Nous présentons ici un protocole pour tester la virulence de la plante avec le phytopathogène Magnaporthe grisea. Ce rapport contribuera au dépistage à grande échelle des pathotypes d’isolats de champignons et servir de point de départ idéal pour la compréhension des mécanismes résistants des plantes au cours de la sélection moléculaire.
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Article de méthode
Le Test de Infection de plantes : Spray et induite par la plaie de l’Inoculation avec la plante pathogène Magnaporthe Grisea
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Résumé
Résumé
Les plantes possèdent un système puissant pour se défendre contre d’éventuelles menaces de champignons pathogènes. Pour les plantes agricoles importantes, cependant, les mesures actuelles pour lutter contre ces agents pathogènes ont prouvé trop conservateurs et, ainsi, pas suffisamment efficace et ils peuvent potentiellement poser des risques environnementaux. Par conséquent, il est extrêmement nécessaire identifier les facteurs de résistance de l’hôte pour aider au contrôle des maladies des plantes naturellement par le biais de l’identification du matériel génétique résistant, l’isolement et caractérisation des gènes de résistance et la sélection moléculaire des cultivars résistants. À cet égard, il y a besoin d’établir une méthode d’inoculation précise, rapide et à grande échelle pour se reproduire et de développer des gènes de résistance des plantes. Le riz souffle champignon pathogène Magnaporthe grisea causes symptômes sévères de la maladie et les pertes de rendement. Récemment, M. grisea est devenu un organisme modèle pour étudier les mécanismes des interactions plante-pathogène. Par conséquent, nous présentons l’élaboration d’une méthode de test de virulence de plante qui est spécifique pour m.grisea. Cette méthode fournit pour l’inoculation de pulvérisation avec une suspension de conidies et blessant l’inoculation avec cubes de mycélium ou gouttelettes de suspension de conidies. L’étape clé de la méthode d’inoculation blessant pour les feuilles de riz détaché est de faire des plaies sur les feuilles de la plante, qui évite toute interférence causée par la résistance à la pénétration hôte. Ce spray/blessant protocole contribue au dépistage rapid, précis et à grande échelle des pathotypes de m.grisea isolats. Cette intégrée et méthode d’infection systématique des plantes servira de point de départ idéal pour gagner une large perspective de questions en phytopathologie.
Introduction
Pyriculariose, causée par M. grisea, est l’une des maladies plus graves pour les variétés de riz dans le monde1,2. Le processus par lequel M. grisea infecte les plantes hôtes comprend une production de conidies et l’attachement de surface, une germination des conidies et la formation de l’appressorium, une formation de l’hyphe de pénétration et de différenciation de l’hyphe infectieux, et la propagation d’une maladie 3. toutes ces étapes sont communs dans de nombreux autres champignons phytopathogènes, et, en effet, un blocus de n’importe quelle étape unique empêche l’infection des plantes hôtes. En raison de son importance économique et de la traçabilité génétique, m.grisea est devenu un organisme modèle pour étudier les mécanismes de la plante-champignon pathogène des interactions1,4. Par conséquent, étudier la base moléculaire de ces stades de développement de m.grisea aidera à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénicité fongique et l’identification des gènes de cible de candidats pour le dépistage et le roman de conception 5de fongicides.
Les rapports récents concernant M. grisea infection ont mis l’accent sur les mécanismes moléculaires des stades avant la pénétration, surtout la conidiation, la formation de l’appressorium, les hyphes de pénétration et la croissance infectieuses3, 6. par conséquent, il est essentiel d’élaborer un protocole détaillé pour tester l’infection de M. grisea . Ici, nous présentons une méthode détaillée pour un test de l’infection qui utilise des tests d’infection véhiculée par pulvérisation avec une suspension de conidies et l’inoculation des plaies avec des bouchons mycéliennes de m.grisea. Dans ce rapport, le protocole met l’accent sur la culture des souches, la préparation de la solution de la conidiation pour la pulvérisation et l’inoculation mycélienne d’induite par la prise de plantes avec M. grisea. Ces étapes sont décrites en détail ci-dessous et une vue schématique montrant l’intégralité du workflow de la méthode et une lésion typique sont présentés aux Figures 1 et 2, respectivement.
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Protocole
1. vaporiser l’Inoculation avec une Suspension de conidies de M. grisea
-
Culture fongique pour M.grisea
- Préparer le milieu de culture de gruau tomate agar (OTA) pour des souches fongiques.
- Peser de 30 à 50 g de flocons d’avoine, ajouter ceci à 800 mL d’eau distillée (ddH2O) et faites bouillir le mélange pendant 30 min dans la marmite électrique.
- Filtrer le jus d’avoine bouillis dans le bécher dans un morceau de gaze.
- Ajouter 150 mL de jus de tomate et 20 g d’agar au filtrat dans le bécher et ajouter ddH2O à 1 000 mL.
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Préparation de matériel expérimental
- Faire tremper environ 50 graines du cultivar de riz (Oryza sativa) Lijiangxintuan-heigu (LTH) FD2O 3 d ou tremper environ 50 graines d’orge (Hordeum vulgare cv Golden Promise) FD2O pour environ 1 d.
- Envelopper les graines de riz ou d’orge dans de la gaze humide et elles germent sur papier filtre humide dans environ 30 boîtes de Pétri avec un diamètre de 10 cm x 10 cm à 28 ° C. Le temps de germination de semences de riz est environ 2-3 jours, le temps de germination des semences orge est environ 2 d. L’humidité relative dans la serre est d’environ 70 %.
- Planter les semis du riz ou orge dans des pots à l’aide de terreau stérilisé et l’arrosage et puis recouvrir d’une couche de vermiculite.
- Placez les plantes dans une serre adaptée ou la croissance du cabinet à 25 ° C pour environ 1 ~ 2 semaines.
- Couper 3 couches de papier filtre en rond avec des ciseaux chirurgicaux stériles (chaque cercle devrait avoir un diamètre de 8 cm) et les placer sur des plaques en plastique stérile de 100 mm.
- Ajouter ddH2O à chaque plat à tremper le papier filtre.
- Assurez-vous que le papier filtre est complètement humide mais pas ajouter plus d’eau.
- Enlever tout excédent d’eau avec une pompe à vide.
- Placer 2 cure-dents stériles dans la boîte de Pétri pour soutenir le riz/orge des feuilles ; espace les cure-dents ~ 2-3 cm de distance.
- Recueillir les feuilles du riz 2 semaines après le semis des graines ou prendre les feuilles de l’orge 7D après le semis des graines.
- À l’aide de 4 à 6 feuilles plants de riz et d’orge, couper la partie inférieure de la tige à environ 5 cm du haut et de recueillir les feuilles.
-
Protocole de l’inoculation de pulvérisation
- Culture de la souche fongique sur plaques d’OTA dans une étuve thermostatique (25 ° C) pendant environ 4 jours.
- Ajouter environ 2 mL de ddH2O à l’aide d’une pipette de 5 mL pour chaque plaque âgés de 4 jours - de 0,5.
- Avec une boucle de l’inoculation, racler le mycélium de la souche sauvage de m.grisea et la souche mutante dans les débris de mycélium.
- Recueillir les débris de mycélium et la transférer à une nouvelle plaque d’OTA. Prendre les débris de mycélium et coup sec dans le banc propre.
- Couvrir la plaque avec 3 couches de gaze pour assurer l’humidité nécessaire à la croissance des conidies dans une serre à 25 ° C dans la journée (14 h) et 23 ° C dans la nuit (10 h) pendant 24 à 48 heures.
- Ajouter 2 mL de ddH2O à chaque plat et gratter les conidies doucement avec des tampons de coton stérile suivies d’une filtration par le biais de 2 couches de papier de la lentille. Veillez à ne pas rayer la surface du milieu de culture.
- Transférer la suspension de conidies dans un nouveau tube de 50 mL avec une pipette µL 100-1 000.
- Centrifuger pendant 5 min à un minimum de 5 000 x g à 25 ° C.
- Retirez le surnageant et Resuspendre le culot pour donner 2 x 104 conidies / mL dans un 0.025 % (v/v) de Tween-20 solution. La solution de Tween-20 est généralement environ 10-20 mL.
- Versez la suspension de spores dans un pulvérisateur à main.
- Spay environ 10 mL de la suspension de conidies sur les feuilles de riz de plants de riz âgés de 2 semaines ou d’orge feuilles de plantules d’orge âgés de 7 jours et les incuber à 25 ° C dans une chambre sombre et humide pour ~ 24 h. Spray les plantes de contrôle avec le 0.025 % (v/v) de Tween-20 solution.
- Transférer les feuilles dans une autre chambre humide sous lumière fluorescente à 25 ° C pour une photopériode de 12 h.
- Enregistrer les symptômes de la maladie à 5 jours après l’inoculation. Examiner les lames de riz et d’orge malades de ~ 6 cm de longueur. L’évaluation standard selon le système de notation pour la résistance aux explosions de l’Institut International de recherche riz (IRRI). Les détails du système de notation pour résistance aux explosions figurent au tableau 1.
- Photographier les feuilles afin d’évaluer l’infection des souches testées. L’infection a été évaluée par le nombre de lésions par 3,6 cm2.
2. blessures Inoculation avec Cubes de mycélium ou gouttelettes de conidies Suspension de m.grisea
- À l’aide d’une aiguille anatomique, gratter les trois plaies de long de 2-3 cm dans les nervures principales des feuilles de riz et d’orge détaché ; prendre soin de ne pas pénétrer dans les feuilles.
- Mettre les feuilles grattées sur cure-dents et pulvériser un 0,02 % (v/v) de Tween-20 solution sur les feuilles pour former une couche de gouttelettes.
- Une plaque d’OTA, coupez une fiche mycélienne de 0,5 cm x 0,5 cm pour chaque souche de M. grisea (souches de type sauvage, mutant, complément, ou d’autres souches de test).
- Mettre les bouchons de mycéliums ou 25 gouttes µL de suspension de conidies sur les blessés laisse et incuber les feuilles à 25 ° C dans une chambre humide pendant 3 à 8 jours.
- Examiner les lésions à après l’inoculation de 5-7 d. La méthode d’examen est le même que c’était pour la méthode de l’inoculation de pulvérisation (voir étape 1.3.13).
- Examiner les lames de riz et d’orge malades de ~ 6 cm de longueur et photographier afin d’évaluer l’infection des souches testées. L’infection a été évaluée par le nombre de lésions par 3,6 cm2.
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Résultats
L’intégralité du workflow pour la technique est illustré à la Figure 1. Les dosages d’infection de plantes ont été effectuées sur des semis de riz sensibles âgés de 14 jours (o. sativa cv CO-39) ou laisse vulnérable âgés de 7 jours l’orge (H. vulgare cv Golden Promise)7,8,9. Pour tester une infection sur les feuilles de riz, une suspension de conidi...
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Discussion
Plante, gènes de résistance jouent un rôle essentiel dans la prévention des infections par des agents pathogènes, y compris les champignons pathogènes1,12. Pyriculariose a été utilisé comme modèle pour comprendre la nature de la structure des populations pathogènes et d’identifier la plante de gènes résistance4. Par conséquent, il est nécessaire d’examiner le génotype de résistance aux maladies et génotypes d’avirulence des principales var...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le projet spécial de la recherche scientifique de l’Université de l’Agriculture de Pékin (YQ201603) et le projet scientifique du Comité éducatif de Pékin (KM201610020005).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Papier filtre | de la marque GE Healthcare(Suède) ; | ||
| tube de 50 mL | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifugeuse | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Plat de culture | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| pipette de 0,5-5 mL | Eppendorf | ; | |
| 4920000105 Pipette 100-1000uL | Eppendorf | 4920000083 | |
| Pompe à vide | Leybold | D25B | |
| Aiguille de dissection | FST | 26000-35 | |
| Incubateur | MEMMERT | PYX313 | |
| Anneau d’inoculation | Greiner Bio One 731175 |
Références
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Réimpressions et autorisations
