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Article de méthode

Label-free Neutrophil enrichissement de sécrétion Patient provenant des voies respiratoires à l’aide de la boucle fermée Microfluidics inertiel

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DOI :

10.3791/57673

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7 juin 2018

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1Research Laboratory of Electronics, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Medicine, University of Pittsburgh, 4Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 5Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh

Dans cet article

Résumé

Dans cette recherche, nous démontrons une méthode de séparation neutrophiles exempte d’étiquette de sécrétions des voies respiratoires clinique utilisant opération de boucle fermée de spirale microfluidics inertiel. La méthode proposée élargirait les essais cliniques in vitro pour diverses maladies respiratoires.

Résumé

Les sécrétions des voies aériennes contiennent un grand nombre de cellules immunitaires, par exemple, les neutrophiles, les macrophages et lymphocytes, qui peuvent être utilisés comme une ressource majeure pour évaluer une variété de maladies pulmonaires, tant pour la recherche et à des fins cliniques. Toutefois, en raison de la nature hétérogène et visqueuse de mucus patients, il n’y a actuellement aucune méthode fiable de dissociation qui n’endommage pas les cellules immunitaires de l’hôte dans la sécrétion bronchique patients. Dans cette recherche, nous présentons une méthode de préparation d’échantillon qui utilise microfluidics inertiel pour évaluation immunitaire du patient. Quelles que soient les propriétés fluidiques hétérogènes des échantillons cliniques, la méthode proposée remet plus de 95 % de neutrophiles d’échantillons de sécrétion des voies respiratoires qui sont dilués 1000 avec millilitres de solution saline propre. Par recirculation le flux de sortie concentrée vers le réservoir de l’échantillon initial, une forte concentration, la récupération et la pureté des cellules immunitaires sont fournis ; recirculation est considéré comme un compromis à l’opération d’axée sur la seringue unique-run de microfluidique inertielle. L’opération de boucle fermée de spirale microfluidics fournit des leucocytes sans perturbation physique ou chimique, comme en témoigne le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)-induite par le communiqué de l’élastase des neutrophiles triés.

Introduction

Étant donné que les cellules sont encapsulées dans une grande quantité de mucus dans les sécrétions des voies respiratoires, l’évaluation fonctionnelle des leucocytes par un test in vitro a été entravée. Le dithiothréitol (DTT) est la plus courant tampon de lyse à dissocier et homogénéiser les crachats pour analyse cytologique et la détection des médiateurs tout en assurant la viabilité tolérable de cellules isolées1,2. Cependant, DTT peut interférer avec les antigènes de surface-bondissent des neutrophiles des voies respiratoires, entraînant l’interruption des neutrophile fonction telles que l’élastase et la myéloperoxydase (MPO) version2,3. Par conséquent, peu d’études sur les neutrophiles fonction pulmonaire humain ont été menées avec les neutrophiles circulants, qui peuvent ne pas révéler les caractéristiques physiologiques de pulmonaire4. Pendant ce temps, microfluidique inertielle a progressé à isoler les cellules de différents patients biomatrices5,6. L’équilibre entre les forces de levage inertiel et Dean drag aligne la particule/cellule selon leur taille, qui permet la séparation de particules libres label7. Notre groupe précédemment introduit une méthode de préparation d’échantillon pour faire circuler la tumeur cellules8,9, les agents pathogènes dans le sang8, les cellules une suspension culture10,11, 12et polynucléaires (PN) du sang13,14.

Ici, nous introduisons un protocole visant à préparer les cellules immunitaires dans les sécrétions des voies aériennes du patient à l’aide de boucle fermée microfluidics inertiel pour un dosage en aval in vitro , tels que l’essai de l’élastase neutrophile (NE). Cette méthode fournit la forte concentration et récupération, surtout quand il y a un chevauchement significatif dans le sens latéral de la cellule/particule dont la cellule/particule d’intérêt doit être enlevé, qui est fréquemment observé dans les échantillons cliniques. Par la paroi intérieure (IW) de recirculation-axé sur les grosses particules ou cellules vers le tube d’échantillonnage en entrée, la particule ou cellule d’intérêts concentrés dans le réservoir d’origine, tandis que les fluides de fond avec des agrégats de mucine petits traversent le réservoir de déchets. Malgré les propriétés fluidiques hétérogènes d’échantillons cliniques, la méthode proposée récupère constamment au-dessus de 95 % des neutrophiles, des échantillons de sécrétion des voies respiratoires qui sont dilués 1000 avec une solution saline propre (~ 1 mL). En revanche, la méthode de lyse propose une large gamme de PMN taux de recouvrement selon l’état de l’échantillon. La proposition de protocole capture des leucocytes dans une manière sans étiquette sans perturbation physique ou chimique, qui prévoit la possibilité de récolter des cellules délicates de contester cliniquement biométrie aux procédures minimalement invasives.

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Protocole

Le prélèvement des échantillons a été approuvé par l’Université de Pittsburgh Institutional Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Toutes les expériences sont réalisées sous une armoire avec les équipements de protection individuelle approprié de biosécurité.

1. dispositif Fabrication et la lithographie douce

NOTE : Lithographie douce Standard techniques15,16 ont servi à créer le MICROCANAL polydiméthylsiloxane (PDMS).

  1. Mélanger le précurseur PDMS dans un rapport de 10:1 de base et polymérisation agent.
  2. Verser 30 g du mélange PDMS précurseur sur le moule en aluminium micro-usinés (voir Figure 1 pour les dimensions) et 20 g de mélange PDMS précurseur sur le 100 mm boîte de Pétri.
    Remarque : La boîte de Pétri est utilisé pour faire le film épais de PDMS (~ 3 mm) pour la couche de support. La couche de support du PDMS fournit des propriétés de surface physiques uniformes tout au long de la microfluidique. Par ailleurs, une fine pellicule PDMS sur la lame de verre peut être utilisée. Le moule principal avec des dimensions de canal spécifique a été conçu et fabriqué par micro-fraisage sur la feuille d’aluminium. Le canal de spirale utilisé dans cette étude était une microchannel 8-boucle spirale avec une entrée et deux sorties, dont le rayon augmente de 8 mm à 24 mm pour une séparation efficace axée sur les entreprises.
  3. Placez le moule et le plat de Pétri dans un dessiccateur à vide pour dégazer jusqu'à ce qu’aucune bulle n’est visibles sur la surface, généralement de 5 à 10 min. utiliser un chambre à vide pour le dessiccateur.
  4. Libérer le vide et placer le moule et le plat de Pétri dans un four à 90 ° C pendant 1 h.
    Remarque : Une plaque chauffante ou autres outils de chauffage peuvent être utilisés au lieu d’un four.
  5. Retirer le moule et le plat de Pétri du four et laisser refroidir à température ambiante pendant 10 min.
  6. Soigneusement découper le contour et percez les trous d’accès fluide sur le périphérique à l’aide d’un perforateur de 2 mm.
    Remarque : La taille du poinçon peut varier selon la taille du guide tube ou fluide.
  7. Collez une bande pour le côté du chenal de l’appareil et la pellicule de PDMS et peler soigneusement avec une pince pour enlever la poussière.
  8. Traiter les deux le côté du chenal de l’appareil et le PDMS plain air plasma et lien avec la couche de support préparée de plaine PDMS (Figure 1 a).
  9. Placez le jeton sur la lame de verre de 50 mm x 70 mm et le placer dans un four à 70 ° C pendant au moins 30 min renforcer la force de liaison.

2. Collection de sécrétion trachéale chez les Patients sous ventilation mécanique

NOTE : Sécrétions trachéales peuvent être obtenues chez des patients sous ventilation mécanique pendant les soins des voies respiratoires courantes normales en utilisant un protocole modifié de méthodes conventionnelles pour accueillir le patient ventilé standard, adult. Des échantillons ont été rendus anonymes et envoyés immédiatement à la transformation.

  1. Aspiration trachéale est indiquée, utiliser un cathéter pour extraire les sécrétions des voies aériennes.
  2. Avancez la sonde soigneusement à mi-chemin dans le tube endotrachéal et instiller 5 mL de 0,9 % du sérum physiologique d’une seringue préremplie de 10 mL.
  3. Lorsque le cathéter est avancé entièrement ou résistance est rencontrée, aspirer les sécrétions et la recueillir dans un récipient de collecte des expectorations stérile.
  4. Collecter 10 mL des sécrétions trachéales dans un récipient stérile expectorations et placez-le sur la glace. Envoyer des échantillons immédiatement pour le traitement.

3. préparation d’échantillons de sécrétion trachéale

Remarque : Toutes les expériences doivent être exécutés sous une meuble avec les équipements de protection individuelle approprié de biosécurité.

  1. Disperser, 1 mL d’échantillons de sécrétion bronchique dans 9 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une seringue en plastique de 10 mL (pour une dilution de 10 x). Utiliser une pipette émoussée pour homogénéiser l’échantillon de mucus.
  2. Le diluant de la souche avec une passoire de cellule en nylon de 40 µm pour enlever les gros morceaux ou des caillots de sang, qui peuvent bloquer le trou d’accès de microfluidique ou le canal. Placer l’échantillon sur la glace après le traitement.
  3. Disperse le diluant de l’échantillon à l’aide d’un volume de 100 x de tampon PBS, résultant en un 1000 x suspension diluée. Placer l’échantillon sur la glace lors de l’opération entière de dissociation.

4. expérimental

Remarque : Toutes les expériences doivent être exécutés sous une meuble avec les équipements de protection individuelle approprié de biosécurité.

  1. Assembler la puce PDMS avec le guide fluide d’appliquer l’écoulement uniforme à chacun des microcanaux quatre spirale (Figure 1 b).
    Remarque : Quatre canaux ont été utilisés pour augmenter le débit de parallélisation, ainsi que l’optimisation de la densité cellulaire et de volume de la suspension qui en résulte. Le guide de fluide est conçu et fabriqué avec une imprimante 3D de type stéréolithographie avec résine transparente. L’entrée et l’orifice de sortie du fluid guide utilisent des raccords Luer femelles pour faciliter la connexion et étanchéité stable pendant l’opération.
  2. Branchez un raccord Luer mâle de 1/16 de pouce à l’entrée, la sortie de la paroi interne (IW) et l’orifice de sortie du mur extérieur (OW) du guide fluid et un tube en silicone à la suspension de l’échantillon.
  3. Insérer des conseils émoussés à chaque extrémité de l’entrée et les points de vente pour atteindre le fond du réservoir échantillon.
  4. Branchez la pompe péristaltique avec le tuyau d’arrivée.
  5. Placer l’extrémité du tuyau d’arrivée et tube de sortie IW dans le réservoir de l’échantillon et placer l’extrémité de la tubulure de sortie OW dans le réservoir de déchets (Figure 1, D).
  6. Placer le tube de 50 mL de PBS filtrée sans calcium et de magnésium dans le réservoir de l’échantillon.
  7. Commencer à un faible débit (~ 1 mL/min) pour amorcer le dispositif de pompage.
    Remarque : Lorsque les bulles sont capturées dans le canal, appuyez sur la partie supérieure du canal avec la pince à déstabiliser et à éliminer les bulles d’air. Lorsque l’appareil est entièrement rempli de solution tampon, changer le tube de PBS pour préparer le tube d’échantillon de sécrétion bronchique.
  8. Lorsque l’échantillon est placé dans le réservoir de l’échantillon, mettre en marche la pompe péristaltique et régler le débit à 4 mL/min (Figure 1, D).
  9. Lorsque le volume de l’échantillon atteint le volume désigné (~ 1 mL), l’arrêter et débrancher le tuyau de silicone.
    Remarque : La méthode proposée est plus efficace pour réduire un volume important de diluant (> 50 mL) dans un volume de tube à centrifuger-micro (~ 1 mL) (Figure 2).

5. analyse en cytométrie en flux

Remarque : Pour comparer les méthodes de dissociation (microfluidique et lyse), cytométrie de flux avec l’immunofluorescence a été utilisé.

  1. Ajouter l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) - anticorps monoclonal de souris conjugués anti-humain CD66b et allophycocyanin (APC) - conjugué anti-human CD45 anticorps monoclonal de souris aux suspensions initiales (étape 3.3) et des suspensions qui en résulte (étape 4,9) (200 µL des doses d’anticorps) dans une proportion de 01:25 v/v.
  2. Incuber les échantillons à 4 ° C dans l’obscurité pendant 30 min.
  3. Analyser les deux échantillons sur un cytomètre en flux pour quantifier l’APF.
    NOTE : La population positive double FITC-APC, CD66b positive et positive de CD45 était censée être neutrophiles. Récupération a été calculée par le rapport entre le total du nombre de cellules de l’entrée et la suspension qui en résulte.

6. NE version analyse

Remarque : Pour comparer les fonctionnalités de l’isolé neutrophiles par la méthode microfluidique et lyse, un kit de dosage NE servait.

  1. Ajouter des PMA (fourni dans le kit de test) à chaque suspension qui en résulte (obtenue à l’étape 4,9) à une concentration finale de 50 nM.
  2. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 2 h.
  3. Centrifuger les suspensions à 300 x g pendant 10 min.
  4. Transférer 10 µL de chaque surnageant dans une plaque à 96 puits (fournie dans le kit de dosage).
    Remarque : Une microplaque 96 puits avec un fond plat et le polystyrène noir peut être utilisée aussi bien.
  5. Ajouter 90 µL de tampon dilué (fourni dans le kit de dosage) dans chaque puits.
  6. Ajouter 10 µL de substrat élastase (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, fourni dans le kit de dosage).
  7. Incuber pendant 1,5 h à 37 ° C.
  8. Lire la plaque à 96 puits à l’aide d’un fluorimètre à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 525 nm.
    Remarque : Le niveau de NE a été divisé par le nombre PMN de l’analyse de cytométrie de flux.

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Résultats

Nous avons réalisé des suspensions de cellules immunitaires transparentes avec les deux DTT mucolysis et microfluidique dissociation (Figure 3 a). Microfluidique dissociation recueillies 4,40 x 105 PN en moyenne (2.1 x 104 à 5,60 x 105 PN, n = 6) des voies aériennes sécrétion échantillons dilués 1000 (volume total de 50 mL) dans 1 mL de suspension propre. Par rapport au diluant initial, 94,0 % PN (CD66b+/CD45+<...

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Discussion

En microfluidique inertielle, particules et cellules localiser à une certaine position latérale dans une micro-chaîne basée sur leur taille5,18,19,20. En raison de l’effet combiné du doyen glisser la force et la force inertielle ascenseur à microcanaux incurvé, grosses particules ou neutrophiles (> 10 µm) sont situés à l’intérieur du canal et petites particules, agrégats de mucus et les débris ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont déposé une demande de brevet sur la technologie décrite ici.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par NIH/NIAID (R21AI119042) ainsi que du programme de test de NIH U24 échantillon épargnant (U24-AI118656).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Précurseur PDMSDow corning184 SIL ELAST KIT 3.9KGRapport 10:1 de base et d’agent de durcissement
VWR four à convection par gravité VWR414005-128Précurseur PDMS à durcir à 90 °.
Boîte de Pétri 100mmVWR89000-324Fabrication de PDMS Couche de support
Harris Uni-core puncherSigma-aldrichWHAWB1000762mm de diamètre ou autre selon la taille du tube
Machine à plasma d’airFemto Science CuteTraitement au plasma de surface pour dispositif PDMS à la base inférieure.
Diapositive en verre 2 » x 3 »TED PELLA, INC.2195Pour prendre en charge le dispositif PDMS
Tube en silicone durci au platine Masterflex, L/S 14Cole-ParmerEW-96410-14Tube pour microfluidique et pompe péristatique
Connecteur Luer 1/16 pouce,appareil HarvardPC2 72-1443Connecteur pour guide de fluide
50mL Tube FalconCorning21008-940prélèvement et préparation
d’échantillonsSaline tamponnée au phosphate, 1X sans calcium ni magnésiumCorning45000-446  ;Solution tampon pour diluer l’échantillon
Halyard Cathéter d’aspiration fermé, coude, 14F/ canal 4.67mmHALYARD HEALTH22113Cathéter d’aspiration de sécetion trachéale
0.9 % Stérile Normal salin, seringue préremplie de 10mLBD PosiFlushNHRIC : 8290-306547Pour le prélèvement de sécetion trachéale chez les patients
SecurTainer&trade ; III Récipients pour échantillons, 20 mlSimport1176R36Récipient stérile pour le prélèvement d’expectorations (sécrétions respiratoires)
Seringue avec embout Luer-Lok, 10 mlBDBD309604Pour pipette, homogénéiser l’échantillon de mucus et atteindre le fond du tube d’échantillon
BD  ; Aiguille de remplissage émoussée, avec BD Luer-Lok  ; AstuceBD: Pour pipette, homogénéiser l’échantillon de mucus et atteindre le fond du tube d’échantillon
40µ ; crépine à cellules en nylon M  ;Falcon21008-949Pour éliminer les gros morceaux ou les caillots sanguins, qui peuvent bloquer le trou d’accès à la microfluidique ou le canal.
Pompe péristaltique (entraînement numérique Masterflex L/S)Cole-ParmerHV-07522-30Fonctionnement de la microfluidique
Cytomètre en flux BD LSR II DBCytomètreflux LSR IIQuantification du taux de récupération cellulaire
Souris conjuguée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) Anticorps monoclonal CD66b humainBD Bioscience561927Immunomarquage des neutrophiles pour l’analyse par cytomètre en flux
Souris conjuguée à l’allophycocyanine (APC) Anticorps monoclonal CD45 humainBD Bioscience561864Immunomarquage des neutrophiles pour l’analyse par cytomètre
en flux Lecteur de plaques ThermoFisherscientific VarioskanLecteur de plaques pour le dosage de l’élastase des neutrophiles, ex485/em525
Kit de dosage de l’élastase des neutrophilesCayman Chemical600610Évaluation de la fonctionnalité des neutrophiles
Fluoresbrite YG Microsphères 10.0µ ; mPolyScience, Inc.18140-2Particules fluorescentes pour exprimer la trajectoire des globules blancs en microfluidique
mâle en

Références

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