Génération du premier cœur comme champ progéniteurs cardiaques et Cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

Nous décrivons ici une méthode évolutive, en utilisant une combinaison simple d’activine A et induite par le lentivirus Id1-surexpression, pour générer des premiers progéniteurs cardiaques de coeur comme champ et cardiomyocytes ventriculaires-comme des cellules souches pluripotentes humaines.

Résumé

La génération de grandes quantités de pluripotentes humaines fonctionnels dérivés de cellules souches cardiaques progéniteurs et les cardiomyocytes d’origine champ défini de coeur est une condition sine qua non pour la modélisation de la maladie et les thérapies cellulaires cardiaques. Nous avons récemment démontré que les gènes Id sont à la fois nécessaire et suffisante pour spécifier la premières progéniteurs de champ de cœur au cours du développement des vertébrés. Ce protocole de différenciation s’appuie sur ces constatations et utilise Id1 surexpression en combinaison avec l’activine A comme puissants repères indiquant pour produire des progéniteurs de (FHF-L) premiers cœur comme champ. Ce qui est important, résultant des progéniteurs différencient efficacement (~ 70 – 90 %) dans les cardiomyocytes ventriculaires ressemblant. Nous décrivons ici une méthode détaillée pour 1) générer Id1-surexprimant hPSCs et 2) se différencient des quantités évolutives des progéniteurs de FHF-L cryopreservable et des cardiomyocytes ventriculaires ressemblant.

Introduction

Production à grande échelle des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs)-dérivées de cellules souches cardiaques et les cardiomyocytes est une condition sine qua non pour les thérapies basées sur les cellules souches¹, modélisation^2,3 et la caractérisation rapide de la maladie nouvelles voies réglementant la différenciation cardiaque^4,5,6 et physiologie^7,8. Bien qu’un certain nombre d’études^9,

Protocole

1. infection et préparation de Virus Id1

1. Générer des lentivirus sur-exprimant Id1 par transfection co pCMVDR8.74, pMD2.G et pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene : plasmide #107735) dans les cellules HEK293T. Recueillir des particules virales, filtrer, purifier du surnageant et stocker à-80 ° C comme Kitamura et al. (2003) ¹⁹. vous pouvez également produire Id1 lentivirus commercialement en envoyant pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR à un fournisseur produisant des lentivirus.
   ATTENTION : Veuillez suivre les consignes des gènes et des protocoles de fonctionnement standard.
   Note : IMPORTANT : titre virus optimale doit être au moins 10

Résultats

Génération de hPSCs ^ID1 lignes
hPSCs sont infectés par un lentivirus médiation surexpression Id1 (Figure 1A). Une fois que hPSC^Id1 sont générés, expression du transgène est quantifiée par qRT-PCR (Figure 1B). HPSC uniquement les lignes de^Id1 exprimant Id1 ARNm à des concentrations supérieures à 0,005 p.......

Discussion

Pour les différenciations réussies, assurez-vous de suivre attentivement les instructions indiquées ci-dessus. En outre, ici nous mettons en évidence les paramètres clés qui influencent les résultats de la différenciation. Avant de commencer une différenciation, les trois paramètres morphologiques suivantes doivent être respectées : une morphologie de la tige de hPSCs^Id1, un compactage cellulaire élevé et une confluence élevée (> 90 %) de la culture au jour 0. À cet égard, des conditions optimales de différenc.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps ACTC1	Sigma	A7811
Activin A	Stem Cell Technologies	Hu Recom Activin A
Antibiotique Antimycosique (Anti-Anti)	Thermo Fisher Scientific	15240062
supplément B27	Thermo Fisher Scientific	17504044
supplément B27 sans insuline	Thermo Fisher Scientific	A1895601
Supplément de B27 sans vitamine A	Thermo Fisher Scientific	12587001
anticorps CDH5	R& D Systems	AF938
CryoStor CS10	Stem Cell Technologies	7930	Réactif de cryoconservation
DMEM high Glucose	Mediatech	10-013-CV  ;
DPBS avec Ca & Mg	Corning	21-030-CV
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575-038
FBS	VWR	89510-186
FluoVolt membrane potential kit  ;   ;	Thermo Fisher Scientific	F10488	Pour l’acquisition du potentiel d’action optique, veuillez vous référer à McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828010
Matrigel, Growth Factor Reduced	Corning	356231	Coating reactive
mTeSR1	media kit Stem Cell Technologies	5850
PBS w/o Ca & Mg	Corning	21-040-CV
Pénicilline-Streptomycine	Gibco
Puromycin  ;	Acros	227422500
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	Réactif de dissociation sans enzyme
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
Anticorps TAGLN	Abcam	ab14106
Thiazovivin	Stem Cell Technologies	72254	Inhibiteur de la voie RHO/ROCK
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605 -010	1X réactif de dissociation contenant
des enzymes Tyrodes sachets de mélange de solution  ;   ;	Sigma	T2145-10X1L	(Pour l’acquisition du potentiel d’action optique, veuillez consulter McKeithan et al. 2017)