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Article de méthode

Génération du premier cœur comme champ progéniteurs cardiaques et Cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines

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DOI :

10.3791/57688

⸱

19 juin 2018

 ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Department of Bioengineering, University of California at San Diego

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une méthode évolutive, en utilisant une combinaison simple d’activine A et induite par le lentivirus Id1-surexpression, pour générer des premiers progéniteurs cardiaques de coeur comme champ et cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines.

Résumé

La génération de grandes quantités de pluripotentes humaines fonctionnels dérivés de cellules souches cardiaques progéniteurs et les cardiomyocytes d’origine champ défini de coeur est une condition sine qua non pour la modélisation de la maladie et les thérapies cellulaires cardiaques. Nous avons récemment démontré que les gènes Id sont à la fois nécessaire et suffisante pour spécifier la premières progéniteurs de champ de cœur au cours du développement des vertébrés. Ce protocole de différenciation s’appuie sur ces constatations et utilise Id1 surexpression en combinaison avec l’activine A comme puissants repères indiquant pour produire des progéniteurs de (FHF-L) premiers cœur comme champ. Ce qui est important, résultant des progéniteurs différencient efficacement (~ 70 – 90 %) dans les cardiomyocytes ventriculaires ressemblant. Nous décrivons ici une méthode détaillée pour 1) générer Id1-surexprimant hPSCs et 2) se différencient des quantités évolutives des progéniteurs de FHF-L cryopreservable et des cardiomyocytes ventriculaires ressemblant.

Introduction

Production à grande échelle des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs)-dérivées de cellules souches cardiaques et les cardiomyocytes est une condition sine qua non pour les thérapies basées sur les cellules souches1, modélisation2,3 et la caractérisation rapide de la maladie nouvelles voies réglementant la différenciation cardiaque4,5,6 et physiologie7,8. Bien qu’un certain nombre d’études9,10,11,12,13,14,,,15 ont décrits précédemment très efficace protocoles de différenciation cardiaques de hPSCs, aucune a abordé l’origine domaine de cœur des cardiomyocytes qui en résulte, en dépit de l’identification des importantes différences moléculaires entre gauche (premier champ du coeur) et droite (second champ de coeur) cardiomyocytes ventriculaires16 et l’existence de maladies cardiaques congénitales par coeur domaine spécifique ; c'est-à-dire, hypoplasie du coeur gauche syndrome17 ou arythmogène dysplasie ventriculaire droite18. Ainsi, la génération des progéniteurs cardiaques et les cardiomyocytes d’origine champ défini de coeur de hPSCs devient une nécessité afin d’augmenter leur pertinence en tant que thérapeutique et outils de modélisation de la maladie.

Ce protocole repose sur la surexpression constitutive ID1, récemment identifié5 premier cœur en spécifiant le champ repère qui, en combinaison avec l’activine A, est nécessaire et suffisante pour initier cardiogenesis dans hPSCs. Notamment, Cunningham et al. (2017) 5 démontrent que les progéniteurs induite par l’Id1 spécifiquement premier champ de cœur (HCN4, TBX5) mais pas second marqueurs de champ de cœur (SIX2, ISL1) car ils subissent une différenciation cardiaque. En outre, les auteurs montrent également que des embryons de souris transgéniques dépourvus de toute la famille de gènes (Id1-4), de Id développe sans former premier cœur champ cardiaque progéniteurs, en plus des progéniteurs cardiaques médial et postérieur ( deuxième champ de cœur) peut encore former, ce qui laisse croire que les protéines Id sont essentiels d’initier une première heart champ cardiogenesis in vivo. Idéalement, les progéniteurs induite par l’Id1 peut être cryoconservés et spontanément se différencient en cardiomyocytes ventriculaires-comme caractéristiques, notamment de l’expression des marqueurs spécifiques ventriculaire (IRX4, MYL2) et potentiels d’action ventriculaire-like.

Nous décrivons ici une méthode simple et évolutive pour générer des premier cœur comme champ (FHF-L) cardiaques progéniteurs et cardiomyocytes ventriculaires ressemblant de Id1 sur-exprimant hPSCs. Une caractéristique importante de ce protocole est la possibilité de découpler la génération de progéniteurs cardiaques du cardiomyocyte ultérieures de production utilisant une étape pratique de cryoconservation. En résumé, ce protocole détaille les étapes nécessaires pour (1) générer Id1-surexprimant hPSCs, (2) générer des cellules souches cardiaques FHF-L de hPSCs, (3) cryoconservé progéniteurs qui en résulte et (4) reprendre la différenciation des progéniteurs cardiaques FHF-L et générer hautement enrichi (> 70 – 90 %) battant cardiomyocytes ventriculaires-like.

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Protocole

1. infection et préparation de Virus Id1

  1. Générer des lentivirus sur-exprimant Id1 par transfection co pCMVDR8.74, pMD2.G et pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene : plasmide #107735) dans les cellules HEK293T. Recueillir des particules virales, filtrer, purifier du surnageant et stocker à-80 ° C comme Kitamura et al. (2003) 19. vous pouvez également produire Id1 lentivirus commercialement en envoyant pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR à un fournisseur produisant des lentivirus.
    ATTENTION : Veuillez suivre les consignes des gènes et des protocoles de fonctionnement standard.
    Note : IMPORTANT : titre virus optimale doit être au moins 108 à 109 Transducing unités/mL (TU/mL).
  2. Avant l’infection, enduire un puits d’une plaque 96 puits 50 µl de réactif de revêtement, généralement un mélange de protéines gélatineuse sécrété par les cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (voir Table des matières).
  3. Dissocier un puits de cultivé dans une plaque 6 puits en ajoutant 1 mL de PBS avec 0,5 mM EDTA et sans Ca2 + et Mg2 + des cellules souches pluripotentes.
    NOTE : Le temps de Dissociation varie de 3 à 10 min. Lorsque plus de 80 % des cellules sont détachés du fond de la plaque, passez à l’étape suivante.
  4. Recueillir la suspension cellulaire avec pipette stérile dans tube à centrifuger en plastique 15 mL.
  5. Neutraliser le réactif de dissociation avec 5 mL de PBS contenant Ca2 + et Mg2 +.
  6. Pellet cellules par centrifugation (200 g x 3 min).
  7. Éliminer le surnageant et effleurer doucement le tube afin de déloger le culot.
  8. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de cellules souches médias.
  9. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisés suivant les instructions du vendeur.
  10. Cellules viables plaque 20 000 / enduit bien (plaque à 96 puits) dans 50 µL de cellules souches milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK (voir tableaux 1 et 2).
  11. Après 24h, surveiller pour la fixation des cellules et de remplacer le support avec 100 µl cellules souches médias additionnés de 2 inhibiteur de voie de RHO/ROCK µM et le bromure de hexadimethrine 6 ng/mL (voir tableaux 1 et 2), 1 heure avant l’infection des gènes.
    Remarque : Les cellules doivent être fermement fixés au fond de la plaque.
  12. Décongeler l’Id1-lentivirus sur la glace.
  13. Ajouter 3 µL de lentivirus purifiée par puits (titre de virus doit être comprise entre 108 à 109 TU/mL), puis transférer la plaque arrière d’incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO2, 20 % O2).
  14. infection virale après 24 h, ajouter 100 µL de milieux frais souches cellulaires dans les cellules infectées.
  15. infection après des gènes de 48 h, remplacer les virus contenant les médias avec 200 µL de cellules fraîches de souches milieux supplémentés avec 1 puromycine µg/mL.
  16. Actualiser les médias tous les jours avec 200 µL de cellules souches milieux supplémentés avec 1 puromycine µg/mL.
  17. Quand les cultures atteignent 80 % confluence, dissocier les cellules à l’aide de 200 µL de PBS sans Ca2 + et Mg2 + + 0,5 mM EDTA (pour un puits d’une plaque de 96 puits).
  18. Recueillir suspension de cellules dans un tube à centrifuger.
  19. Neutraliser le réactif de dissociation avec 5 mL de PBS contenant Ca2 + et Mg2 +.
  20. Pellet cellules par centrifugation (200 g x 3 min).
  21. Éliminer le surnageant et effleurer doucement le tube afin de déloger le culot.
  22. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de cellules souches milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK.
  23. Toutes les cellules (1 mL) de transfert à un enduit bien d’une plaque de 12 puits.
  24. Après 24h, moniteur pour la fixation des cellules aux médias puits et remplacer avec 1 mL de cellules souches médias additionné d’inhibiteur de voie de RHO/ROCK 2 µM et bromure de hexadimethrine de 6 ng/mL, 1 heure avant la transduction.
  25. Décongeler l’Id1-lentivirus sur la glace.
  26. Ajouter 5 µL de virus purifié par puits (plaque de 12 puits).
  27. infection après des gènes de 24h, remplacer les virus contenant les médias avec 1 mL de frais cellules souches milieux supplémentés avec 3 puromycine µg/mL.
  28. 48 h après l’infection des gènes, remplacer le virus contenant des médias avec 1 mL de cellules fraîches de souches milieux supplémentés avec 6 puromycine µg/mL.
  29. Quand les cultures atteignent 80 % confluence, dissocier les cellules à l’aide de 500 µL de PBS avec 0,5 mM EDTA et sans Ca2 + et Mg2 + (pour un puits d’une plaque de 12 puits).
  30. Transférer la moitié (250 µL) de la suspension cellulaire à un puits d’un réactif de revêtement enduit plaque 6 puits contenant 2 mL de cellules souches milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK.
  31. Utiliser l’autre moitié (250 µL) de l’échantillon pour l’extraction de l’ARN et qRT-PCR afin de déterminer l’Id1 LENTIVIRAUX médiée par les niveaux d’expression, comme Colas et al. (2012) 4.
    NOTE : IMPORTANT : si Id1 ARNm expression est inférieures à 0,005 pli GAPDH des niveaux d’expression (voir tableau 3 pour amorces qRT-PCR), répétez les processus d’infection comme décrit ci-dessus jusqu'à ce que les niveaux d’expression Id1 dépassent la seuil.

2. hPSCs entretienId1

  1. Culture hPSCsId1 dans enduit 6-plats et croître dans 3 mL par puits de cellules souches milieux supplémentés avec 6 puromycine µg/mL.
  2. Quand hPSCsId1 atteignent 80 % confluence, les cellules comme agrégats (rapport de 1:6 split) utilisant le réactif de dissociation sans enzymes suivant directives du vendeur de passage et croître dans 3 mL par puits de cellules souches milieux supplémentés avec 6 puromycine µg/mL.

3. préparation des hPSCsId1 de différenciation

  1. Recouvrir une plaque de 12 puits avec 500 µL / puits de réactif de revêtement.
  2. Lorsque hPSCsId1 atteignent 90 % confluence dissocient les cellules en ajoutant 1 mL de PBS avec 0,5 mM EDTA / puits et sans Ca2 + et Mg2 + pour 5 à 10 min. vérifier le processus de dissociation chaque minute, et une fois les 80 % des cellules sont dissociées de la plaque , passez à l’étape suivante.
  3. Recueillir suspension de cellules dans un tube à centrifuger.
  4. Neutraliser le réactif de dissociation avec 5 mL de PBS contenant Ca2 + et Mg2 +.
  5. Pellet cellules par centrifugation (200 g x 3 min).
  6. Éliminer le surnageant et effleurer doucement le tube afin de déloger le culot.
  7. Remettre en suspension les cellules dans 2 mL de cellules souches milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK.
  8. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées.
  9. Cellules de plaque 300 000 / puits dans 1 mL de cellules souches milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK et 6 µg/mL puromycine et plaque de transfert dans l’incubateur de culture de tissus.
  10. Actualiser les médias tous les jours avec 2 mL de cellules souches milieux supplémentés avec 6 puromycine µg/mL cultures jusqu'à confluence de 90 %. Ouvrir à ce stade, la différenciation cardiaque (étape suivante).

4. différenciation des hPSCsId1 en premier coeur comme champ progéniteurs cardiaques (FHF-L CPs)

  1. Pour le format de la plaque de 12 puits, initier la différenciation (jour 0) en remplaçant les cellules souches médias avec 1,5 mL de médias d’induction (tableau 1) additionné l’activine A (100 ng/mL) (voir tableau 2 pour les volumes et l’activine A les concentrations recommandées pour plaque de différents formats).
  2. Jour 1 (24 h après que la différenciation est lancée), remplacer les médias avec 2 mL de médias d’induction sans activine A (/ puits d’une plaque de 12 puits).
  3. Le jour 3, remplacer les médias avec 2 mL de médias d’induction sans activine A (/ puits d’une plaque de 12 puits).
  4. Le jour 5, recueillir FHF-L CPs pour la cryoconservation (étape suivante).
    NOTE : IMPORTANT : Cryopreservation est préférable à ce stade, car elle permet de découpler la génération de progéniteurs cardiaques de myocytes cardiaques subséquentes production et biobanque importants lots de cellules. Notez que vous pouvez également jour 5 CPs FHF-L peut être passé à une plaque fraîchement enduite à la différenciation de continuer, s’il vous plaît se référer aux étapes 5.1 – 5,5 à passFHF-L CPs et passez à l’étape 6.5 de différenciation.

5. cryoconservation du CPs FHF-L

  1. Aspirez tous les médias de puits contenant des J5 FHF-L CPs et rapidement ajouter 1 mL de tiède (37 ° C) 1 x réactif de dissociation enzymatique contenant (voir Table des matières). Placer la plaque dans l’incubateur de culture de tissus.
  2. Après 1 min, secouer la plaque côté à l’autre dans l’incubateur.
  3. Après 2 min (temps total), retirer la plaque de l’incubateur et ajouter 1 mL de médias FBS de 10 %.
  4. Doucement pipette cellules de haut en bas avec une pipette de 5 mL pour faciliter le détachement des cellules de la plaque.
  5. Recueillir la suspension cellulaire à une centrifugeuse tube granules des cellules et par centrifugation à 200 x g pendant 3 min
  6. Resuspendre le culot dans 2 mL de réactif de cryoconservation.
  7. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées.
  8. Ajouter le réactif de cryoconservation (voir Table des matières) à un volume suffisant de cryopréserver des cellules à la concentration désirée (en général 5 à 10 x 106 cellules/mL).
  9. Cellules de transfert pour les flacons de cryoconservation et placer les flacons dans ventilation tangentielle (1 ° C/min) et placer le dispositif de refroidissement dans le congélateur-80 ° C du jour au lendemain.
  10. Après 24h, transfert des flacons congelés à l’azote liquide pour le stockage à long terme.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

6. FHF-L CP différenciation dans les Cardiomyocytes ventriculaires-like

  1. Transfert flacons FHF-L CPs congelés J5 de stockage d’azote liquide dans le récipient de glace sèche.
  2. Placer les flacons dans le bain-marie à 37 ° C pendant 2 à 3 min, jusqu'à ce que la suspension cellulaire est complètement décongelée.
    NOTE : IMPORTANT : la décongélation est sensible au temps. Exposer les médias de la cryoconservation des cellules pour une quantité excessive de temps (c.-à-d., 10 min) diminue la viabilité des cellules.
  3. Cellules de transfert de 15 ou 50 mL tube à centrifuger, selon le nombre de flacons décongelés.
  4. Verser goutte à goutte (5 gouttes toutes les 30 secondes) cardiogénique préchauffé (37 ° C) médias (tableau 1) à la solution de la cellule. Continuez ce processus jusqu'à ce qu’un média de cryoconservation de 1:3 : ratio de médias cardiogénique est atteint. À ce stade, augmenter le taux d’addition de médias cardiogénique jusqu'à un 01:10 médias de cryoconservation : ratio de médias cardiogénique est atteint.
    NOTE : IMPORTANT : les changements rapides d’osmolarité augmentera la mort cellulaire durant la décongélation ; Ajouter goutte à goutte cardiogénique médias tel que décrit ci-dessus est donc fortement recommandé.
  5. Centrifuger suspension et pellet cellules par centrifugation (200 g x 3 min).
  6. Éliminer le surnageant et effleurer doucement tube à centrifuger pour déloger le culot cellulaire.
  7. Remettre en suspension les cellules avec cardiogénique milieux supplémentés avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK.
    Remarque : La viabilité cellulaire peut varier de dégel de dégel et, en général, > 65 % viabilité prédit placage bonne efficacité.
  8. Diluer concentrée suspension cellulaire avec cardiogénique milieux supplémentés avec 2 inhibiteur de la voie µM RHO/ROCK pour obtenir la concentration de la cellule souhaitée pour le placage (voir le tableau 2 pour les formats de plaque différente).
    NOTE : IMPORTANT : Notez que l’efficacité de différenciation cardiaques peut refuser si les cellules sont ensemencées trop faiblement.
  9. Cellules de semence sur la plaque.
  10. Maintenir la plaque dans la hotte de vitroplants pendant 20 min avant de transférer à l’incubateur de culture de tissus.
  11. Jour 6 de différenciation, contrôler la fixation des cellules.
    Remarque : Les progéniteurs cardiaques sont cryoconservés jour 5 de la différenciation. 24h après décongélation des cellules serait le jour 6 de la différenciation.
    Remarque : La présence de flottants (mortes) est fréquente.
  12. Jour 7, aspirer 50 % des médias et remplacer par une quantité égale de supports cardiogénique neufs.
    Remarque : L’ajout de l’inhibiteur voie RHO/ROCK aux médias cardiogénique n’est pas nécessaire après ce point.
  13. Remplacez 50 % des médias par cardiogénique médias tous les deux jours.
  14. Remarque spontanée battant qui apparaît entre 11 et 13 de jour.
  15. Le 15e jour, quantifier l’efficacité cardiaque différenciation par immunofluorescence à l’aide de DAPI (tache de noyau) et ACTC1 (pan-cardiaque marqueur).

7. transfert et Maintenance des Cardiomyocytes ventriculaires-like

Remarque : Par jour 14 – 16, une monocouche de contracter spontanément des cardiomyocytes ventriculaires semblable devrait être obtenue. À ce stade, il est suggéré de se dissocier et re-plaque de cardiomyocytes afin d’homogénéiser la culture et empêcher les cellules de détacher de la plaque.

  1. Aspirer tous les médias de puits et rapidement ajouter 1 mL de pré chauffé (37 ° C) 1 x enzyme contenant des réactifs de dissociation.
    Remarque : 1 x volumes de réactifs contenant des enzymes dissociation varient en fonction du format de la plaque, mais doit couvrir complètement le fond de la surface du bien.
  2. Plaque de transfert dans un incubateur de culture de tissus.
  3. Secouer doucement plaque côté à l’autre toutes les 2 min à l’intérieur de l’incubateur pour accélérer le processus de détachement.
  4. Après 5 à 15 min, lorsque 80 à 100 % des cellules sont détachés du fond de la plaque, retirez la plaque de l’incubateur et inhiber 1 x activité de réactif de dissociation enzymatique contenant en ajoutant un volume égal de médias FBS de 10 %.
    NOTE : Temps d’Incubation avec dissociation d’enzyme contenant x 1 pour ce processus changeront de lot à lot.
  5. Recueillir des suspension de cellules dans un tube à centrifuger.
  6. Suspension cellulaire se mêlent pipette et nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées.
  7. Diluer la suspension cellulaire à concentration cellulaire désiré (voir tableau 2 pour les formats de plaque différente) avec les médias de maintenance complétée avec inhibiteur de voie 2 µM RHO/ROCK.
  8. Après l’ensemencement des cardiomyocytes dans l’assiette, répartir les cellules et permettre les cellules attacher pendant 10 à 20 min avant de transférer la plaque à l’incubateur de culture de tissus.
  9. 24h après modification des plaques, surveiller la récupération et fixation des cellules.
    Remarque : La présence de flottants (mortes) est fréquente. 48 à 72 h après modification des plaques, cardiomyocyte devrait reprendre la contraction spontanée.
  10. Afin de maintenir la culture cardiomyocyte, remplacez 50 % des médias avec les médias d’entretien tous les deux jours jusqu'à l’utilisation des cardiomyocytes ventriculaires-comme pour les expériences ultérieures.

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Résultats

Génération de hPSCs ID1 lignes
hPSCs sont infectés par un lentivirus médiation surexpression Id1 (Figure 1A). Une fois que hPSCId1 sont générés, expression du transgène est quantifiée par qRT-PCR (Figure 1B). HPSC uniquement les lignes deId1 exprimant Id1 ARNm à des concentrations supérieures à 0,005 p...

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Discussion

Pour les différenciations réussies, assurez-vous de suivre attentivement les instructions indiquées ci-dessus. En outre, ici nous mettons en évidence les paramètres clés qui influencent les résultats de la différenciation. Avant de commencer une différenciation, les trois paramètres morphologiques suivantes doivent être respectées : une morphologie de la tige de hPSCsId1, un compactage cellulaire élevé et une confluence élevée (> 90 %) de la culture au jour 0. À cet égard, des conditions optimales de différenc...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Colas pour discussions utiles et critiques du manuscrit. Cette étude a été financée par le NIH/NIEHS R44ES023521-02 et CIRM DISC2-10110 accorde aux Dr Colas.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps ACTC1SigmaA7811
Activin AStem Cell TechnologiesHu Recom Activin A
Antibiotique Antimycosique (Anti-Anti)Thermo Fisher Scientific15240062
supplément B27Thermo Fisher Scientific17504044
supplément B27 sans insulineThermo Fisher ScientificA1895601
Supplément de B27 sans vitamine AThermo Fisher Scientific12587001
anticorps CDH5R& D SystemsAF938
CryoStor CS10Stem Cell Technologies7930Réactif de cryoconservation
DMEM high GlucoseMediatech10-013-CV  ;
DPBS avec Ca & MgCorning21-030-CV
EDTAThermo Fisher Scientific15575-038
FBSVWR89510-186
FluoVolt membrane potential kit  ;   ;Thermo Fisher ScientificF10488Pour l’acquisition du potentiel d’action optique, veuillez vous référer à McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum ReplacementGibco10828010
Matrigel, Growth Factor ReducedCorning356231Coating reactive
mTeSR1media kit Stem Cell Technologies5850
PBS w/o Ca & MgCorning21-040-CV
Pénicilline-StreptomycineGibco
Puromycin  ;Acros227422500
ReLeSRStem Cell Technologies5872Réactif de dissociation sans enzyme
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
Anticorps TAGLNAbcamab14106
ThiazovivinStem Cell Technologies72254Inhibiteur de la voie RHO/ROCK
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605 -0101X réactif de dissociation contenant
des enzymes Tyrodes sachets de mélange de solution  ;   ;SigmaT2145-10X1L(Pour l’acquisition du potentiel d’action optique, veuillez consulter McKeithan et al. 2017)

Références

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