Article de méthode

Une méthode Simple et reproductible pour préparer les échantillons de la Membrane des microvaisseaux de cerveau de Rat fraîchement isolées

DOI :

10.3791/57698

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7 mai 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ici, on décrit une méthode pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et pour la préparation des échantillons de la membrane. Ce protocole a l’avantage clair de produire des microvaisseaux enrichi échantillons avec la protéine acceptable donnent sur des animaux. Échantillons peuvent être ensuite utilisés pour les analyses de protéines robuste à l’endothélium microvasculaire cérébral.

Résumé

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La barrière sang - encéphalique (BHE) est un tissu de barrière dynamique qui répond à divers stimuli physiopathologiques et pharmacologiques. Ces changements résultant de ces stimuli peuvent grandement modulent les medicaments au cerveau et, par extension, causer des problèmes considérables dans le traitement du système nerveux central (CNS) des maladies. Nombreux changements BBB qui affectent la pharmacothérapie, impliquent des protéines qui sont localisées et exprimés au niveau des cellules endothéliales. En effet, ces connaissances sur la physiologie BBB dans la santé et la maladie a suscité un intérêt considérable pour l’étude de ces protéines membranaires. Dans une perspective de recherche sciences fondamentales, cela implique une exigence pour une méthode simple mais robuste et reproductible pour isolation des microvaisseaux de tissu cérébral récolté sur des animaux de laboratoire. Afin de préparer les échantillons de la membrane des microvaisseaux fraîchement isolées, il est essentiel que les préparations être enrichies dans les cellules endothéliales mais limitées en présence d’autres types de cellules de l’unité neurovasculaire (p. ex., astrocytes, la microglie, neurones, péricytes). Un autre avantage est la possibilité de préparer les échantillons provenant d’animaux individuels afin de capturer la véritable variabilité d’expression de protéine dans une population expérimentale. Dans ce manuscrit, on trouvera des précisions concernant une méthode qui est utilisée pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et préparation des échantillons de la membrane. Enrichissement des microvaisseaux, provenant d’échantillons dérivés, est obtenue en utilisant les quatre étapes de centrifugation à où le dextran est inclus dans la solution tampon. Ce protocole peut être facilement adapté par d’autres laboratoires pour leurs propres applications spécifiques. Échantillons produits de ce protocole ont été démontrés pour produire des données expérimentales fiables des expériences d’analyse de protéines qui peuvent grandement aider à la compréhension des réponses BBB à des stimuli physiologiques, physiopathologiques et pharmacologiques.

Introduction

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La barrière sang - encéphalique (BHE) existe à l’interface entre le système nerveux central (SNC) et la circulation systémique et joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie du cerveau. Plus précisément, les fonctions BBB précisément contrôle soluté à une concentration d’extracellulaire de cerveau pour alimenter efficacement les éléments nutritifs qui sont requis par les tissus du cerveau pour répondre aux exigences métaboliques considérables du CNS1. Ces rôles impliquent que la BHE, qui existe principalement au niveau de la cellule endothéliale microvasculaire, doit posséder des mécanismes discrets qui permettent à certaines subst....

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Protocole

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Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été approuvés par un Comité de l’emploi (IACUC) et d’institutionnels animalier et sont conformes aux National Institutes of Health (NIH) et de la recherche de l’Animal : notification In Vivo des expériences (arrivée). Le flux procédural pour le protocole est représenté dans la Figure 1.

1. mise en place de la procédure

  1. Préparer le tampon microvaisseaux de cerveau (BMB). Commencez par peser 54,66 g D-mannitol, 1,90 g EGTA et base de 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (c.-à-d., Tris) dans un bécher propre. Ajouter 1,0 L d’eau déionisée....

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Résultats

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L’écoulement expérimental pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et pour la préparation des échantillons de membrane microvaisseaux est montré dans la Figure 1. À l’aide de la procédure présentée ici, réussite de l’isolement des microvaisseaux intacts du cerveau de rat est démontrée (Figure 2 a). Ces navires ont été obtenus à l’issue de la centrifugation avec dextran et immédiatement avant le début d’ultracentrifug.......

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Discussion

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Dans cet article, on décrit une méthode simple et efficace de préparation des échantillons de protéines de membrane des microvaisseaux fraîchement isolées du tissu de cerveau de rat. Plusieurs approches pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat ou de la génération des préparations membranaires de microcirculation isolée ont été signalés dans la littérature13,20,21,22 ,

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health (R01-NS084941) et la Commission de recherche biomédicale en Arizona (ADHS16-162406) à PTR. WA a reçu au-delà de prise en charge d’une nomination pré-doctoral à une bourse de formation du instituts de santé National (T32-HL007249).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cocktail d’inhibiteurs de protéaseSigma-Aldrich#P8340Composant du tampon des microvaisseaux cérébraux
D-mannitolSigma-Aldrich#M4125Composant du tampon des microvaisseaux cérébraux
EGTASigma-Aldrich#E3889Composant du tampon des microvaisseaux cérébraux
Trizma BaseSigma-Aldrich#T1503Composant du tampon des microvaisseaux cérébraux
Dextran (MW 75 000)Spectrum Chemical Mftg Corp#DE125Dextran utilisé dans les étapes de centrifugation pour séparer les microvaisseaux du parenchyme cérébral
ZetamineMWI Santé animale#501072Anesthésique général
XylazineWestern Medical Supply#5530Anesthésique général
0,9 % solution salineWestern Medical SupplyN/AAnesthésique général diluant
Papier filtre (12,5 cm de diamètre)VWR#28320-100Utilisé pour l’élimination des méninges du tissu cérébral
Tubes à centrifugerSarstedt#60.540.386Tubes jetables utilisés pour les étapes de centrifugation du dextran
Pierce&trade ; Coomassie Plus (Bradford) AssayThermoFisher Scientific#23236Mesure de la concentration en protéines dans les préparations membranaires
Wheaton Overhead Power HomogénéisateurDWK Life Sciences#903475Requis pour l’homogénéisation des échantillons
10.0ml mortier de verre et broyeur de tissu pilonDWK Life Sciences#358039Requis pour l’homogénéisation des échantillons
Acide chlorhydriqueSigma-Aldrich#H1758Nécessaire pour l’ajustement du pH des tampons
Albumine sérique bovineThermoFisher Scientific#23210Étalon protéique pour l’étalon de test Bradford
ForcepsFine Science Tools#91100-12Utilisé pour la dissection du tissu cérébral
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools#16020-14Utilisé pour ouvrir le crâne afin d’isoler le cerveau
Tubes à centrifuger coniques de 50 mlThermoFisher Scientific#352070Utilisé pour le prélèvement de tissu cérébral après isolement
Pipettes Pasteur en verreThermoFisher Scientific#13-678-20CUtilisé pour l’aspiration de débris cellulaires après des spins de dextran
Éthanol anhydreSigma-Aldrich#459836Utilisé pour le nettoyage du broyeur de tissus ; dilué à 70 % avec de l’eau
distilléeTubes à ultracentrifugerBeckman-Coulter#41121703Utilisés pour l’ultracentrifugation d’échantillons

Références

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  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T.

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Mots-clés

Centrifugation au dextranPr paration de membraneBarri re h mato enc phaliqueTissu c r bral de ratAnalyse par Western blotEnrichissement prot iqueIsolation des microvaisseauxtapes de centrifugationMarqueurs des cellules endoth liales

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