Microscopie multicolore localisation des protéines de la Membrane unique dans les organites des cellules mammifères vivants

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la localisation multi-couleur des protéines membranaires unique dans les organites des cellules vivantes. Pour fixer les fluorophores, étiquetage des protéines sont utilisées. Protéines, situés dans des compartiments de différentes membranes de l’organite même, peuvent être localisées avec une précision d’environ 18 nm.

Résumé

Connaissance de la localisation des protéines cellulaires sous-compartiments est crucial de comprendre leur fonction spécifique. Nous présentons ici une technique de Super-résolution qui permet pour la détermination de la microcompartments qui sont accessibles pour les protéines en générant la localisation et le suivi des cartes de ces protéines. En outre, par microscopie de localisation multi-color, la localisation et le suivi des profils des protéines dans différents sous-compartiments sont obtenus simultanément. La technique est spécifique pour les cellules vivantes et est basée sur l’imagerie répétitive des protéines membranaires mobile unique. Protéines d’intérêt sont génétiquement fusionnées avec des tags auto étiquetage spécifiques, ce que l'on appelle. Ces balises sont des enzymes qui réagissent avec un substrat de manière covalente. Conjugué à ces substrats sont des colorants fluorescents. Réaction des protéines enzymatiques-tag avec la fluorescence étiqueté résultats de substrats en protéines marquées. Ici, tétraméthylrhodamine (TMR) et silicium Rhodamine (SiR) sont utilisés comme colorants fluorescents attachés aux substrats des enzymes. En utilisant des concentrations de substrat dans la MP à éventail nM, Sub stoechiométrique d’étiquetage est réalisé qui se traduit par des signaux distincts. Ces signaux est localisés avec ~ 15 – 27 précision nm. La technique permet d’imagerie multicolore de molécules simples, auquel cas le nombre de couleurs est limité par les colorants disponibles membrane perméable et le répertoire de l’étiquetage automatique des enzymes. Nous montrer la faisabilité de la technique de déterminer la localisation de l’enzyme de contrôle de la qualité (Pten)-induite par la kinase 1 (PINK1) dans différents compartiments mitochondriales au cours de son traitement par rapport à d’autres protéines de la membrane. Le critère de véritables interactions physiques entre les protéines simples différemment étiquetées par seule molécule frette ou suivi Co est limité, cependant, parce que les degrés d’étiquetage faibles réduisent la probabilité d’avoir deux protéines adjacentes marquées en même temps. Alors que la technique est forte pour l’imagerie des protéines dans les compartiments de la membrane, dans la plupart des cas il n’est pas appropriée pour déterminer la localisation des protéines solubles très mobiles.

Introduction

Le but du présent protocole est de fournir une méthode d’imagerie pour localiser et suivre les protéines de la membrane unique à l’intérieur des cellules vivantes. Nous appelons cette méthode de suivi et de localisation microscopie (TALM)^1,2. Comme la microscopie de Reconstruction optique stochastique (tempête)³ et la microscopie de Fluorescence Photoactivation localisation ((F) PALM)^4,5, TALM est une technique de localisation unique axée sur la molécule de fluorescence. Toutefois, il est distinct de la manière que la mobilité d....

Protocole

Le protocole suivant suit les directives de la Commission d’éthique de recherche établissement local.

1. méthodes

1. Culture cellulaire
   1. Cultiver des cellules, par exemple les cellules HeLa (carcinome du col de l’utérus humain), dans un flacon de culture cellulaire T25 contenant 5 mL de milieu de culture à 37 ° C et 5 % de CO₂.
      Remarque : Pour l’imagerie, fractionner les cellules sur des lamelles préparés (voir étapes 1.3 et 1.4) et conserver au moyen de l’imagerie.
2. Transfection de cellules
   Remarque : Utiliser des lignées de cellules qui expriment st....

Résultats

Analyse de l’imagerie et la colocalisation multicolore peut aider à déterminer la localisation sup-organites des protéines. Nous l’a démontré plus haut avec la phosphatase cytosolique et tensine homologue, PINK1, qui a différents endroits sub-mitochondriale en raison de son traitement par les protéases mitochondrial¹⁷. PINK1 est un facteur important de garantir la fonctionnalité mitochondriale^34,35. Pour dé.......

Discussion

Ici, une technique pour la localisation seule molécule bicolore des protéines membranaires mobile a été présentée. Suivant le protocole, les protéines membranaires sont fondues à étiquetage automatique des protéines qui réagissent avec les colorants rhodamine TMR et SiR conjugué à leurs substrats respectifs. Rhodamine dyes sont lumineuse et photostable et permettent ainsi répétitifs d’imagerie¹. Pour une performance réussie, plusieurs conditions et des sujets critiques doivent garder à l’esprit.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(Acide 2-(4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinyl)-éthanesulfonique, 1 M) (HEPES)	Biochrom	#1104E
DC1 : séparateur de faisceau dichoïde  ;	Chroma	640 dcxr	NC506031
DC2 : Miroir polychronique, séparateur de faisceau	Chroma	zt405/488/561/640rpc	discontinué
Dulbecco´ ; s Saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x (sans Ca & Mg)	Sigma-Aldrich & Co.
Earle´ ; MEM sans rouge de phénol, sans L-Glutamine et sans NaHCO3 contenant 1 % de FBS, 0,1 % d’HEPES, 0,1 % de NEAA, 0,1 % d’Alanyl-L-Glutamine et 34,78 % d’hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3 0,75g/l)			Médium d’imagerie
Earle´ ; s milieu essentiel minimum (MEM) avec rouge de phénol, contenant 1 % de sérum de veau fœtal supérieur (FBS), 0,1 % d’HEPES (acide 2-(4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinyl)-éthanesulfonique, 1 M) et 0,1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA)			Milieu de croissance
EF : Filtre d’émission quadbandpass	AHF analysentechnik	F72-866	Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm
Caméra EMCCD	Andor	Andor iXON 897	Caméra EMCCD
Filtre d’émission Cubes de filtre QuadView, orange	AHF analysentechnik	F39-637 passe-bande	582 - 619 nm
Filtre d’émission Cubes de filtre QuadView, bande passante Chroma			655 - 725 nm (HQ 690/70)
FBS (sérum de veau fœtal) supérieur	Biochrom	S0615
Perles fluorescentes : TetraSpeck&trade ; Microsphères, 0,1 & micro ; m, bleu fluorescent / vert / orange / rouge foncé	Thermo Fisher Scientific	T7279	microsphères fluorescentes
Glutamine	Biochrom	#0951C
cellules HeLa  ;	DSMZ	ACC-57	Cellules de carcinome cervical de la patiente Henrietta Lacks
Cellules Hela CI ::p aGFP, stable	Muster et al., PLOSOne 2010
Cellules Hela CV g ::Halo7-Tag, stable	Appelhans et al., NanoLett 2012
Cellules Hela Tom20 ::Halo7-Tag, stable	Appelhans et al., NanoLett 2012
Séparateur d’images	Photometrics	Dual-View QV2	séparateur d’image
émission Logiciel de traitement d’image  ;	ImageJ2 / Fiji	freeware
Huile d’immersion - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)	Carl Zeiss Jena GmbH	444960-0000-000
Microscope à épifluorescence inversée	Olympus IX-71/73/83
Laser 561 nm, 200 mW	CrystaLaser	CL-561-200	561 nm
émission Laser 642 nm, 140 mW	Omicron	Luxx-642-140	642 nm émission
MATLAB	MathWorks	version R2013a
MEM avec solution saline équilibrée Earle’s 2,2 g/L de NaHCO3, glutamine stable sans PR	Biochrom	FG-0385
MEM avec solution saline équilibrée Earle’s avec 2,2 g/L de NaHCO3, glutamine stable, Phenolred	Biochrom	FG-0325
MitoTracker® ; Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	colorant
MitoTracker® ; Vert FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	colorant
Polarisation optique multimode maintien fibre monomode	Pointsource/Qioptiq		KineFLEX
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer  ;	Rapp Polymere GmbH Tü ; Revêtement de	lamelle
aminés non essentiels (NEAA)	Biochrom	#0802E
PEG 800 (polyéthylène glycol) 10 %	Carl Roth GmbH	Art No. 0263.1	revêtement de lamelle
Pénicilline/Streptomycine	Biochrom	#0122E
Plasmide pour l’expression de PINK1-Halo7-Tag	Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015
Poly-L-lysine (1,2 mg/ml)	Sigma-Aldrich & Co.	N° de cat. N°P9155	revêtement de lamelle
RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH)	Système de carottage Diagnostix GmbH, Gernsheim		revêtement de lamelle / Motif de récepteur Intergrin
Silicone Rhodamine lié à HaloTag® ;-Ligand (SiRHTL)  ;	don personnel de Kai Johnson		dye
Software analysis plugin	auto-écrit C. P. Richter, Biophysik Osnabrü ; ck	SLIMFAST 16g
Tétraméthylrhodamine / SNAP-Cell® ; TMR-Star lié à SNAP-Ligand (TMRstar)  ;	Biolab de la Nouvelle-Angleterre® ;	Colorant S9105S
Tétraméthylrhodamine liée à HaloTag® ;-Ligand (TMRHTL)  ;	Condenseur	Promega	G8251
	Olympus	Cell^TIRF MITICO System	Condenseur TIRF
Logiciel de contrôle de microscope	Olympus cellSens 1.12
Objectif TIRF Objectif à	Olympus	150x (N.A. 1.45 ; Olympus UAPO)
Trypsine/EDTA 10x	Biochrom	#0266
Eau H2O 99,5 % Rotipuran® ; Faible bio  ;	Carl Roth GmbH	Art. Non. HN57.1

#RNBF8311 rouge de bingen acides TIRF à colorant huile