Détection de hétérodimérisation des isoformes de protéines à l’aide d’un test in Situ proximité ligature

Résumé

Ici, nous montrons comment utiliser un test de ligature de proximité (PLA) pour visualiser MST1/MST2 hétérodimérisation dans les cellules fixes à haute sensibilité.

Résumé

Interactions de protéine-protéine réglementés sont un principe directeur pour de nombreux événements de signalisation, et la détection de tels événements est un élément important pour comprendre comment ces voies sont organisés et comment ils fonctionnent. Il existe de nombreuses méthodes pour détecter des interactions protéine-protéine dans les cellules, mais relativement peu peuvent être utilisés pour détecter des interactions entre protéines endogènes. Une de ces méthodes, le dosage de la ligature de proximité (PLA), présente plusieurs avantages pour recommander son utilisation. Par rapport aux autres méthodes courantes d’analyse des interactions protéine-protéine, PLA a la spécificité et la sensibilité relativement élevée, peut être réalisée avec manipulation cellule minimale et, dans le protocole décrit ci-après, nécessite seulement deux spécifique à la cible anticorps provenant de différentes espèces (p. ex.., de souris et le lapin) et un réactif spécialisé : un ensemble d’anticorps secondaires qui sont des oligonucléotides par covalence liés à certains qui, quand à proximité d’un autre, créer un amplifiable plate-forme pour in situ par PCR ou l’amplification de cercle roulant. Dans cette présentation, nous montrons comment appliquer la technique PLA pour visualiser les changements à proximité de MST1 et MST2 dans les cellules fixes. La technique décrite dans ce manuscrit est particulièrement adaptée pour l’analyse des études de signalisation cellulaire.

Introduction

Perturbation de la signalisation de MST1/Hippo a été liée à des troubles du développement et de la carcinogenèse¹. Chez les mammifères, les kinases MST1 et MST2 activent (phosphoryler) MOB1 et LATS1/2, dont le dernier puis phosphoryle et inactive l’activateur de la transcription co Oui-associated protein (YAP)². Sous sa forme active (lieu), YAP a activité oncogénique, améliorant la transcription des gènes de la prolifération cellulaire ; à l’inverse, lorsque YAP est inactivée par la voie de l’hippopotame, la prolifération cellulaire est supprimée et l’apoptose promu³. Dans les tissus, MST1 et MST2....

Protocole

1. préparation des Solutions

1. Préparer la solution de fixation : 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x. Prendre 10 mL, 2,5 mL de 16 % PFA et ajouter 7,5 mL de PBS 1 x.
   Risques : PFA est cancérogène aux doses faibles. Fumées et contact avec la peau sont dangereux. Conserver à-20 ° C.
2. Préparer la solution de la perméabilisation : 0,1 % Triton X-100 dans du PBS 1 x. Pour 100 mL de solution, ajouter 100 µL de Triton X-100 dans 100 mL de solution 1 PBS x. Conserver à température ambiante (RT).
3. Préparer le tampon de lavage : 1 x TBST. Pour 1 L, prendre 100 mL de 10 x TBS 890 mL de dH₂O et 10 mL de Tween 20 ....

Résultats

Nous avons utilisé le test PLA pour tester l’interaction entre MST1 et MST2 HEK-293 et iHSC. Les cellules ont été fixées, perméabilisées et colorées avec les anticorps différents, suivies en situ amplification selon le protocole PLA (Figure 1). Afin de documenter le niveau de hétérodimérisation de MST1/MST2, les cellules ont été colorées avec des anticorps MST1 ou MST2 (Figure 1 a, 1C et 1 G). Comme témo.......

Discussion

Nous avons trouvé utile d’utiliser des lames de verre chambre pour cette expérience, car il est très pratique réaliser l’expérience avec plusieurs lignées de cellules (14-16) et il n’y a pas besoin de changer l’échantillon chaque fois lors de l’analyse de la microscopie. Quelques complications peuvent survenir, comme une augmentation du risque de contamination croisée avec des anticorps. Par conséquent, nous suggérons de laver chaque cupule individuellement au lieu d’utiliser une coloration, malgré la durée de l’expérien.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lames de chambre	Thermo Fisher Scientific	178599	16 puits,
sonde PLA à lame de verre Anti-souris Minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	Contient 1x solution bloquante, 1x diluant
d’anticorps Sonde PLA Anti-Rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	Contient 1x solution de blocage, 1x tampons de lavage de diluant d’anticorps
, Flurescence	Sigma-Aldrich	DUO82049	Contient le tampon de lavage A et le tampon de lavage B
DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040
rouge	Sigma-Aldrich	DUO92008	contient 5x ligature, 1x ligase, 5x rouge d’amlification, 1x polymérase
p44/42 MAPK (Erk1/2)	Signalisation cellulaire d’anticorps	9102s
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)	Cellule Signalisation	5726s	Anticorps pERK
Anticorps MST2	Signalisation cellulaire	3952s
Krs-2 (RJ-5)	Santa Cruz	sc-100449	Anticorps MST1
16 % Paraformaldéhyde	Microscopie électronique sciences	15710	Diluer à 4 % PFA dans PBS pour solution de fixation
Triton x100	Fisher BioReagents	BP 151-500	Pour préparer 0,1 % Triton x-100 dans 1xPBS pour la solution de perméabilisation
Microscopie confocale	Leica TCS SP8, 63x		Analyse d’images avec le logiciel ImageJ

avec réactifs de détection