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Article de méthode

Ostéosarcome utilisant le Syndrome de Li-Fraumeni cellules souches de pluripotentes induites Patient dérivé de modélisation

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DOI :

10.3791/57664

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13 juin 2018

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1Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth, 3Department of Musculoskeletal Oncology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4Women's Health Institute, Cleveland Clinic Foundation, 5Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine for the Prevention of Human Diseases, The University of Texas Health Science Center at Houston, 6Center for Precision Health, School of Biomedical Informatics and School of Public Health, The University of Texas Health Science Center at Houston

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la génération de pluripotentes induites des cellules souches (CISP) de Syndrome de Li-Fraumeni (LFS) patient dérivée fibroblastes, différenciation de CISP par l’intermédiaire de cellules souches mésenchymateuses (CSM) d’ostéoblastes et modélisation in vivo tumorigenèse utilisant des ostéoblastes patient dérivé de LFS.

Résumé

Syndrome de Li-Fraumeni (EPA) est une affection autosomique dominante cancer héréditaire. Les patients avec l’EFT sont prédisposés à un divers types de tumeurs, notamment ostéosarcome--un des plus souvent malignes non hématologique primaires dans l’enfance et l’adolescence. LFS offre donc un modèle idéal pour étudier cette malignité. Profitant des méthodologies de l’iPSC, ostéosarcome LFS-associés peut être modélisé avec succès en différenciant EFT patient CISP de cellules souches mésenchymateuses (CSM), puis aux ostéoblastes--les cellules d’origine des ostéosarcomes. Ces ostéoblastes LFS récapitulent des propriétés oncogènes de l’ostéosarcome, fourniture d’un système de modèle attrayant pour délimiter la pathogenèse de l’ostéosarcome. Ce manuscrit montre un protocole pour la génération de CISP de fibroblastes de patients LFS, différenciation du CISP de MSCs, différenciation des MSCs aux ostéoblastes et in vivo tumorigenèse utilisant des ostéoblastes LFS. Ce modèle de maladie iPSC peut être étendu pour identifier des biomarqueurs potentiels ou cibles thérapeutiques pour l’ostéosarcome associés à LFS.

Introduction

Entre 2006 et 2007, plusieurs conclusions de la percée des laboratoires des Drs Shinya Yamanaka et James A. Thomson conduit à l’élaboration de pluripotentes induites des cellules souches (CISP)1,2,3. En reprogrammant des cellules somatiques avec des facteurs transcriptionnels définis à forme CISP, les chercheurs ont pu générer des cellules ayant des caractéristiques clés à savoir, pluripotence et auto-renouvellement, que l'on croyait seulement existent dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). CISP pourrait provenir de n’importe quel individu ou patient et ne devait pas être provenant d’embryons, élargissant considérablement le répertoire des maladies disponibles et des horizons pour l’étude. Depuis lors, CISP patient dérivés ont été utilisés pour récapituler le phénotype de diverses maladies humaines, de la maladie d’Alzheimer4 et sclérose latérale amyotrophique5 QT long syndrome6,7, 8.

Ces avancées dans la recherche de l’iPSC ont également ouvert de nouvelles avenues pour la recherche sur le cancer. Plusieurs groupes ont récemment utilisé CISP patient au développement du cancer de modèle sous un fond génétique sensibles9,10,11, avec une application réussie démontrée à ce jour l’ostéosarcome9, la leucémie10,11,12et du cancer colorectal13. Bien que les modèles de cancer iPSC dérivés sont encore à leurs débuts, ils ont démontré grand potentiel en cancers associés à la maladie phenocopying, élucider les mécanismes pathologiques et d’identifier des composés thérapeutiques14.

Syndrome de Li-Fraumeni (EPA) est une maladie de cancer héréditaire dominante autosomale causée par de mutation germinale TP53 15. Les patients avec l’EFT sont prédisposés à un divers types de tumeurs malignes dont l’ostéosarcome, faire EFT CISP et leurs dérivées de cellules particulièrement bien adaptée à l’étude de cette tumeur maligne16. Un modèle basé sur iPSC ostéosarcome fut institué en 2015 à l’aide de LFS CISP patient dérivé9 par la suite se différenciée en cellules souches mésenchymateuses (CSM) et puis d’ostéoblastes, la provenance des cellules de l’ostéosarcome. Ces ostéoblastes LFS récapitulent les défauts associés à ostéosarcome ostéogénique différenciation et des propriétés oncogènes, démontrant le potentiel comme une plate-forme de « tumeur osseuse dans un plat » du modèle. Fait intéressant, génome transcriptome analyses révèlent des aspects d’une signature de gène d’ostéosarcome en ostéoblastes LFS et caractéristiques de ce profil d’expression génique LFS corrélées avec un pronostic sombre dans l’ostéosarcome9, indiquant la potentiel des modèles de maladies CISP LFS pour révéler les caractéristiques de pertinence clinique.

Ce manuscrit fournit une description détaillée de comment utiliser EFT dérivé de patient CISP d’ostéosarcome de modèle. Il détaille la génération de LFS CISP, différenciation du CISP pour MSCs et puis aux ostéoblastes et utilisation d’un modèle xénogreffe in vivo à l’aide des ostéoblastes LFS. Le modèle de maladie EFT comporte plusieurs avantages, notamment la capacité de générer des cellules illimités à tous les stades du développement de l’ostéosarcome pour études mécanistes, l’identification de biomarqueurs et drogues dépistage9,14, 16.

En résumé, le modèle de base iPSC ostéosarcome LFS offre un système complémentaire attrayant pour faire avancer la recherche de l’ostéosarcome. Cette plate-forme offre également une preuve de concept pour la modélisation du cancer à l’aide de CISP dérivé de patient. Cette stratégie décrite ci-dessous peut être facilement étendue à malignités modèle associées aux autres maladies génétiques avec les prédispositions du cancer.

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Protocole

Ce travail a été approuvé par l’Université du Texas Health Science Center à Houston (UTHealth) Comité sur le bien-être Animal. Les expériences réalisées en stricte conformité avec les normes établies par le centre UTHealth pour la médecine des animaux de laboratoire & soins (CLAMC) qui est accrédité par l’American Association for Laboratory Animal Care (AAALAC International). Les sujets humains dans cette étude relèvent de scénario A (No sujets la recherche humaine ») tel que défini par la documentation SF424 NIH. Par conséquent, il n’a pas l’approbation par le Comité de déontologie de la recherche humaine UTHealth.

1. génération de LFS CISP (Figure 1 a)

  1. Jour -2, plaque de 2 x 104 fibroblastes de patients EFT dans un puits d’une plaque 6 puits et les cellules avec moyen de fibroblastes (tableau 1) de la culture à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 incubateur. S’assurer que les fibroblastes confluence de 50 à 60 % le jour de la transduction (jour 0).
  2. La transduction virus Sendai au jour 0. Pour ce faire, remplacez le milieu usé avec milieu de fibroblaste pré chauffé. Décongeler le Sendai commercial virus reprogrammation nécessaire (voir la Table des matières) sur la glace. Infecter les fibroblastes EPA avec des virus Sendai mixtes selon les instructions du fabricant.
  3. Entretien des cellules transduits dans le milieu des fibroblastes (jour 1-6) :
    1. Le jour 1, 24h après transduction, retirez le support de fibroblastes contenant des autres virus Sendai et remplacez-le par 2 mL de milieu de fibroblastes fraîches. La culture de fibroblastes transduits à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 incubateur.
    2. Changer le support avec le médium de fibroblastes tous les deux jours depuis le jour 2-6.
  4. Entretien des cellules transduits de la condition de la culture de mangeoire (jour 7-28) :
    1. Préparer des fibroblastes embryonnaires souris CF1 irradiés Pétri (MEF) sur 6 jours. Pour faire ce manteau six plats de vitroplants de 100 mm en ajoutant 5 mL de la gélatine de 0,1 % à chaque plaque à température ambiante pendant 30 min. aspirer la gélatine de 0,1 % après enduit.
    2. Retirer MEFs du contenant de l’azote liquide. Décongelez les MEFs en utilisant le système de dégivrage commercialement disponible suivant les instructions du fabricant. Plaque des cellules sur les plaques de gélatine-enduit avec milieu de culture MEF/MSC (tableau 1) à une densité de semis d’autour de 6,7 x 105 cellules par plat de vitroplants de 100 mm.
    3. Ensemencer les cellules transduits sur plaques MEF (jour 7) : Trypsinize les cellules transduits en utilisant 1 mL de 0,25 % trypsine-EDTA par plat de 100 mm pour 2-4 minutes à température ambiante. Neutraliser la trypsine avec 9 mL de milieu de fibroblastes. Cellules de transfert pour tubes coniques et centrifuger à 230 x g à 37 ° C pendant 4 min. plaque les fibroblastes transduits sur les MEF six plats préparés le jour 6 et leur culture dans 8 mL de milieu de fibroblastes par plat.
      Remarque : La confluence de MEFs est d’environ 20 % avant d’ensemencer la cellule transduite de la force expéditionnaire des marines.
    4. Le jour 8, jetez le milieu des fibroblastes et remplacez-les par les CSEh moyen (tableau 1).
    5. Attendez que l’émergence de clones iPS de jours 9-28 (Figure 1C). Changer le milieu CSEh a passé tous les deux jours et de surveiller l’émergence de clones iPS sous le microscope. Attendez de CISP clones assez grands pour être observé à l’oeil nu et passer ensuite à étendre iPS clones en condition de culture sans chargeur.
  5. Expansion de l’EPI a émergé des clones en condition de culture sans chargeur (jour 29-79 ~ 99) :
    1. Pour préparer la plaque matrice-enduit, recouvrir une plaque de 48 puits avec 120 µL de la solution de revêtement de matrice (tableau 1) membrane basale par puits. Assurez-vous que la solution de revêtement membrane basale matrice couvre le puits et recouvre la surface de plat de la culture. Laissez-le à température ambiante pendant 1 h. aspirer la solution de revêtement immédiatement avant utilisation et ajouter 250 µL de milieu de CSEh / puits avec inhibiteur de ROCK 2 µM Thiazovivin.
    2. Le jour 28, aspirer le milieu CSEh usé et laver les clones iPS avec 1 x DPBS. Ramasser les clones iPS visible avec une pointe de pipette de 1 mL et le transfert dans un puits d’une plaque de 48 puits traitée (étape 1.4.1). Graines d’une colonie par puits de la plaque de 48 puits.
    3. Centrifuger la plaque à 230 g pendant 4 min faciliter la fixation des cellules. Culture des clones d’iPS à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 incubateur.
    4. Le lendemain (jour 29), retirer le support de CSEh usé et ajouter 250 µL du milieu iPSC commercialement disponibles dans chaque puits.
    5. Maintenir les clones d’iPS à 37 ° C dans un 5 % humidifié incubateur à CO2 et le changement du milieu de l’iPSC tous les deux jours.
    6. Quand les iPS clones atteignent 85 % confluence, sous-culture cellules à un 01:10 ratio par zone de culture. Ajouter 60 µL de la solution commerciale passaging pour détacher les cellules et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
    7. La moitié de la CISP détaché sur une plaque de 12 puits matrice-revêtement membrane basale dans 1 mL de milieu de CSEh avec inhibiteur de ROCK 2 µM Thiazovivin graines. Culture des clones iPS dans une plaque de 12 puits avec 1 mL de milieu iPSC commercialisé par puits et sous-culture CISP à un 01:10 rapport jusqu'à ce qu’ils atteignent le passage 10.
      NOTE : CISP est sub cultivé tous les 5-7 jours à une 01:10 ratio. Il faut jusqu'à 10 semaines pour les clones d’iPS atteindre le passage 10. CPSI qualifications dont la morphologie cellulaire, l’activité phosphatase alcaline (PA) et l’expression des facteurs de pluripotence et marqueurs de CSEh, peuvent être examinées après la confirmation de la suppression du virus Sendai au CISP (généralement démontré après environ 10 passages) (Figure 1 b-E). Anticorps et apprêt des informations pour la caractérisation de l’iPSC figurent au tableau 2 et 4.

2. différenciation des EPA CISP de cellules souches mésenchymateuses (CSM) (Figure 2 a)

  1. La culture iPSC clones sur Force expéditionnaire des marines pendant au moins 2 semaines (journée ~ -14-0) : préparer les plats MEF (boîtes de vitroplants de 100 mm) comme décrits précédemment (1.3.1 - 1.3.2). Maintenir la CISP dans un milieu CSEh et changement moyen tous les deux jours. Chaque fois que le CISP atteindre 90 % confluence, sous-culture CISP par 01:10 dilution.
  2. Suppression de MEFs de CISP (jour 0) :
    1. Après maintien CISP sur MEFs pendant 2 semaines, culture CISP dans les plats de vitroplants de 100 mm jusqu’au cellules atteindre confluence de 80 à 90 %. Enlever le support de CSEh usé et laver CISP avec 5 mL de 1 x DPBS. Ajouter 1 mL de la solution de détachement cellulaire pour détacher les cellules et incuber à température ambiante pendant 3 min.
    2. Ajouter 9 mL de milieu de culture MEF/MSC à la plaque pour neutraliser l’activité de solution de détachement cellulaire et les cellules individuelles de transfert à une autre boite de culture de tissu de 100 mm sans revêtement.
    3. Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 min permettre les MEFs à fixer sur la plaque.
    4. Soigneusement recueillir le surnageant qui contient les seules CISP et centrifuger à 230 x g à 4 ° C pendant 4 min.
      NOTE : Rinçage négligemment le fond de plaque conduit au détachement de MEFs.
  3. Différenciation du CISP vers MSCs (jour 0 - 28) :
    1. Manteau trois puits d’une plaque de 6 puits avec 1 mL de 0,1 % de gélatine / puits à température ambiante pendant 30 min.
    2. Retirez le surnageant de la CISP recueillies 2.2.4.
    3. Resuspendre CISP dans 6 mL de moyen de différenciation MSC (tableau 1) et des cellules de semences en trois de la microplaque avec 2 mL par puits (jour 0).
    4. Changer le moyen de différenciation MSC tous les deux jours pour déloger les cellules libres ou morts (jour 1 - 28).
  4. Maturation des dérivés iPSC MSCs (jour 28-45) :
    1. Enlever le support de différenciation MSC usé et laver les cellules avec 1 mL de 1 x DPBS.
    2. Trypsinize MSCs avec 0,5 mL de 0,25 % trypsine-EDTA / puits à température ambiante pendant 3 min.
    3. Neutraliser la trypsine par 1,5 mL de milieu de culture MEF/MSC et recueillir les MSCs de trois puits dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger à 230 x g à 4 ° C pendant 4 min.
    4. Retirez le surnageant et remettre en suspension les MSCs dans 3 mL de milieu de culture MEF/MSC et plaque sur un 60 mm 0,1 % enduit de gélatine plat (jour 28).
    5. Culture de MSCs dans le milieu de culture MEF/MSC et changement moyen tous les deux jours. Quand les cellules atteignent 100 % confluence, sous-culture MSCs à un ratio de 1:3, à l’aide de 0,25 % trypsine-EDTA.
      Remarque : Les MSCs affichent une morphologie fibroblastique (Figure 2 b). Lorsque MSCs poussent dans une forte densité, allongées MSCs peuvent se former un motif tourbillon (Figure 2 b).
    6. Effectuer l’immunofluorescence pour évaluer MSCs dérivés iPSC en examinant les marqueurs de surface MSC CD44, CD73, CD105 et CD166 (Figure 2).
      Remarque : La dilution des anticorps apparaissent dans le tableau 2. Immunofluorescence de cellules vivantes est effectué conformément aux instructions du fabricant.
    7. Après confirmation, développez MSCs à un ratio de 1:3 dans les plats de vitroplants de 100 mm. Geler les flacons (3 flacons par plat de vitroplants de 100 mm) en utilisant le support de gel contenant 10 % DMSO et 90 % FBS.
      NOTE : Afin d’enrichir la population MSC, MSCs peuvent être triées à l’aide de CD105+, CD24-critères par écoulement cytometry9,17. iPSC-dérivé MSCs différenciées selon la méthode de base de PDGF-AB couramment peuvent être maintenues pendant 2-3 mois de culture sans perte d' identité MSC9. Geler MSCs d’un numéro de passage au début après avoir vérifié les caractéristiques MSC.

3. différenciation des EPA MSCs aux ostéoblastes (Figure 3 a)

  1. Préparation de MSCs pour la différenciation ostéogénique (jour -1)
    1. Afin d’assurer une quantité suffisante de cellules pour compléter le protocole de différenciation ostéogénique, commencer avec MSCs cultivées dans les plats de vitroplants de 100 mm au confluent de 95 %. Enlever le milieu de culture usé et laver MSCs avec 5 mL de 1 x DPBS.
    2. Trypsinize MSCs avec 1 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA par plat de 100 mm à température ambiante pendant 3 min. Pour s’assurer que les cellules ne sont pas plus trypsinisées, arrêter la trypsinisation lorsque 50 % du détachement cellulaire est observée au microscope.
    3. Neutraliser la trypsine par 9 mL de milieu de culture MEF/MSC et recueillir les MSCs de 3 puits dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger à 230 x g à 4 ° C pendant 4 min.
    4. Aspirer le surnageant, resuspendre MSCs dans 5 mL de milieu MSC et compter le nombre de cellules par un hémocytomètre.
    5. Plaque bon nombre de MSCs sur une plaque de culture.
      NOTE : Le détail du nombre de cellules de la plaque de 12 puits, 6 puits-plaque et récipients de culture de tissu de 100 mm sont résumées dans le tableau 3.
  2. Induction de la différenciation ostéogénique par moyen de différenciation ostéoblastique (ODM) (tableau 1) (jour 0 - 24) :
    1. Aspirer le milieu de culture MEF/MSC et le remplacer par le bon volume des ODM (1 mL, 2 mL et 8 mL pour chaque puits de la plaque de 12 puits, chaque puits de la plaque 6 puits et des cultures tissulaires 100 mm plat, respectivement) pour différencier les MSCs aux ostéoblastes (jour 0).
    2. Aspirer l’ODM usé et remplacer par le bon volume d’ODM tous les deux jours au cours du processus de différenciation ostéogénique.
    3. Effectuer la phosphatase alcaline (PA) et le S rouge de l’alizarine (ARS) a souillure pour détecter la phosphatase alcaline osseuse associée, produit par preosteoblasts et les dépôts minéraux produites par échéance ostéoblastes, respectivement, le jour 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 et 24 ( Figure 3 b).
      NOTE : AP souillant et la souillure de ARS sont effectuées avec kit commercialement disponible suivant le protocole du fabricant.
    4. Examiner les niveaux d’expression des marqueurs d’ostéoblastes matures et preosteoblast (ALPL et COL1A1 pour preosteoblasts ; PTH1R et BGLAP pour mûrissent les ostéoblastes) par qRT-PCR (Figure 3).
      NOTE : La coloration Positive AP devrait après 9 jours de différenciation ostéogénique et ARS une coloration positive peut s’attendre après 21 jours de différenciation ostéogénique. Les MSCs croissant dans le milieu de culture MEF/CSM peuvent être servis comme témoin négatif d’AP de coloration et de coloration d’ARS.

4. le modèle de xénogreffe pour étudier In Vivo la tumorigenèse des ostéoblastes dérivés LFS MSC (Figure 4 a)

  1. Différenciation de LFS MSCs aux ostéoblastes :
    1. Graines de 3 à 4,5 x 105 MSCs dans plat de vitroplants de 100 mm. Préparer cinq plats pour une injection sous-cutanée.
    2. La culture MSCs dans ODM pour différencier les MSCs aux ostéoblastes comme décrit au point 3.2, jusqu’au jour 14.
  2. Préparation des ostéoblastes différenciés pour injection sous-cutanée :
    1. Pour préparer la solution de détachement des ostéoblastes (tableau 1), dissoudre 1 g type II collagénase dans 1 000 mL de milieu αMEM de faire la solution II de collagénase (1 mg/mL). Conserver la solution II de collagénase à-20 ° C. Mélanger 0,25 % trypsine-EDTA et la solution de collagènase II à un ratio de 1:1 pour faire les ostéoblastes solution de détachement.
    2. Enlevez l’ODM usé et lavez les ostéoblastes différenciés avec 5 mL de 1 x DPBS par plat de 100 mm.
    3. Ajouter 1,5 mL de solution de détachement des ostéoblastes par plat de 100 mm et incuber plats à 37 ° C pendant 30 min. examiner et s’assurer que le détachement d’ostéoblastes par microscopie.
    4. Neutraliser la solution de détachement des ostéoblastes par ODM et recueillir les ostéoblastes détachés dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger à 230 x g à 4 ° C pendant 5 min.
    5. Retirez le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 25 mL de milieu de l’ODM. Passer les cellules à travers un tamis de cellule 70 µm pour éliminer les cellules agrégées. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    6. Préparer 1 x 107 ostéoblastes par injection sous-cutanée et les cellules de la centrifugeuse à 230 x g à 4 ° C pendant 4 min.
    7. Remettre en suspension les ostéoblastes de7 1 x 10 dans 50 µL glacée 1 x DPBS. Mix différenciés des ostéoblastes avec 50 µL de matrice de la membrane de sous-sol libre-rouge de phénol (ostéoblastes suspension et membrane basale de la matrice ont été mélangés à un ratio de 1:1) et de maintenir des ostéoblastes sur la glace avant l’injection.
  3. In vivo tumeur modèle de xénogreffe des ostéoblastes dérivés MSC LFS :
    1. Anesthésier 8 semaines femelle NU/NU souris immunodéprimées dans une chambre fournissant 5 % (v/v) par inhalation isoflurane dans 1 L/min d’oxygène (fourni par CLAMC). Après que l’animal est couché, placez-vous le système de livraison anesthésique dans le cône de nez, fournissant 2 % (v/v) par inhalation isoflurane dans 200mL/min d’oxygène (fourni par CLAMC). Contrôler la profondeur de l’anesthésie en vérifiant les réflexes cornéaux et pédales pour rendre les souris sont suffisamment anesthésiés et ne souffrez pas de malaise au cours de la procédure.
    2. Désinfecter la zone à injecter avec alternance de tampons d’isopropanol chlorhexidine et 70 %. Aiguille de 26 G permet d’effectuer une injection sous-cutanée de la membrane basale matrice mixte des ostéoblastes EFT en un seul côté des pattes de souris NU/NU immunodéprimés âgés de 8 semaines (Figure 4 a).
    3. Surveiller les souris en effectuant une palpation hebdomadaire aux sites d’injection pour la croissance des densités nodulaires sous-cutanée. La formation de tumeurs peut être observée autour de 6 à 10 semaines après l’injection (Figure 4 b).
    4. Euthanasier les souris par méthode d’asphyxie carbonique suivie par dislocation cervicale. Disséquer les tumeurs développées. Déterminer le grade tumoral et l’index de la différenciation, preosteoblasts et ostéoblastes matures par diverses méthodes de coloration (p. ex. l’hématoxyline et éosine (H & E) coloration, coloration rouge Sirius Picro et von Kossa coloration respectivement).

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Résultats

Ce protocole présente les procédures dont EFT iPSC génération MSC différenciation, la différenciation ostéoblastique et essai in vivo tumorigenèse avec utilisant des dérivés de LFS MSC ostéoblastes.

Régime pour la génération de LFS CISP de fibroblastes en utilisant un virus Sendai commercialement disponible kit de reprogrammation est montré dans la Figure 1 a. Base de virus Sendai livraison...

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Discussion

Pour parvenir à une plus grande efficacité de différenciation de MSC, plusieurs aspects sont essentiels. L’un est la condition de culture de CISP avant d’initier la différenciation MSC. Le protocole présenté dans le manuscrit est issu des précédentes études 9,17. CISP doivent être cultivés sur MEFs pendant au moins 2 semaines. Maintenir le CISP en bonne conditions sur MEFs sont critiques pour les cellules à fixer sur la plaque de gélatine-enduit pour la différent...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

R. Z. est soutenue par l’Innovation UTHealth Cancer Prevention Training programme Pre-Doctoral bourse de recherche (prévention du Cancer et Research Institute of Texas accorder RP160015). J.T. est pris en charge par le programme de Lin Ke de l’Université de premier affilié hôpital de Sun Yat-sen. D.-F.L. est le savant CPRIT en cancérologie et soutenu par les NIH voie vers l’indépendance prix R00 CA181496 et CPRIT prix RR160019.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plastic ware
60 mm
PlatCorning430166
6 puitsAssiette Falcon353046
12 puits Falcon353043
48 puitsAssiette Falcon353078
1 mL Pointe de pipetteUSA Scientific1111-2721
200 & micro ; L Pointe de pipetteUSA Scientific1111-0706
10 & micro ; L Pointe de pipetteUSA Scientific1111-3700
5 mL Pipette sérologiqueSARSTEDT86.1253.001
10 mL Pipette sérologiqueSARSTEDT86.1254.001
25 mL Pipette sérologiqueSARSTEDT86.1685.001
50 mL Tube, PPSARSTEDT62.547.100
Tube de 15 mL, PPSARSTEDT62.554.100
Matériaux de culture et réactifs
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitInvitrogenA16517Commercial Sendai Virus Reprogramming
Corning hESC Qualified Corning MatrixCorning354277Membrane basale
Matrix CF1 MEF, irradiéeThermoFisherA34180
DMEMSigma-AldrichD5671
DMEM/F12Corning10-090-CV
&alpha ; MEMCorning10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368Commercial iPSC medium
KnockOut DMEM/F-12ThermoFisher12660012
FBS Opti-GoldGenDEPOTF0900-050
KnockOut Serum ReplacementThermoFisherA3181502
Pénicilline-StreptomycineSigma-AldrichP4333
MEM Acides aminés non essentielsCorning25-025-CI
Solution de L-glutamineSigma-AldrichG7513
2-MercaptoéthanolSigma-AldrichM3148
FGF-basic humain (bFGF)PEPROTECH100-18B
Recombinant Humain PDGF-ABPEPROTECH100-00AB
&beta ;-GlycérophosphateSigma-AldrichG9422
DexaméthasoneSigma-AldrichA4902
Acide ascorbiqueSigma-AldrichA5960
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS)Corning21-031-CV
StemMACS Passaging Solution XFMiltenyi Biotec130-104-688Solution commerciale
décollement de cellules Accutatse Solution de détachement de cellulesCorning25-058-CISolution de détachement de cellules
Thiazovivin (inhibiteur de ROCK)Calbiochem420220
0,25 % Trypsine-EDTA SolutionSigma-AldrichT4049
Colgénase, type II  ;   ;ThermoFisher17101015
Anticorps NANOG humainsR& D SystemAF1997
OCT4 Anticorps (H-134)Santa Cruzsc-9081
Humain/Souris SSEA-4 Anticorps conjugué PER& D SystemFAB1435P
Alexa Fluor 555 Souris Anti-Humain TRA-1-81 AntigèneDB Biosciences560123
Alexa Fluor 488 Âne Anti-Chèvre IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-545-003
Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-545-144
PE Souris Anti-Humain CD105eBioscience12-1057-42
FITC Souris Anti-Humaine CD44DB Biosciences555478
PE Souris Anti-Humaine CD73DB Biosciences550257
PE Souris Anti-Humaine CD166DB Biosciences560903
FITC Souris Anti-Humaine CD24DB Biosciences555427
DonkeySerum Jackson ImmunoResearch017-000-121
Sérum de chèvreJackson ImmunoResearch005-000-121
Kit de coloration à la phosphatase alcaline IIStemgent00-0055
Rouge d’alizarine SSigma-AldrichA5533
Réactif TRIzolThermoFisher15596018
ChloroformeThermoFisherC298-500
2-PropanolThermoFisherA416-4
Éthanol, absolu, qualité biologie moléculaireThermoFisherBP28184
DNase I, sans RNase (1 U/µ ; L)ThermoFisherEN0521
Kit de synthèse d’ADNc iScriptBioRad1708891BUN
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708884
Matrigel Matrix Haute concentration (HC), Phenol-RedCorning354262
Seringue à embout coulissant de 1 ml, calibre 26 x 5/8 pouceDBBiosciences 309597
Plat Corning 430107 Kit de Free

Références

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