Optimisé de gratter Assay for In Vitro test de Migration cellulaire avec une caméra optique automatisée

Résumé

Ici, nous décrivons une procédure pour tester la cellule migration in vitro avec un microscope caméra optique automatisé. Le dosage zéro a été largement utilisé lorsque la fermeture de la rayure est suivie pour une période déterminée. Le microscope optique permet une détection fiable et bon marchée de la migration cellulaire.

Résumé

La migration cellulaire est un processus important qui influe sur les nombreux aspects de la santé, comme la cicatrisation et le cancer, et il est donc crucial pour le développement de méthodes pour étudier la migration. Le dosage zéro a longtemps été la méthode la plus courante en vitro pour tester des composés ayant des propriétés anti - et pro - migration en raison de son faible coût et simple procédure. Toutefois, un problème souvent signalé du dosage est l’accumulation de cellules sur le bord de la rayure. En outre, pour obtenir des données de l’essai, images d’expositions différentes il faut sur une période de temps à l’endroit exact même comparer les mouvements de la migration. Analyse de différents programmes peut être utilisés pour décrire la fermeture scratch, mais ils sont travail intensif, inexactes et les forces des cycles de changements de température. Dans cette étude, nous démontrons une méthode optimisée pour tester l’effet de la migration, par exemple avec les protéines d’origine naturelle homme et de la lactoferrine Bovine et leur peptide N-terminal lactoferricine sur la lignée cellulaire épithéliale HaCaT. Une optimisation cruciale consiste à laver et gratter dans du PBS, qui élimine l’accumulation susmentionnée de cellules le long du bord. Cela pourrait s’expliquer par la suppression des cations, qui auraient dû être divulgués à avoir un effet sur la connexion de cellules kératinocytes. Pour assurer la véritable détection des migrations, le prétraitement avec la mitomycine C, un inhibiteur de synthèse de l’ADN, a été ajouté au protocole. Finalement, nous démontrons l’automatisé caméra optique, ce qui élimine les cycles de température excessive, le travail manuel avec analyse de fermeture scratch, tout en améliorant le reproductibilité et assurant l’analyse des sections identiques du scratch au fil du temps.

Introduction

La migration est un processus important qui influe sur plusieurs aspects physiologiques. Dans la cicatrisation des plaies, migration facilite la re-epithelization de la peau. Dans les plaies non-guérison, telles que les plaies chroniques, bactéries opportunistes causent l’infection de la plaie, et plaies ouvertes sont idéales pour la croissance de bactéries et de la formation du biofilm^1,2. Le biofilm est une des causes du développement de bactéries résistantes, qui est l’une des menaces plus importantes de notre société moderne³. Dans la cicatrisation des plaies, les cellules immunitai....

Protocole

Le montage expérimental n’a aucune restriction éthique et juridique et a été menée en accord avec Université de Roskilde. Un aperçu de la mise en place expérimentale peut être vu dans la Figure 1 et les mécanismes de la caméra optique dans la Figure 2.

1. préparation

1. Exécutez toutes les étapes dans un stérile à flux laminaire-banc en nettoyant le banc et tous les équipements avec l’éthanol à 70 % avant le début de l’expérience.
2. Placez la caméra optique dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pour s’assurer des conditions optimales pour les cellul....

Résultats

HaCaT est une lignée de cellules kératinocytes, un des types de cellules plus abondantes dans la peau. En cas d’une plaie, les cellules de la peau commencent à proliférer et à migrer vers le lit de la plaie pour refermer la plaie (Figure 3). Les deux processus sont donc d’une importance capitale pour la bonne cicatrisation.

La caméra optique peut suivre les deux processus en temps réel. Pour les mig.......

Discussion

L’importance de la migration dans les études de développement, la cicatrisation des plaies, immunologie et le cancer a conduit à plusieurs méthodes différentes pour étudier les migrations. Migration peut être une expression de l’expansion ou la fermeture de l’écart par les cellules. Plus souvent la fermeture de la rayure est testée, comme il est plus facile à cultiver des cellules en une monocouche et ensuite faire une égratignure à la croissance des cellules dans une formule spécifique⁸. Notre ét.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Caméra optique
UniExplorer logiciel  ;	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))Cellule
		HaCaT	Don de l’hôpital de Bispebjerg
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Milieu pour HaCaT
FBS	Gibco	10270	Sérum fœtal bovin
PBS	Gibco	D837	Sans Mg+ et Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotiques
Trypsine (10x)	Sigma	T3924
Mitomycine C	Tocris	3258	Inhibe la prolifération
Plaque de microtitration	Greiner Bio-one	677 180
	Incubateur Panasonic		37° ; C, 5 % CO2
Hemocytometer	Assistent		Tü ; rk (0,1 mm)
Pipette garçon	Accu-Jet pro