Article de méthode

Un procédé de préparation d’échantillon efficace pour améliorer les signaux de Ion de glucides en spectrométrie de masse de désorption-ionisation Laser assistée par matrice

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DOI :

10.3791/57660

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29 juillet 2018

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1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University

Dans cet article

Résumé

Un protocole afin de renforcer les signaux ion glucides en spectrométrie de masse MALDI par réformer des structures cristallines au cours du processus de préparation d’échantillon est démontré.

Résumé

Préparation de l’échantillon est un processus critique dans l’analyse de spectrométrie de masse (MS) des glucides. Bien que la désorption /-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) MS est la méthode de choix dans l’analyse de glucides, reproductibilité de signaux et de données poor ion d’échantillons d’hydrates de carbone continuent d’être graves problèmes. Pour une analyse quantitative des hydrates de carbone, un protocole d’analyse efficace offrant la qualité des données supérieure est nécessaire. Cette vidéo montre des protocoles de préparation d’échantillon pour améliorer l’intensité du signal et de minimiser les variations de données des hydrates de carbone en MALDI-MS. Après séchage et cristallisation des gouttelettes de l’échantillon, la morphologie des cristaux est réformée par le méthanol avant l’analyse par spectrométrie de masse. L’augmentation de signal de glucides est examinée avec la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI (IMS). Les résultats expérimentaux montrent que réforme de cristal ajuste les structures cristallines et redistribue les analytes d’hydrates de carbone. En comparaison avec la méthode de préparation sèche de gouttelette dans classiques MALDI-MS, réforme morphologies de cristal de glucides avec méthanol montre nettement meilleure intensité du signal, distribution d’imagerie ion et la stabilité des données. Étant donné que les protocoles démontrés ci-après n’impliquent pas de modifications dans la composition de l’échantillon, ils sont généralement applicables aux divers hydrates de carbone et les matrices.

Introduction

Analyse des glucides est un sujet important et difficile. Hydrates de carbone et leurs dérivés jouent un rôle important dans vivant organismes1,2,3. Ces molécules ont compliqué les structures et ont tendance à se décomposer. Beaucoup d'entre eux ne peuvent être qualifiés de manifestement en raison de difficultés dans la séparation et la détection. Bien que la spectrométrie de masse (MALDI) de désorption-ionisation laser assistée par matrice (MS) a été appliquée à l’analyse d’un large éventail de biomolécules, en raison de sa sensibilité et de résultats compréhensibles4, analysant les hydrates de carbone à l’aide de MALDI-MS continue pour être un défi majeur en raison de l’efficacité de l’ionisation faible de ces molécules5. Dérivatisation chimique est une méthode commune pour améliorer l’efficacité d’ionisation de glucides6,7, mais ces procédures sont temps et consommation d’échantillon. En outre, l’efficacité de l’ionisation des dérivés de glucides est toujours inférieure à celui des protéines. Ainsi, le développement de méthodes pour améliorer le signal de glucides en MALDI-MS sans procédures compliquées est nécessaire.

L’application de MALDI-MS à l’analyse quantitative est un autre sujet difficile. Un problème majeur de MALDI-MS est que sa sensibilité et données reproductibilité s’appuie critique sur les protocoles de préparation témoin et paramètres expérimentaux. Dans de nombreux cas, une analyse quantitative par MALDI-MS n’est pas fiable en raison des morphologies échantillon hétérogène et de la distribution de l’analyte. Un exemple bien connu est échantillons préparés avec une matrice MALDI (DHB) acide de 2, 5-dihydroxybenzoïque. Lorsque DHB est cristallisé lentement dans l’environnement ambiant, l’étendue de l’analyte incorporation dans les cristaux de la matrice est imprévisible, parce que les échantillons qui en résulte montrent morphologies irrégulières. Ces échantillons se composent normalement de gros cristaux aciculaires et fines. Lorsque DHB est préparée à l’aide d’un solvant volatil ou une plaque de prélèvement chauffée, un procédé de séchage rapide entraîne des cristaux bien plus homogènes et mieux les résultats quantitatifs8,9,10. Cette technique est appelée « recristallisation » des échantillons MALDI. L’amélioration est attribuée à la meilleure incorporation d’analytes en cristaux de matrice fine durant le processus de cristallisation rapide. Nous avons aussi démontré que l’environnement de préparation d’échantillon de réglage réduit l’hétérogénéité du signal de glucides et une amélioration des résultats quantitatifs11,12. Les conclusions de ces travaux suggèrent que la morphologie de l’échantillon est un facteur critique dans la détermination de la qualité du signal de glucides. Élaborer une stratégie générale pour l’analyse de tous les jours, il faut une exemple efficace de la méthode de la réforme fournissant des glucides améliorée sensibilité.

Nous avons examiné systématiquement la corrélation entre la sensibilité échantillon de morphologie et hydrates de carbone en MALDI-MS dans un récent rapport13. Les résultats obtenus à l’aide de plusieurs glucides importants et matrices spectacle que la meilleure mise en valeur de signal est remplie de recristalliser séché échantillons MALDI. La morphologie des échantillons préparés selon la méthode conventionnelle sèche de gouttelette (DD) est réformée par recristallisation rapide avec du méthanol (MeOH). Les protocoles de préparation d’échantillon détaillé sont illustrés ici. Le protocole se compose de trois étapes principales, y compris l’échantillon plaque préconditionnement, le dépôt de l’échantillon et recristallisation et analyse par spectrométrie de masse. Les hydrates de carbone utilisés incluent sialyl-lewis un (SLeA) et maltoheptaose (MH). DHB est utilisé comme une matrice de modèle. Les résultats montrent que l’intensité du signal de glucides et la distribution spatiale amélioraient nettement après recristallisation. Une telle méthode peut être appliquée à des échantillons avec autres matrices populaires, y compris 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) et α- cyano-4-hydroxycinnamique. Cette méthode est une approche générale qui peut être facilement intégrée dans la routine de laboratoire pour l’analyse des glucides.

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Protocole

1. échantillon plaque préconditionnement

  1. Nettoyage de la plaque d’échantillon
    1. Porter des gants en nitrile pour éviter toute contamination de la plaque d’échantillon pendant le nettoyage.
    2. Lavez la plaque échantillon 100,0 ml d’une solution détergente (1,0 mg/mL).
    3. Lavez la plaque de l’échantillon avec de l’eau distillée-eau désionisée (DDW).
    4. Rincer la surface de la plaque échantillon avec 30,0 mL de MeOH.
    5. Mettre la plaque de l’échantillon dans un bécher de 600 mL et le remplir avec DDW jusqu'à ce que la plaque d’échantillon est complètement immergée dans l’eau.
    6. Placer le bécher dans un ultrasonique baignoire (voir Table des matières) et laisser agir la plaque échantillon pendant 15 min (200 W, 40 kHz).
    7. Sortez la plaque de l’échantillon et de souffler les gouttes d’eau à l’aide d’azote sous pression.
    8. Gisement de 0.2 µL de MeOH sur la plaque d’échantillon pour vérifier si MeOH se propage à d’autres endroits.
      Remarque : Si MeOH fusionne avec d’autres taches, répétez les étapes 1.1.3-1.1.5 ; Si ce n’est pas le cas, passez à l’étape suivante.
  2. Régulation de la température de la chambre de séchage
    1. Utiliser une chambre de séchage dans des conditions stables pour sécher les gouttelettes, comme décrit plus haut11,12,13. En particulier, utilisez la procédure détaillée décrite aux points 2.1 à 2.5 d’UO, Y.-M. et al. 12de 2016. Brièvement :
      1. Purger la chambre de séchage en azote de la température ambiante à un débit constant de maintenir un environnement de faible humidité relative.
      2. Garder l’échantillon plaque température constante à ordinaire - (25 ° C) ou des conditions de séchage rapide (50 ° C), régulée par un bloc de cuivre température contrôlée dans la chambre de séchage.
  3. Préparation des solutions de matrice et l’analyte
    1. Préparation des solutions de matrice
      1. Dissoudre le DHB dans 50 % d’acétonitrile (ACN) : 50 % DDW pour préparer une solution 0,1 M.
    2. Préparation d’analytes de glucides
      1. Dissoudre le SLeA à DDW pour préparer une solution de M-4 10.
      2. Dissoudre la MH dans DDW pour préparer une solution de 10-4 M.

2. dépôts et recristallisation de l’échantillon

Remarque : Les procédures optimisées pour l’analyse de petites quantités d’échantillons réguliers sont décrites ici. Veiller à ce que la température de la plaque d’échantillon est stabilisée à la température désirée avant de déposer les solutions. Si l’échantillon s’étend sur une grande surface pour couvrir les autres points de l’échantillon au cours de la recristallisation, préparer un nouvel échantillon ou répétez l’étape 1.1.

  1. Pour l’analyse d’une petite quantité (0,1 µL) de l’échantillon
    Remarque :     les étapes suivantes ont été élaborées pour minimiser la consommation de l’échantillon et le temps. Elle est destinée à l’analyse quantitative des échantillons réels avec une quantité limitée ou IMS rapide pour l’analyse de la quantification.
    1. Prémélanger 0,25 µL de solution DHB et 0,25 µL de SLeA ou solution MH dans un tube de microcentrifuge.
    2. Vortex solution mixte à l’aide d’un agitateur Vortex pour 3 s.
    3. Tournez en bas la solution mélangée dans une mini centrifugeuse pendant 2 s (2000 x g).
    4. Utiliser une pipette pour faire ressortir 0.1 µL de la solution prémélangée et de déposer immédiatement sur la plaque de l’échantillon.
      Remarque : Lors du dépôt d’une petite quantité d’échantillon, Ne pas conserver la solution prémélangée dans l’embout de la pipette pour plus de 10 s.
    5. Attendez que l’échantillon se dessécher. Les durées de séchage typiques sont énumérées au tableau 1.
    6. Utiliser une pipette pour déposer 0.2 µL de MeOH droite sur la place de l’échantillon séché. Obtenez l’échantillon humide et sécher immédiatement.
      Remarque : S’assurer que la procédure de dépôt est terminée en 3 s pour éviter les pertes par évaporation importante de MeOH.
    7. Examiner l’échantillon à l’aide d’un microscope. Si les morphologies de cristal ne sont pas comme prévu (voir Figure 1 , par exemple des résultats souhaités), répétez les étapes 2.1.1-2.1.6 de préparer un nouvel échantillon.
    8. Porter des gants en nitrile et retirer avec précaution la plaque d’échantillon de la chambre de séchage.
  2. Pour l’analyse d’une quantité régulière (1 µL) de l’échantillon
    Remarque : Les étapes suivantes sont mis au point pour maximiser l’homogénéité des échantillons de glucides avec quantité d’échantillon utilisée généralement MALDI. Le processus est destiné à la routine et des analyses quantitatives. Le processus de recristallisation redistribue les échantillons et matrices uniformément de grandes surfaces.
    1. Prémélanger 2,5 µL de solution DHB et 2,5 µL SLeA ou solution MH dans un tube de microcentrifuge.
    2. Vortex la solution prémélangée avec un Vortex pendant 5 s.
    3. Tournez en bas la solution mélangée dans une mini centrifugeuse pendant 2 s (2000 x g).
    4. Utiliser une pipette pour faire ressortir 1,0 µL de la solution prémélangée et de déposer immédiatement sur la plaque de l’échantillon.
      Remarque : ne sont pas utilisation restant prémélangée solution à nouveau après le dépôt des échantillons.
    5. Attendez que l’échantillon se dessécher. Les durées de séchage typiques sont énumérées au tableau 1.
    6. Utiliser une pipette pour déposer 1,5 µL de MeOH droite sur la place de l’échantillon séché. Obtenez l’échantillon humide et sécher immédiatement.
      Remarque : En cas de température de la plaque échantillon élevée (50 ° C), l’étape de recristallisation devrait être faite à moins de 5 s pour minimiser l’évaporation de MeOH dans la pointe de pipette.
    7. Examiner l’échantillon à l’aide d’un microscope. Si les morphologies de cristal ne sont pas comme prévu (voir Figure 1 , par exemple des résultats souhaités), répétez les étapes 2.2.1-2.2.6 de préparer un nouvel échantillon.
    8. Porter des gants en nitrile et retirer avec précaution la plaque d’échantillon de la chambre de séchage.

3. données de spectrométrie de masse Acquisition et analyse

Remarque : L’analyse est réalisée à l’aide d’un spectromètre commercial de masse de temps de vol (Table des matières) équipé d’une source d’ions MALDI. L’appareil est utilisé par le logiciel de contrôle spécifique (Table des matières) avec extraction pré-optimisée retard et laser de l’énergie. Les spectres sont enregistrés en mode linéaire avec une gamme de masses de m/z = 0 – 1500. La plaque d’échantillon potentielle est ± 25 keV et chaque spectre est en moyenne 10 tirs lasers. Utilisateurs doivent effectuer l’optimisation de l’instrument et l’analyse de l’échantillon à l’aide de logiciels compatibles et suivez les instructions du fabricant de l’instrument.

  1. Ouvrez le logiciel de contrôle d’instrument (voir Table des matières).
  2. Insérer la plaque d’échantillon dans le spectromètre de masse.
  3. Sélectionnez la méthode d’acquisition de données pré-optimisée dans le logiciel.
  4. S’inscrire à la région de l’ensemble de l’échantillon d’IMS en utilisant le logiciel d’imagerie (voir Table des matières).
    Remarque : Sautez cette étape si ce n’est faire IMS.
  5. Commencer d’acquisition de données en mode batch du logiciel de contrôle.
  6. Tracer les images d’ion en utilisant le logiciel d’imagerie, après que l’acquisition de données est terminée.
  7. Analyser les spectres de masse à l’aide de logiciels d’analyse (voir Table des matières) si les données sont enregistrées sans une image d’ion.

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Résultats

Images de SEM représentatives de SLeA mélangé à DHB préparé en utilisant DD et méthodes de recristallisation sont indiquées à la Figure 1. Une morphologie typique de DHB tel qu’établi par la méthode DD est gros cristaux aciculaires à la jante et les fines structures cristallines dans le Centre des taches de l’échantillon. Les longueurs typiques de ces cristaux aciculaires sont ~ 100 µm. Après recristallisation de MeOH, l’échantillon a une plus gran...

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Discussion

Hétérogénéité de l’échantillon est qu'un problème crucial en MALDI-Mme DD est le plus couramment utilisé de méthode de préparation d’échantillon, mais les cristaux qui en résultent sont très hétérogènes. Ces exemples montrent reproductibilité de mauvais signal de tir-à-coup et d’échantillon. Par conséquent, la recherche pour « sweet spots » dans les zones échantillonnées lors d’acquisition de données est une procédure commune dans les expériences de MALDI. Ces échantillons hétérogènes ne conviennent pas pour la quantific...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs n’ont aucun remerciements.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactif
Détergent en poudreAlconox242985
MéthanolMerck106009
AcétonitrileMerck100003
Acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB)Alfa AesarA11459
sialyl-lewis A (SLeA)Sigma-AldrichS1782
MaltoheptaoseSigma-AldrichM7753
Pointes de pipetteMettler Toledo17005091
Tube de microcentrifugationAxygenMCT-150-C
Equipment
Milli-Q système de purification d’eauMilliporeZMQS6VFT1
Gants en nitrile non poudrésMicroflexSU-690
600 mL BécherDuran2110648
Nettoyeur à ultrasonsDeltaDC300H
HygromètreWisewind5330
Débitmètre d’azote gazeuxDwyerRMA-6-SSV
Thermocouples de type KDigitron311-1670
Mélangeur vortexScientific Industries  ; SI-0236
Mini centrifugeuseSelect BioProductsForce Mini  ;
PipetteRaininpipet-lite XLS
StéréomicroscopeOlympusSZX16
Chambre de séchage à température contrôlableCe laboratoire
Spectromètre de masse Ultraflex II TOF/TOF BrukerDaltonics
MTP 384 Plaque cible en acier poli BCBruker Daltonics8280781
Flexcontrol Version 3.4Bruker DaltonicsLogiciel de contrôle
Fleximaging Version 2.1Bruker DaltonicsLogiciel d’imagerie
Flexanalysis Version 3.4Bruker DaltonicsLogiciel d’analyse

Références

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Mots-clés

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