Nous décrivons ici une méthode pour séparer et enrichir les composants du microenvironnement tumoral immunitaire et non immuns dans les tumeurs sous-cutanées établies. Cette technique permet l’analyse distincte d’infiltrat immunitaire de tumeur et fractions de tumeur non immuns qui peuvent permettre la caractérisation complète du microenvironnement immunitaire de la tumeur.
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Article de méthode
Enrichissement et la caractérisation des tumeur immunitaire et Non immuns micro-environnements dans les tumeurs murines sous-cutanée établis
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Microenvironnement immunitaire de tumeur (temps) a récemment été reconnu comme un médiateur essentiel de la réponse au traitement dans les tumeurs solides, surtout pour les immunothérapies. Récents progrès cliniques en immunothérapie soulignent la nécessité de méthodes reproductibles avec précision et bien caractériser la tumeur et son infiltrat immune associée. Digestion enzymatique de tumeur et cytométrie permettent large caractérisation de nombreux sous-ensembles de cellules immunitaires et les phénotypes ; Cependant, profondeur d’analyse est souvent limitée par des restrictions de fluorophore sur planche de bord et la nécessité d’obtenir des échantillons de grande tumeur d’observer les rares populations immunitaires d’intérêt. Ainsi, nous avons développé une méthode efficace et haut débit de séparation et d’enrichir l’infiltrat immunitaire de tumeur des composants non immuns tumeur. La digestion de la tumeur décrit et séparation centrifuge axée sur la densité technique permet distincte caractérisation de la tumeur et tumeur immunitaires infiltrant fractions et préserve la viabilité cellulaire et offre donc une large caractérisation de la tumeur État immunologique. Cette méthode a été utilisée pour caractériser la vaste abri l’hétérogénéité spatiale des tumeurs solides, qui démontre également la nécessité pour les techniques de profilage immunologiques compatibles toute tumeur. Dans l’ensemble, cette méthode fournit une technique efficace et adaptable pour la caractérisation immunologique de sous-cutanée tumeurs murines solides ; à ce titre, cet outil peut servir à mieux caractériser les fonctions immunologiques tumorales ainsi que l’évaluation préclinique de nouvelles stratégies d’immunothérapie.
Introduction
Le temps suppressif a récemment été reconnu comme une caractéristique du cancer et est connu pour jouer un rôle important dans le développement, la progression et la protection des cancers de tumeur solide mais aussi atténuer leur sensibilité à l’immunothérapie1. Le temps est composé de nombreux sous-ensembles cellulaires et les phénotypes, qui donnent un aperçu critique de l’État immunologique de la tumeur. Ces sous-ensembles immunologiques peuvent être encore divisés en cellules lymphocytaires ou origine myéloïde, qui constituent la majorité des réponses immunitaires innée et adaptative2,3. Les progrès récents dans le domaine de l’immunothérapie des cancers ont montré que des stratégies immunothérapeutiques (c.-à-d., les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire, récepteur de l’antigène chimérique T-cellules, etc.) sont susceptibles de provoquer le cancer durable régressions ; Cependant, ils restent relativement inefficaces dans les tumeurs solides cancer4,5. Plusieurs groupes ont montré l’obstacle essentiel que le temps peut jouer sur traitement succès6,7, et par conséquent, il reste nécessaire d’évaluer avec précision les nouvelles immunothérapies dans le paramètre préclinique en se concentrant spécifiquement sur leur capacité à moduler ou à surmonter le temps8.
Les efforts actuels pour caractériser le temps généralement utilisent soit la microscopie ou cytométrie avec anticorps étiquetage des stratégies pour identifier les sous-ensembles cellulaires immunitaires et leurs caractéristiques9,10. Ces deux stratégies fournissent des informations particulièrement bien différentes, comme la microscopie permet de reconnaissance spatiale des sous-ensembles cellulaires et cytométrie offre un débit élevé et une quantification plus large des changements cellulaires. Malgré les améliorations récentes en immunohistochimie multiplexe fluorescent, optimisation des systèmes d’imagerie spectrales, qui maintenant peuvent prendre en charge jusqu'à 7 paramètres, taille du panneau limité est difficile niveau large abri de profilage et cette technique est donc souvent réservé aux plus axé sur les analyses. En conséquence, cytométrie de flux reste l’un du plus largement utilisé immunitaire techniques de profilage. Malgré son utilisation répandue dans la caractérisation de l’époque, les méthodes utilisées pour le traitement et la coloration sont très variables. Le plus souvent de protocoles utilisent une tumeur dissociation enzymatique (c.-à-d., collagénases, DNase, etc.) et méthodes de dissociation manuel pour réaliser des suspensions de cellules individuelles, suivie d’anticorps coloration et analyse7. Malgré les avantages de chaque méthode, plusieurs groupes ont montré la variabilité importante qui peut être induite par le biais de ces techniques11. Cela rend les comparaisons de croix-étude du profilage de microenvironnement tumoral extrêmement difficile, même lors de l’évaluation le même modèle de tumeurs murines. En outre, ces méthodes fournissent un potentiel limité pour évaluer la tumeur cellulaire et immunitaire tumeur infiltrer composants séparément, étant donné que les deux composants sont intercalés après digestion. Quantité d’échantillon limite puis MultiPanel coloration et analyse, qui devient un enjeu majeur lors de la tentative de caractériser les sous-ensembles immunologiques rares (c.-à-d. spécifique lymphocytes)12. Techniques plus récentes comme masse cytométrie en flux, ou cytométrie par temps de vol (CyTOF), permettent une analyse phénotypique haute dimension de sous-ensembles cellulaires avec certains systèmes supportant les conceptions du panneau supérieur à 42 paramètres indépendants13. Malgré la formidable puissance de la technologie CyTOF dans profilage immunitaire, il reste limité en raison de la dépense, expertise de l’analyse et l’accès à l’équipement. En outre, plusieurs protocoles de CyTOF recommandent purification des sous-ensembles immunitaires afin d’améliorer les rapports signal sur bruit14et ainsi, nous suggérons que notre méthode d’enrichissement pourrait être utilisée en amont de l’analyse CyTOF pour améliorer la qualité des données.
Nous décrivons ci-après une digestion microenvironnement tumoral et analyse méthode qui incorpore immunitaire tumeur s’infiltrer dans la séparation. Le but de cette méthode est de permettre à haut débit indépendant profilage des fractions cellulaires tumorales pour une caractérisation plus large du microenvironnement tumoral et infiltrat immunisée tumoral. En utilisant cette méthode, par ailleurs démontrent l’importance d’effectuer des analyses de toute tumeur, comme un modèle de tumeur solide sous-cutanée a été constaté que l’hétérogénéité spatiale immunologique significative. Dans l’ensemble, cette méthode peut plus précisément et uniformément comparer entre les échantillons car elle enrichit pour des sous-ensembles cellulaires immunitaires au sein de la tumeur et permet pour le profilage indépendante de la cellule tumorale et immunitaires fractions d’une tumeur.
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) du Baylor College of Medicine.
1. digestion et récolte tumeur
NOTE : Le temps requis pour la récolte est environ 3-5 min/tumeur et le temps nécessaire à la transformation est ~ 1 h + 2-3 min/tumeur.
- Euthanasier souris par inhalation de dioxyde de carbone et vaporiser chaque souris vers le bas avec l’éthanol à 70 % avant la récolte pour éviter la contamination de cheveux. Chirurgicalement enlever des tumeurs sous-cutanées des souris et faire en sorte que les tumeurs sont exempts de tout contaminant tissu (c'est-à-dire, cheveux, peau, péritoine, etc.). Placer chaque tumeur dans 1,8 mL de base RPMI 1640 médias sans sérum fœtal (SVF) dans une plaque 24 puits. Pour plus grandes récoltes, garder plaques froid sur la glace afin de préserver la viabilité cellulaire.
Remarque : Si la stérilité est nécessaire, toutes les dissections tumorales devra sera effectué dans une cabinet avec des outils chirurgicaux stériles (c.-à-d., ciseaux, pinces, etc.), ainsi que d’autres mesures de biosécurité. Tumeurs avec le plus long diamètre entre 0,5 - 1 cm sont optimales, et des tumeurs plus ou moins importants devront être mise à l’échelle des réactifs. - Utiliser des ciseaux pour couper les tumeurs dans moins de 1 mm3 pièces dans chaque puits.
- Préparer un 10 x digestion cocktail en dissolvant la collagénase j’à 10 mg/mL, collagénase IV 2 500 U/mL, et DNase I à 200 U/mL dans les médias de RPMI 1640 base (sans FBS).
Remarque : La cocktail de la digestion peut être préparée un jour à l’avance et conservée à-20 ° C ; Toutefois, un stockage prolongé n’est pas recommandé comme enzymes vont perdre leur activité au fil du temps une fois dissous. - Ajouter 200 µL de 10 x dissociation cocktail contenant collagénase I, IV de la collagénase et DNase I de chaque puits avec les morceaux de3 mm 1.
- Laisser les échantillons à digérer pendant 1 h à 37 ° C en agitant légèrement à 60-100 tr/min à l’aide d’un agitateur orbital plaque.
Remarque : L’élévation de la température à 37 ° C au cours de la digestion enzymatique peut causer activation de cellules immunitaires. - Après 1 h, neutraliser la réaction en ajoutant 1 mL de milieu RPMI 1640 milieux supplémentés avec EDTA FBS et 2 mM de 5 % dans chaque puits.
- Pipetter, dans un tamis de cellule de 40 µm assis au sommet d’un tube à centrifuger 50 mL, la digestion de la tumeur et les pièces restantes de la tumeur.
NOTE : Couper l’extrémité d’une pipette de 1 mL pour faciliter le transfert de la digestion de la tumeur à la crépine. - Un piston de seringue de 10 mL permet de ventiler mécaniquement les pièces de la tumeur par l’intermédiaire de la crépine. Rincer périodiquement le filtre avec 2 mL de milieu RPMI 1640 médias (contenant 5 % FBS) et répétez jusqu'à ce que la crépine de la cellule résulte de la tumeur.
NOTE : Environ 4 à 10 mL de médias totales doit être suffisant pour bien rincer la crépine de la tumeur.
NOTE : Placer les échantillons sur la glace avant d’avoir terminé cette étape pour tous les échantillons afin de préserver la viabilité cellulaire. - Ajuster chaque tube à centrifuger 50 mL sur le même volume à partir du support de RPMI 1640 complété.
Remarque : Le réglage du volume est essentiel pour l’équilibrage de la centrifugeuse. Sauter cette étape pourrait entraîner centrifugeuse des dommages ou des blessures. - Centrifuger les suspensions cellulaires (5 min, 805 x g, 4 ° C), jeter le surnageant et remettre en suspension dans 2 mL de milieu RPMI 1640 médias.
Remarque : Un agrégat de cellules peut se former après la centrifugation qui est difficile à remettre en suspension. Utiliser une pipette sérologique de 5 mL et mélanger rapidement pour casser vers le haut avant de procéder.
2. séparation des Fractions cellulaires immunitaires et tumorales
NOTE : Le temps nécessaire à cette étape est d’environ 1 h.
- Ajouter 3 mL de milieu de gradient de densité au fond d’un tube à centrifuger 15 mL. Préparer et étiqueter assez tubes pour chaque tumeur.
- Superposez les 2 mL de suspension cellulaire tumorale sur le dessus du milieu de gradient de densité de pipetage lentement vers le bas de la paroi du tube pour empêcher le mélange des deux couches.
- Placer soigneusement les tubes multicouches dans la centrifugeuse et un essorage pendant 20 min à 805 x g, 20 ° C, avec aucun frein.
Remarque : Il est extrêmement important de vérifier l’équilibrage approprié et d’assurer qu’aucun frein n’est utilisé lors de la centrifugation. Toute perturbation de ce processus aboutira à la couche de mélange et la récupération de l’échantillon complet sera difficile. - Transvaser avec soin la tumeur infiltration leucocytaire (TIL) couche et la couche de médias haut de la page dans un nouveau tube de 15 mL à l’aide d’une pipette de transfert. Jetez tous les restants moyen gradient de densité et Resuspendre le culot de tumeur au bas du tube dans 2 mL de milieu RPMI-1640.
Remarque : Après centrifugation il y aura quatre calques visibles du haut en bas, qui correspondent respectivement à : médias, TILs, milieu de gradient de densité et culot cellulaire tumorale. Voir la Figure 2A pour obtenir un exemple des différentes couches. - Centrifuger les deux le TIL et des échantillons de tumeur à séparent les tubes (5 min, 805 x g, 4 ° C) et éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension l’échantillon TIL dans 200 µL et le culot de tumeur dans 2 mL de milieu RPMI 1640 médias. Rester sur la glace afin de préserver la viabilité.
3. placage et coloration
Remarque : Le temps requis pour l’électrodéposition est 30 s/tumeur ; le temps requis pour la coloration de surface est de 1 h ; le temps requis pour la coloration intracellulaire est 40 min ; le temps requis pour l’analyse en cytométrie en flux est 1 - 4 min/tumeur.
- Préparer et plaque 96 puits U fond d’étiquette pour chaque immunitaire coloration panneau et une plaque supplémentaire pour cellule compte.
Remarque : En règle générale, trois plaques sont préparés au total : une plaque de panneau axés sur les lymphocytes et une plaque de panneau myéloïde axé sur une plaque de comptage de cellules. - Aliquote les suspensions unicellulaires dans chacun de la coloration panel plaques et un volume dans la plaque de comptage.
Remarque : La plaque de comptage est utilisée pour calculer le nombre total de cellules ajoutées à chaque panneau coloration, permettant ainsi aux chiffres de population de cellules précises. Un cytomètre en flux avec capacités de plaque à 96 puits d’échantillonnage et d’analyse volumétrique peut fournir le nombre de cellules par µL de chaque échantillon et donc calculer le nombre de cellules ajoutées à chaque panneau de coloration. Plaques de numération peuvent être acquises le jour suivant après fixation nuit à 4 ° C, rinçage avec du tampon de FACs (tampon phosphate salin (PBS) avec 2 % FBS) et resuspendant dans un volume de tampon de FACs. - Laver les cellules deux fois avec 200 µL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD) par exemple par centrifugation (5 min, 805 x g, 4 ° C) et jeter le surnageant entre chaque rinçage pour enlever toute FBS gratuit.
- Ajouter 50 µL de bloc Fc, mélanger les échantillons à l’aide d’une pipette multi-canaux et incuber pendant 20 min à 4 ° C.
- Ajouter 50 µL de 2 x concentré anticorps ciblant extracellulaire et viabilité fixable tache mélange, mélanger à l’aide d’une pipette multi-canaux et incuber 30 min à l’obscurité à RT ou 4 ° C.
Remarque : Les conditions exactes de coloration pour l’anticorps dépendent du fabricant. Coloration de toutes les dilutions doivent être en SPD, avec aucun FBS ajouté pour éviter la saturation de la teinture de viabilité réparable. S’il vous plaît voir Table des matières, équipements pour les dilutions optimales du panneau coloration utilisée dans ce manuscrit. Anticorps et viabilité fixable solution de coloration est disposée à une concentration de 2 x à fournir une finale 1 x concentration dans 100 µL du volume total de coloration lors de l’ajout au bloc Fc de coloration. - Laver les échantillons deux fois avec le tampon de FACs par centrifugation (5 min, 805 x g, 4 ° C) et en jetant les surnageants entre chaque rinçage.
- Resuspendre dans 200 µL de solution de fixation/perméabilisation 1 x et incuber une nuit à 4 ° C, abri de la lumière.
Remarque : L’expérience peut être interrompue du jour au lendemain à ce stade : conserver les échantillons à 4 ° C, abri de la lumière. - Le lendemain, centrifuger les plaques (5 min, 805 x g, 4 ° C) et éliminer le surnageant.
- Rincez une fois avec 200 µL de 1 x tampon de perméabilisation, centrifugeuse (5 min, 805 x g, 4 ° C) et éliminer le surnageant.
- Ajouter 100 µL de 1 panneau x concentré anticorps intracellulaire coloration préparé dans du tampon 1 x perméabilisation et incuber 30 min à l’obscurité à RT ou 4 ° C (cela dépend de coloration des recommandations du fabricant).
- Rincez une fois avec perméabilisation 1 x tampon (5 min, 805 x g, 4 ° C), éliminer le surnageant et rincez une deuxième fois avec le tampon de FACs (PBS contenant 2 % FBS).
- Remettre en suspension les échantillons dans 300 µL de tampon de FACs (PBS contenant 2 % FBS), transférer les échantillons aux tubes de cytométrie en flux et effectuer l’analyse en cytométrie en flux.
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Résultats
Nos résultats démontrent l’avantage significatif de TIL la séparation des éléments de tumeur non immunisés, comme cela est expliqué dans le protocole. En outre, à l’aide de la méthode décrite, nous démontrons l’hétérogénéité immunologique significative des tumeurs solides établies.
Un problème important avec nombreuses techniques de dissociation de tumeur est la perte de viabilité de l’échantillon, plus souvent en raison des con...
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Discussion
Le temps est composé de molécules et les composants cellulaires diverses et complexes. Récentes indiquent que la caractérisation précise de cet environnement peut fournir une meilleure compréhension de la réussite du traitement ou d’échec et peut même aider à identifier les mécanismes de résistance thérapeutique. Par exemple, intratumorale niveaux croissants de diverses cellules immunosuppresseurs (c.-à-d., MDSCs, les lymphocytes T régulateurs, etc.) peuvent atténuer les réponses immunes effectrices et ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
JMN reconnaît financièrement par le National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) et le National Institute of Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) de la National Institutes of Health. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health. Ce projet a également bénéficié de la cytométrie en flux et noyau de tri cellulaire au Baylor College of Medicine financée par les NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 et S10 RR024574) et l’aide des experts de Joel M. Sederstrom.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Mâle de 6 à 12 semaines C57BL/6 souris | Jackson Laboratory ; | N/A | Souris utilisées dans nos études tumorales |
| MEER Lignée cellulaire syngénique de cancer murin | Acquise auprès d’un collaborateur ; | N/A | E6/E7 Lignée cellulaire de cancer épithélial de l’amygdale amygdale murine ; |
| Alcool isopropylique à 70 % ; | EMD Milipore ; | PX1840 | |
| Kit d’outils chirurgicaux murins | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Nécessite principalement uniquement des ciseaux, une pince à épiler et un scalpel. |
| Plaque à 24 puits ; | Denville Scientific Inc. | T1024 | Ou n’importe quelle plaque à fond plat à 24 puits. |
| RPMI-1640 média | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagénase I ; | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I ; | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Agitateur orbital basse vitesse | BioExpress (fournisseur : Genemate) ; | S-3200-LS | Ou n’importe quel agitateur orbital. |
| Incubateur thermorégulateur | Fisher Scientific | 13-255-27 | Ou tout autre incubateur thermorégulé |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette et pointes | Eppendorf | 13-690-032 | Ou toute autre pipette et pointes |
| 40 um Passoires cellulaires | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Tubes à centrifuger de 50 mL | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Tubes coniques de 15 mL | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| Seringue Luer-Lok de 10 mL sans aiguilles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Gradient de densité moyen | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Pipettes de transfert | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| Plaques à fond en U à 96 puits | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich ; | D8573 | |
| FoxP3 Ensemble de tampons de coloration du facteur de transcription ; | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Tampon de perméabilisation fixe/et tampon de perméabilisation |
| Centrifugeuse thermorégulée | Eppendorf ; | 5810 R Attune | |
| NxT Cytomètre en flux | ThermoFisher Scientific | N/A | Pour le comptage volumétrique cellulaire à 96 puits ; |
| Anti-souris anti-rat purifié CD16/CD32 (bloc BD Fc de souris) ; Cloner 2.4G2 ; | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Kit de coloration bleue à cellules mortes fixable, pour l’excitation UV | ThermoFisher Scientific | L34962 | Coloration de viabilité fixable |
| CD45 Anticorps monoclonal (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR bêta Anticorps monoclonal (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-&alpha ; Anticorps (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 ; | |
| Anticorps monoclonaux CD4 (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| CMH de classe II (I-A/I-E) Anticorps monoclonaux (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| Anticorps monoclonaux CD11c (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| Anticorps monoclonaux F4/80 (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Anticorps monoclonal (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Anticorps monoclonal (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (-L1, B7-H1) Anticorps monoclonal (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| Anticorps monoclonal CD273 (B7-DC) (122), PerCP-eFluor 710, | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Anticorps monoclonal Ki-67 (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
Références
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Réimpressions et autorisations
