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Article de méthode

Modèle murin Aspiration oropharyngée de pneumonie bactérienne associée à et nosocomiales

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DOI :

10.3791/57672

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28 juin 2018

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1Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, LAC+USC Medical Center

Dans cet article

Résumé

La pneumonie infectieuse est parmi les infections les plus courantes chez l’homme. Un modèle approprié en vivo est essentiel pour comprendre la pathogenèse de la maladie et de tester l’efficacité de nouveaux médicaments. Avec ce modèle de pneumonie murine aspiration oropharyngée, on peut examiner la pathogénie et nouveaux traitements contre ces infections mortelles.

Résumé

Modèles murins d’infection sont essentielles pour comprendre la pathogenèse de la maladie et de tester l’efficacité de nouveaux médicaments visant à lutter contre les agents pathogènes causatifs. Pneumonies infectieuses est parmi les infections les plus communes présentées par les patients à la clinique et garantit ainsi un modèle approprié en vivo . Les modèles de pneumonie typique utilisent l’inoculation intranasale, qui dépose des organismes excessives en dehors du poumon, provoquant des complications hors cible et symptômes, tels que la sinusite, gastrite, entérite, traumatismes physiques ou au moyen de microparticules brumisation pour imiter les aérosols diffusion plus typique d’une pneumonie virale, tuberculeuse ou fongique. Ces modèles ne reflètent pas exactement la pathogenèse de la pneumonie bactérienne typique ou soins de santé-extra-hospitalière. En revanche, ce modèle murin de pneumonie par aspiration oropharyngée imite l’itinéraire de gouttelettes en pneumonie soins de santé. Inoculant 50 µL de la bactérie suspension dans l’oropharynx de souris anesthésiés entraîne l’aspiration réflexive, qui se traduit par une pneumonie. Avec ce modèle, on peut examiner la pathogenèse des pathogènes qui causent la pneumonie et de nouveaux traitements pour lutter contre ces maladies.

Introduction

Infection des voies respiratoire inférieures est des maladies transmissibles au plus meurtrier du monde et la cause la plus fréquente de décès dans les pays en développement1. Globalement, ces infections représentent plus de 3,2 millions de décès1. En outre, la pneumonie nosocomiale est parmi les formes les plus courantes et les plus meurtrières des soins de santé infections contractées et est causée par des agents pathogènes plus résistantes aux antibiotiques2,3. Le parcours typique d’acquisition de la pneumonie bactérienne pour les deux extra-hospitalière et pneumonie nosocomiale est l’aspiration oropharyngée contenu dans les alvéoles. Les modèles murins utilisés pour étudier ces maladies souvent utilisent inoculation intranasale4, déposer une grande partie des bactéries à l’extérieur du poumon, provoquant des complications hors cible et symptômes tels que la sinusite et les traumatismes physiques, qui sont incompatibles avec la maladie progression dans l’homme que les modèles ont été conçus pour émuler. Autres modèles peuvent utiliser des chambres d’inhalation et dispositifs de micromisting, qui avec plus de précision miment les pneumonies virales, fongiques et tuberculeuses, mais récapituler pas avec précision la voie normale d’acquisition pour les pneumonies bactériennes typiques.

Le modèle de pneumonie murine aspiration oropharyngée peut être utilisé pour simuler la voie naturelle et la pathogenèse de la pneumonie bactérienne. Par inoculation 50 µL de la suspension bactérienne dans l’oropharynx de souris anesthésiés à l’aide d’une pipette, aspiration réflexive s’ensuit, qui se traduit par une pneumonie infectieuse. En utilisant ce modèle, on peut examiner la pathogenèse des pathogènes qui causent la pneumonie et de nouveaux traitements pour lutter contre ces maladies avec un modèle de fidélité plus élevé, plus analogue aux infections de pneumonie d’aspiration observées chez l’homme. En outre, à la différence des modèles similaires qui infectent par l’intermédiaire de la cavité buccale5,6, ce modèle garantit que l’inoculum complet atteint les poumons au lieu de l’intestin, où il peut causer une inflammation hors site et infections, telles que la gastrite et l’entérite. Enfin, contrairement à un autre modèle publié qui nécessite un laryngoscope et inocule à travers la trachée7, ce modèle n’obstrue pas les voies respiratoires avec une aiguille de gavage et ne nécessite pas d’injection pour la livraison de l’inoculum. Au lieu de cela, l’inoculation s’appuie sur le réflexe d’aspiration naturelle de la souris.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux doivent être approuvés par le chercheur animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC).

1. préparation de l’Inoculum bactérien

  1. Isoler les colonies bactériennes.
    1. Ensemencer une souche bactérienne (par exemple, a. baumannii « HUMC1 ») sur un milieu approprié agar stérile (p. ex., la gélose trypticase soja), en veillant à ne générer des colonies isolées.
    2. Incuber à des conditions appropriées (par exemple, une nuit à 37 ° C).
  2. Cultiver la culture pendant la nuit.
    1. Choisir un représentant, une colonie isolée de la gélose avec une anse d’inoculation stérile et utilisez-le pour ensemencer 10 mL de milieu de bouillon stérile approprié (par exemple, bouillon trypticase soja).
    2. Laisser l’échantillon atteindre la phase stationnaire dans les conditions appropriées (p. ex., 37 ° C sous agitation à 200 tr/min pendant la nuit dans une fiole conique ventilé-cap, 50 mL).
  3. Cultiver la sous-culture.
    1. Transfert 100 μL de culture nuitée à 10 mL de bouillon stérile fraîche, à l’aide d’une pipette.
    2. Permettent d’atteindre la phase exponentielle/log dans les conditions appropriées (p. ex., 37 ° C sous agitation à 200 tr/min pendant 3 h dans une fiole conique ventilé-cap, 50 mL).
  4. Laver la sous-culture.
    1. Retirez la sous-culture de son milieu d’incubation.
    2. Centrifuger à 4 000 × g pendant 5 min granuler les bactéries.
    3. Aspirer et éliminer le surnageant.
    4. Ajouter 10 mL de sérum physiologique tamponnée au phosphate (PBS) au culot et vortex vigoureusement jusqu'à ce que complètement remises en suspension.
    5. Répétez les étapes 1.4.2 - 1.4.4 deux fois, pour un total de 3 lavages.
  5. Ajuster la concentration de suspension bactérienne.
    1. À l’aide d’un spectrophotomètre qui mesure la densité optique à 600 nm (OD600), mesurer la densité optique de la suspension bactérienne.
    2. Ajouter PBS stérile à la suspension bactérienne jusqu'à ce que la densité optique de l’inoculum tombe à une OD600 de 0,5, à l’aide de l’équation Cj’ai× Vj’ai = Cf× Vf, concentration désignant « C », « V » est volume, «j’ai» est initial, et «f» est définitive. * Cf doit toujours être 0,5 ; Vf est la variable à résoudre.
    3. Si la suspension bactérienne est inférieure à une OD600 de 0,5, le centrifuger à 4 000 × g pendant 5 min pour les bactéries de granule et enlever une quantité appropriée de surnageant à atteindre une OD600 de 0,5.
    4. Effectuer des dilutions dans du PBS stérile (par exemple, trois dilutions au 1/100 pour atteindre 1 × 10-6) et la plaque sur une gélose stérile afin de déterminer le coefficient de corrélation qui révèle la concentration bactérienne en formant des colonies par mL (UFC/mL) une OD600 de 0,5.
      Remarque : La valeur de ce coefficient de corrélation varie pour chaque souche de chaque espèce et doit être déterminée avant la préparation des inoculums pour une infection.
    5. Après avoir déterminé le coefficient de corrélation, utilisez-le pour créer un inoculum de la concentration désirée (par exemple, 2 × 108- 1 × 109 UFC/mL) ; Si l’inoculum souhaitée est supérieure à l' OD600 de 0,5, centrifuger la suspension bactérienne à 4 000 × g pendant 5 min pour les bactéries de granule et enlever une quantité appropriée de surnageant pour atteindre la concentration désirée.
    6. Effectuer en vivo études pilotes afin de déterminer la virulence de chacun des isolats bactériens dans chacune des souches de souris car ces valeurs varient entre les isolats bactériens de la même espèce et de la souris de différentes origines génétiques. Pour diverses espèces Gram-négatifs, le LD100 , chez la souris est généralement 1 à 5 × 108 UFC/souris, bien que certaines souches sont mortels à inoculat inférieur.
  6. Geler les aliquotes identiques pour une utilisation ultérieure comme inoculum sur demande, précis, comme précédemment publiées8 (facultatif).
    1. Préparer 1 L de l’inoculum bactérien comme décrit ci-dessus, transfert à deux fioles coniques de 500 mL et centrifuger à 4 000 × g pendant 5 min.
    2. Jeter les 450 mL du surnageant de chaque fiole conique et remettre en suspension les pellets de bactéries dans le surnageant restant.
    3. Transférer l’inoculum bactérien concentré dans un bécher de 250 mL contenant une barre magnétique remuer et mélanger en continu sur une plaque de remuer à 300 tr/min.
    4. Transvaser avec soin exactement 600 μL d’inoculum bactérien concentré (p. ex., 1 × 1010 UFC/mL) à l’aide d’une pipette de 1,6 mL flacon cryogénique contenant exactement 300 μL de stérile H2O et 300 μL de glycérol stérile ; mélanger et conserver à-80 ° C.
      Remarque : Le glycérol nécessaire à la conservation peut entraîner des résultats expérimentaux et causer surmortalité il est nécessaire de rincer.
    5. Lorsque vous êtes prêt à utiliser, décongeler l’échantillon pendant 10 min à température ambiante.
    6. Transférer 1 mL dans une fiole conique de 50 mL, ajouter 9 mL de PBS stérile et centrifuger à 4 000 × g pendant 5 min granuler les bactéries. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la quantité prédéterminée d’UFC (× 1 mL congelé stock concentration en UFC/mL) dans un volume approprié de PBS pour atteindre la concentration désirée pour l’inoculum infectieux.

2. anesthésier la souris

  1. La kétamine/Xylazine
    Note : Anesthésie à la kétamine/xylazine possède une longue durée, ce qui offre suffisamment de temps pour le chercheur qui est une nouveauté à cette technique pour achever la procédure de l’inoculation, avant que la souris se réveille.
    1. Préparer 10 mL de solution injectable en combinant 8,5 mL de pharmaceutifcal grade PBS, 1 mL de 100 mg/mL de solution mère de kétamine (concentration finale 10 mg/mL) et 0,5 mL de solution mère de Xylazine de 20 mg/mL (concentration finale 10 mg/mL).
    2. Administrer 10 μL/g par injection intrapéritonéale de (IP) (par exemple, 250 μL pour une souris de 25 g).
    3. Pommade ophtalmique aux yeux des souris anesthésiés avec la kétamine/Xylazine parce que leurs yeux ont tendance à endommager lors de périodes prolongées de l’anesthésie.
    4. Placez la souris dans une cage et surveiller jusqu'à ce qu’il se réveille de l’anesthésie.
      Remarque : L’animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
  2. Isoflurane
    Remarque : Souris rapidement réveillent de l’anesthésie induite par l’isoflurane après avoir été retiré de la chambre d’induction, donc cette méthode d’anesthésie ne doit servir qu’après être devenu compétent dans la méthode d’ensemencement.
    1. Placez les souris naïves dans une chambre de taille appropriée induction avec oxygène circulant.
    2. Après que la chambre est fermée scellée, anesthésier les souris à l’aide d’un vaporisateur de précision à ajouter isoflurane à 4 % (v/v) pendant au moins 5 min ; confirmer l’anesthésie en supprimant une souris dans la chambre de l’induction et mesurer combien de temps il faut se pour réveiller de l’anesthésie (~ 60 s).
      Remarque : N’oubliez pas qu’anesthésie la durée peut varier issu des directives institutionnelles et certains animaux peuvent exiger plus de 5 min pour devenir complètement anesthésiés.
    3. Maintenir l’anesthésie jusqu'à 10 min en ajustant la concentration isoflurane à 2-3 % ; Si la durée totale de l’anesthésie est > 15 min, pommade ophtalmique aux yeux de souris anesthésiés.
    4. Placez la souris dans une cage et surveiller jusqu'à ce qu’il se réveille de l’anesthésie, comme à l’étape 2.1.

3. inoculer/infecter des souris

  1. Suspendre une souris anesthésiée, accrochant par ses incisives supérieurs sur une chaîne solide et mince (p. ex., soie dentaire) fixées sur un objet fixe à une hauteur environ deux fois la souris longueur du corps (par exemple, 20 cm) au-dessus de la surface d’exploitation (p. ex. Banc de laboratoire).
  2. Tirez doucement sur la languette de la souris hors de sa bouche à l’aide des pinces stériles, émoussé-terminée. Transférer la langue à un doigt stérile et ganté pour empêcher l’écrasement accidentel de langue de la souris. Tenir la langue en dehors de la bouche, permettant l’accès à l’oropharynx et empêchant d’avaler de l’inoculum sur le côté.
  3. Tout en maintenant la langue de la souris, placez l’inoculum de 50 μL (suspension bactérienne) dans l’oropharynx à l’aide d’une micropipette ; l’oropharynx est situé à la jonction de la cavité buccale et du pharynx vers l’arrière de la bouche.
    Remarque : Il est très important d’offrir seulement liquide en pipettant également, à la première escale de la micropipette. La souris s’arrête de respirer pendant quelques secondes lorsque l’inoculum est placé dans l’oropharynx ; Finalement, aspiration réflexive provoquera la souris à inhaler la suspension bactérienne, indiquée par le bruit de crépitement caractéristique du liquide entrant dans les poumons, qui se traduit par l’infection d’une pneumonie.
  4. Si l’inoculum ne se trouve pas loin de retour suffisant pour bloquer la respiration normale, pincer les narines avec une pince pour forcer réflexive aspiration par la bouche et l’inhalation subséquente de l’inoculum.
  5. Après l’inoculation, la langue de sortie, supprimer la souris de la chaîne de suspension, placez-le dans une cage et surveiller jusqu'à ce qu’il se réveille de l’anesthésie, comme à l’étape 2.1.

4. surveiller la Progression de la maladie

Remarque : En raison de la souffrance des animaux, différents indicateurs devraient être utilisés pour indiquer quand la souris devient moribondes ; l’euthanasie doit être effectuée suite à cette décision, conformément à un protocole IACUC déjà approuvé ; divers marqueurs de moribond comprennent la température du corps, perte de poids, apparence, démarche et autres biomarqueurs qui peuvent provenir du sang (p. ex., par l’intermédiaire d’iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.

  1. Euthanasier les souris selon le protocole IACUC précédemment approuvé (p. ex., CO2 , suivi par dislocation cervicale).
  2. Retirez les poumons de souris euthanasiée en coupant la trachée et artère pulmonaire veine pulmonaire près des poumons.
    1. Microscopie
      1. Placer les poumons (ou partie) dans un moule de spécimen.
      2. Remplissez le moule de spécimen avec température de coupe optimale (PTOM) composé, immerger complètement le tissu.
      3. Congeler les échantillons à-80 ° C.
      4. Envoyez l’échantillon à un laboratoire de pathologie de l’article et monter sur des lames pour la microscopie.
    2. Charge bactérienne
      1. Peser le tissu pulmonaire sur une balance analytique.
      2. Transférer le tissu pulmonaire dans la fiole conique de 50 mL contenant de 2 à 5 mL de PBS stérile (selon la taille du tissu).
      3. Homogénéiser le tissu pulmonaire avec un homogénéisateur de tissu.
      4. Effectuer des dilutions successives de l’homogénat dans du PBS stérile pour atteindre environ 1 000 UFC/mL, basé sur la charge bactérienne attendue dans les poumons.
        1. Par exemple, si 1 × 109 UFC/mg est attendue, effectuer trois dilutions au 1/100 : transfert de 100 μL d’homogénat à 9,9 mL de PBS et vortex ; Il s’agit de la première dilution au 1/100. Transférer 100 μL de la première dilution au 1/100 à 9,9 mL de PBS et vortex ; Il s’agit de la deuxième dilution au 1/100. Transférer 100 μL de la dilution au 1/100 seconde à 9,9 mL de PBS et vortex ; Il s’agit de la dilution de la troisième et dernière au 1/100.
        2. Si on ne connaît pas la charge bactérienne dans les poumons, effectuer une série de dilutions de capturer la plage attendue.
      5. Puits de plaque sur agar stérile.
        1. Préparer stérile Trypticase Soy Broth (BST) avec plaques d’agar (TSA) : Mélanger 30 g de TSB, 15 g d’agar, 1 L d’eau, mélanger avec un agitateur magnétique et chauffer jusqu'à ébullition à ~ 100 ° C pendant 5 min. laisser refroidir et ensuite autoclave sur cycle liquide pendant 15 min. laisser refroidir jusqu'à ~ 55 ° C, transférer 10 mL fraîchement stérilisés à l’autoclave TSA pour boîtes de Pétri stériles et laisser refroidir à température ambiante. Laisser sec sur la table pour 2-5 d ou découvert sous une biosécurité armoire pendant 10 min.
        2. Déposer 100 μl de la dilution dans un Pétri contenant stérile TSA et répartis sur TSA à l’aide d’un épandeur ou verre perles.
        3. Conserver la boîte de Pétri une nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié (c.-à-d., incubateur de 37 ° C contenant un bécher de 1 L découvert rempli d’eau)
      6. Déterminer l’homogénat de poumon CFU/mL basé sur placage d’agar (p. ex., 100 UFC sur gélose TSA avec 100 μL de la troisième et dernière dilution décrite ci-dessus serait de 100 UFC/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
      7. Calculer les tissus pulmonaires CFU/mg basé en divisant l’homogénat poumon CFU/mL par mg poumon homogénat de tissu/mL (par exemple, si exemple décrit précédemment utilisé 100 mg de tissu pulmonaire homogénéisé dans 5 mL de PBS, puis 1 × 109 UFC/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 10-7 CFUs/mg).

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Résultats

En suivant scrupuleusement le protocole, reproductibles et fiable de données peuvent être facilement obtenues. Il est essentiel de se conformer strictement au protocole de préparation inoculum sur mesure pour des expériences à comparer à un autre. Il est également important gérer correctement les souris au cours de la procédure de l’infection. N’oubliez pas de placer la souris dans une chambre d’anesthésie dépourvu isoflurane. Souris vont paniquer si elles sont placées dans une chambre qu...

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Discussion

Pour être sûr, souris ne sont pas les humains miniatures. Résultats obtenus à partir des modèles de souris doivent être pris en considération dans le contexte et interprétés par la suite pour l’applicabilité aux humains, basée sur les différences et les similitudes entre les deux espèces de6. Il est également important de choisir la souche de souris approprié comme certains sont plus sensibles à certaines infections que d’autres ; Il en va de même pour la souche pathogène de choix

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Allergy et des maladies infectieuses au National Institutes of Health [Grant Numbers R01 AI117211 AI130060 R01, R21 AI127954 et AI106375 R42 BS] et nous la Food and Drug Administration [du contrat HHSF223201710199C de BML].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgarBD214530Combiner avec TSB pour fabriquer
billes TSA, du verre borosilicaté135003Stériliser par cuisson ou autoclave avant chaque
utilisation Bécher, 250 mLPyrex1003Utilisé lors de l’aliquotage précis d’inoculums bactériens concentrés
CentrifugeuseSorvallST 40RCapable de 4 000&fois ; g à 4° ; Chambre C
pour l’anesthésieKent Scientific CorporationVetFlo-0720Peut accueillir jusqu’à 5 souris
Cryomold, taille intermédiaireSakura Tissue-Tek4566Moules à échantillons en vinyle jetables, 15&fois ; 15&fois ; Fil dentaire de 5 mm
Oral-B37000469537Attache au poteau stable à environ 6" au-dessus de la hauteur de la table
PinceVWR82027-440Utilisée pour retirer doucement la langue de la bouche de la souris
Homogénéisateur pour tissu pulmonaireOmni InternationalTM125-115Autoclave avant la première utilisation ; rincer entre les échantillons
Isoflurane pour l’anesthésieAbbott10015516Une drogue alternative peut être utilisée ; modifier la procédure en conséquence
Cartouche iSTATAbbott03P79-25Diverses cartouches sont disponibles pour répondre à vos besoins
Kétamine, 100 mg/mLWestern Medical Supply4165Diluer 1:10 dans du PBS à 1 mg/mL et combiner avec de la xylazine à 1 mg/mL
Pommade pour les yeuxLarmes d’akornRenouveléeÉviter de toucher l’œil avec l’embout du distributeur
Température de coupe optimale (O.C.T.) ComposéFisher Scientific23-730-571Utilisé pour congeler des échantillons de poumons à -80 ° ; C pour préparer la coupe pathologique Boîte de
PétriVWR25384-302Polystyrène, jetable, stérilisé, 100&fois ; 15 mm
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Corning21-031-CMDulbecco’s PBS sans calcium et magnésium Pointes
pipette, 200-&mu ; LVWR10017-044Autoclave avant utilisation
Pipette, 200-&mu ; LGilsonPipetman P200Autoclave et calibre avant utilisation
Épandeur, cellule bactérienneBel-ArtF377360006Stériliser par cuisson ou autoclave avant chaque utilisation
Barre d’agitation, magnétique, 7,9 mm Diamètre & fois ; 38,1 mm LongueurVWR58948-150Utilisé pour l’agitation d’inoculums bactériens concentrés lors de l’aliquotage
Plaque d’agitation, Corning magnétiquePC-620DUtilisé pour l’agitation d’inoculums bactériens concentrés lors de l’aliquotage Bouillon
soja tryptique (TSB)BD211822Combiner avec de la gélose pour fabriquer un flacon TSA
, conique, stérile, 50 mLCorning431720Utilisé pour préparer un inoculum bactérien
Flacon, conique, stérile, 500 mLCorning431123Utilisé pour concentrer l’inocula pour la préparation d’inocula congelé
Flacon, cryogénique, 2,0 mLCorning430659Utilisé pour le stockage cryogénique de l’inoculum bactérien concentré
Xylazine, 20 mg/mLAkornAnaSed InjectionDiluer 1:20 dans du PBS à 1 mg/mL et combiner avec de la kétamine à 1 mg/mL
des de de

Références

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