3. Utiliser 3, 3'-Diaminobenzidine hydrate de tétrahydrochlorure dans une solution de stabilisateur pour visualiser l’ensemble via un précipité brun.
      4. Contre-coloration avec < 0,1 % l’hématoxyline (bleu) pour visualiser les noyaux de la cellule.
  5. Observer les lames marquées par H & E, Alcian bleue des taches et IHC de VEGF, tenomodulin et mohawk sous microscope optique et d’obtenir des images microscopiques représentatives de chaque diapositive sous champ à un fort grossissement (X 400).

3. Tenocyte Culture

  1. Préparation du tissu
    1. Préparation des échantillons de tendon en supprimant tous les tissus environnants soigneusement avec micro-ciseaux et pinces.
    2. Laver avec du PBS et émincer en petits morceaux (environ 1 mm3 ou moins).
    3. Digérer les tissus pendant 1 h dans 30 mL de milieu de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) additionné de 30 mg/mL collagénase II à 37 ° C.
    4. Passer des cellules à travers un tamis de cellule de 100 µm.
    5. Désactiver collagénase II en ajoutant 1 mL de sérum fœtal (SVF).
    6. Centrifuger à 196 x g pendant 5 min.
  2. Culture cellulaire
    1. 3 x 105 cellules des graines dans un plat de 100 mm et culture avec DMEM additionné de 10 % de SVF et 1 % solution antibiotique-antimycosiques à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pour 1 semaine.
    2. Changer le milieu de culture tous les trois jours jusqu'à ce que 80 % confluence se produit. Culture des échantillons de cellules dégénératives et témoins en bonne santé jusqu’au passage quatre et utiliser pour l’expérience.

4. immunocytochimie (ICC)

  1. Transférer 200 µL de cellules cultivées (2 x 105 cellules) sur les huit puits d’une diapositive de chambre et de cultiver les cellules à confluence avec l’ajout de supports neufs pour 1 jour.
  2. Laver les cellules avec du PBS et fixer avec 500 µL de 4 % de formaldéhyde par puits.
  3. Incuber les lames avec 0,5 % Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min pour la perméabilisation des membranes.
  4. Bloquer dans du PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine et 0,05 % TWEEN-20 pour mohawk et tenomodulin, respectivement.
  5. Incuber dans l’obscurité avec l’anticorps monoclonal de souris anti-mohawk (dilution 1 : 100) et les anticorps anti-tenomodulin de chèvre (dilution 1 : 100) à 4 ° C jusqu’au lendemain.
  6. Incuber les anticorps secondaires (Alexa 555-anti chèvre (1 : 200) pour tenomodulin ; Souris de 488-anti Alexa (1 : 200) pour les Mohawks) dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante.
  7. Monter avec 0,5 µL d’un milieu de montage de fluorescence.
  8. Analyser à l’aide d’un microscope à fluorescence (400 X).

5. essai de prolifération

  1. Mesurer la viabilité cellulaire à l’aide de tétrazolium soluble dans l’eau (WST) -1.
    1. Les semences sains et dégénératives des cellules dans des 96 plaques puits à une densité de 2 x 103 cellules / puits pour 24 et 72 h 120.
    2. Après l’incubation, ajouter 10 µL de la solution de WST-1 de 10 % à chaque puits.
    3. Incuber les boîtes pendant 3 h à 37 ° C à 5 % de CO2.
    4. Mesurer la densité optique à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques. Mesurer au moins trois fois à tous les points dans le temps pour chaque échantillon.
  2. Quantité d’ADN cellulaire mesure à l’aide du test de BrdU.
    1. Des semences tous les deux en bonne santé et cellules dégénératives en 96 plaques bien à une densité de 2 x 103 cellules / puits pour 24 et 72 h 120.
    2. Après l’incubation, ajouter 10 µL de solution de BrdU 10 % dans chaque puits.
    3. Incuber les boîtes pendant 3 h à 37 ° C à 5 % de CO2.
    4. Ajouter 100 µL/puits de la Solution de fixation/dénaturant (60 – 70 % éthanol, 0,1 à 0,5 % d’hydroxyde de sodium) et de garder la plaque à température ambiante pendant 30 min.
    5. Ajouter 100 µL/puits préparé 1 x solution de détection des anticorps et de garder la plaque à température ambiante pendant 1 h.
    6. Solution de retirer et laver les plaques trois fois avec 1 x tampon de lavage.
    7. Ajouter 100 µL/puits préparé 1 solution d’anticorps secondaire conjugué HRP x et garder la plaque à température ambiante pendant 30 min.
    8. Retirez la plaque de solution et de laver trois fois avec 1 x tampon de lavage.
    9. Ajouter 100 µL de substrat TMB 50 %.
    10. Incuber 30 min à température ambiante.
    11. Ajouter 100 µL de Solution d’arrêt.
    12. Mesurer la densité optique à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
      Remarque : Prenez lectures au moins trois fois à tout moment points pour chaque échantillon.

6. analyse statistique

  1. Recueillir et analyser des données à l’aide de SPSS.
  2. Représentent les données en moyenne ± écart-type de la moyenne.
  3. Test de Mann Whitney U utilisation.
  4. Tenir compte des différences statistiquement significatives lorsque la valeur de p est inférieure à 0,05 (p < 0,05).

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Résultats

Des analyses histologiques a révélé que le tissu récolté de l’épicondylite latérale avait les caractéristiques d’un tendon de tendinopathic. Article H & E de tendinopathie dégénérative tendon a révélé un bundle de collagène désorganisé avec une perte de polarité et les structures fines fibres parallèles droites, fortement compressés. Des signes histologiques évocateurs de dégénérescence comme supérieur de la cellularité et élargies noyaux sans la forme typique de broche étaient commun...

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Discussion

Un certain nombre d’études antérieures ont rapporté comment créer des modèles animaux de tendinopathic chronique en utilisant différentes procédures telles que la collagénase ou injection de kartogenin, sur tapis roulant et plus de26,27. Bien que de nombreuses études ont montré des effets thérapeutiques prometteuses basées sur ces modèles animaux, expériences utilisant le tenocyte dégénérative humaine serait cruciales dans le domaine de la tendinopathie afin de r...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par une subvention de la Corée Health Technology R & D Project à travers la Corée santé Industrie développement Institut (KHIDI), qui a été financé par le ministère de la santé et le bien-être, la République de Corée (numéro de licence : HI16C1559).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ScalpelKisanbioKS-Q0306-15N° 15
Mini-lameBeaver374769
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)Gibco11995065
PBSGibco14190250
sérum de veau fœtal (FBS)Gibco16000044
50 mM acide ascorbique-2-phosphateSigma-AldrichA5960
Solution antibiotique-antimycosiqueGibco15240062
4 % formaldéhydeBio-solutionBP031
Triton X-100  ;Sigma-AldrichX100-100ml
BSARdtechC0082
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416-100ml
MKX (C-5)Santa cruz biotechnologysc-515878
Tenomodulin (N-14)Santa cruz biotechnologysc-49325
Milieu de montage par fluorescenceDAKOS3023
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate)Thermo Fisher ScientificD1306
WST-1Dojindo Molecular TechnologiesCK04
BrdU Kit de test deprolifération cellulaire Technologie de signalisation cellulaire#6813
Réactif TRIzolInvitrogen15596018
Kit de synthèse d’ADNc iScript  ;Bio-Rad170-8891
TaqMan Expression génique Master MixApplied Biosystems4369016
GAPDHThermo Fisher ScientificHs02786624_g1
COL3A1Thermo Fisher ScientificHs00943809_m1
ACTA2Thermo Fisher ScientificHs00426835_g1
TAC1Thermo Fisher Scientific
TACR1Thermo Fisher ScientificHs00185530_m1
PTGS2Thermo Fisher ScientificHs00153133_m1
ACTBà Hs99999903_m1Thermo Fisher Scientific
(100 µ ; m)  ;Corning352360
Plat de culture 100 mmThermo Fisher Scientific8188207
Lame à chambre à 8 puitsThermo Fisher Scientific154534
96 puits transparent à fond plat Microplaques traitées TCCorning3596
Nikon Eclipse 50i  ;Lecteur
VERSA max  ;Molecular Devices
CFX96 Système de détection PCR en temps réelBio-Rad
Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %Sigma-AldrichHT501128
ParaffinesLeica Biosystems3801340
ÉthanolJUNSEI CHEMICAL90303-2185
HématoxylineDAKOCS70030-2
ÉosineDAKOCS70130-2
Bleu d’alcianDAKOAR16011-2
Acide citriqueSigma-Aldrich251275
XyleneJUNSEI CHEMICAL25165-0430
Peroxydases endogènes  ;DAKOS200380-2
Canada baumeJUNSEI CHEMICAL23255-1210
Lame de microtomeFEATHERA35
Verre slideSUPERIOR1000612
Verre de couvertureMarienfeld-Superior101050
VEGFSanta cruz biotechnologiesc-7269
SPSS LogicielCentrifugeuse polyvalente IBMVer. 18.0
LABOGENE1248R
Hs00243225_m1 Filtres cellules de microplaques Nikon

Références

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