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Article de méthode

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour l’étude du coeur murin

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DOI :

10.3791/57769

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15 septembre 2018

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1Department of Bioengineering, University of California Los Angeles, 2Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington, 3School of Optical and Electronic Information, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Biomedical Engineering, OSHU

Dans cet article

Résumé

Cette étude utilise une technique de microscopie (LSFM) de fluorescence lumière-feuille recto-verso illumination combinée avec compensation optique pour étudier le coeur murin.

Résumé

La microscopie en fluorescence lumière-feuille a été utilisée pour l’acquisition rapide des images à haute résolution axiale de micromètre à échelle millimétrique. Les techniques traditionnelles de lumière-feuille impliquent l’utilisation d’un faisceau d’éclairage unique réalisé perpendiculairement au tissu de l’échantillon. Images de grands échantillons qui sont produites à l’aide d’un faisceau d’éclairage unique contiennent des rayures ou des artefacts et souffrent d’une résolution réduite en raison de la diffusion et d’absorption de la lumière par le tissu. Cette étude utilise un faisceau d’éclairage recto-verso et une clarté simplifiée optique technique pour coeur murin de compensation. Ces techniques permettent d’imagerie profonde en enlevant des lipides du coeur et produisent un grand domaine de l’imagerie, supérieur à 10 x 10 x 10 mm3. Par conséquent, cette stratégie permet de quantifier les dimensions ventriculaires, suivre la lignée cardiaque et localiser la distribution spatiale des protéines cardiaques spécifiques et des canaux ioniques de la post natal aux coeurs de souris adulte avec un contraste suffisant et résolution.

Introduction

La microscopie en fluorescence lumière-feuille est une technique développée tout d’abord en 1903 et est aujourd'hui utilisée comme une méthode pour étudier l’expression des gènes et aussi de produire des modèles 3D ou 4D, des échantillons de tissus pour1,2,3. Cette méthode d’imagerie utilise une mince feuille de lumière pour illuminer un seul plan d’un échantillon afin que seulement ce plan est capté par le détecteur. L’échantillon peut alors être déplacé dans la direction axiale pour capturer chaque couche, une section à la fois et le rendu d’un modèle 3D après le post-traitement des images acquises4. Toutefois, en raison de l’absorption et la dispersion des photons, LSFM a été limitée à des échantillons qui sont soit une épaisseur de quelques microns ou optiquement transparent1.

Les limitations de LSFM ont conduit à des études approfondies des organismes disposant de tissus qui sont optiquement transparents, tels que le poisson-zèbre. Études portant sur la différenciation et le développement cardiaque sont souvent menées sur le poisson-zèbre, puisqu’il y a des gènes conservés entre l’homme et le poisson-zèbre5,6. Bien que ces études ont conduit à des avancées dans la recherche cardiaque liée aux cardiomyopathies6,7, il y a toujours une nécessité d’effectuer des recherches similaires sur les organismes de niveau supérieures tels que les mammifères.

Chez les mammifères tissu cardiaque présente un défi en raison de l’épaisseur et l’opacité des tissus, l’absorption due à l’hémoglobine dans les globules rouges et les rayures qui se produit en raison de l’éclairage unilatéral de l’échantillon dans le cadre de méthodes traditionnelles LSFM1 , 8. pour compenser ces limitations, nous avons proposé d’utiliser illumination recto-verso et une version simplifiée de la technique de clarté9 combiné avec un indice de réfraction correspondant solution (jantes). Par conséquent, ce système permet l’imagerie d’un échantillon qui est supérieur à 10 x 10 x 10 mm3 , tout en conservant une bonne qualité de résolution axiale et latérale des avions8.

Ce système a été tout d’abord calibré à l’aide de perles fluorescentes disposés dans différentes configurations dans le tube de verre. Puis, le système a été utilisé afin d’imager les cœurs murines postnatals et adultes. Tout d’abord, le coeur de souris après l’accouchement a été imagé à 7 jours (P7) pour révéler la cavité ventriculaire, l’épaisseur de la paroi ventriculaire, les structures de la vanne et la présence de trabeculation. Deuxièmement, une étude a été menée pour identifier les cellules qui seraient différencient en cardiomyocytes en utilisant un coeur postnatal de souris au jour 1 (P1) avec marqué Cre cardiomyocytes et protéine fluorescente jaune (YFP). Enfin, des souris adultes à 7,5 mois ont été projetés pour observer la présence de potassium médullaire externe rénale canaux (ROMK) après la thérapie de gène8.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été approuvés par les comités examen institutionnel (IACUC) à l’Université de Californie, Los Angeles, en Californie.

1. Configuration du système d’imagerie

Remarque : Voir la Figure 1 et Figure 2.

  1. Récupérer un laser à onde continue (CW) avec 3 longueurs d’onde : 405 nm, 473 nm et 532 nm. Place 2 miroirs (M1 et M2) de 150 mm et en conformité avec leurs avions de miroir à 45° à la poutre.
    Remarque : Cette étape est effectuée afin de rediriger le laser de l’installation d’éclairage recto-verso. Le faisceau résultant sera dans la même direction que le faisceau initial.
  2. Passer le faisceau à travers un diamètre de 25 mm diaphragme iris/sténopé (PH), un filtre à densité neutre (NDF) 50 mm de diamètre avec une plage de densité optique de 0 - 4.0, une extension de faisceau (BE), une fente de 30 mm (S) avec la largeur de ~ 0 - 6 mm et un miroir (M3) , tous positionnés 150 mm les uns des autres. Placez le miroir avec son plan de symétrie entre 45° et le faisceau.
  3. Passer le faisceau à travers un séparateur de faisceau de 50/50 placé à 150 mm de M3. Placez un miroir (M6) 150 mm de la séparateur de faisceau et alignez-la afin que son plan de symétrie est à 45° de la poutre qui est émise vers l’avant. Utilisez le faisceau réfléchi pour former un côté de la nappe de lumière double-illumination.
  4. Placez un miroir (M4) 150 mm de la séparateur de faisceau et alignez-la afin que son plan de symétrie est à 45° de la poutre qui a été émise à un angle de 90° de la séparateur de faisceau. Placez un deuxième miroir (M5) 150 mm du M4 et alignez-la afin que son plan de symétrie est à 45° vers le faisceau réfléchi sur M6. Utilisez le faisceau émis par M5 pour former le second côté de la nappe de lumière double-illumination.
  5. Mettre en place le système d’éclairage recto-verso de façon symétrique (voir Figure 1). Placer une lentille cylindrique (CL1) [diamètre (d) = 1 ; longueur focale (f) = 50 mm] 150 mm en ligne avec le faisceau émis par M5 sur un côté et une autre lentille cylindrique identique (CL2) 150 mm en ligne avec le faisceau émis par M6 sur l’autre côté de la double-illumination setu p. Placer 2 miroirs (M7 et M8) chaque en ligne avec des lentilles cylindriques, à une distance de 50 mm afin de refléter le faisceau à 90 °.
  6. Former un doublet achromatique d’une paire de lentilles. Placez la première lentille, L1 (d = 1 ; f = 100 mm), 100 mm de M7 et la seconde lentille, L2 (d = 1 ; f = 60 mm), 160 mm de L1. Répéter que cela de l’autre côté de la double-illumination avec des objectifs identiques (L3, L4) placés à la même distance du M8.
  7. Place miroirs, M9 et M10, 60 mm de lentilles L2 et L4, respectivement et conformément à la poutre. Placer les objectifs de l’illumination, OL1 et OL2 (d = 2 ; f = 150 mm), 150 mm de M9 et M10 et conforme à la poutre. Le faisceau émis par les objectifs constitue la nappe de lumière pour les échantillons d’imagerie.
  8. Une imprimante 3D permet d’imprimer le porte-échantillon d’acrylonitrile butadiène styrène (ABS). Incorporer un morceau de verre de couverture [indice de réfraction (RI) = 1.4745] de chaque côté de la chambre, perpendiculaire au faisceau éclairage, afin de minimiser la désadaptation de l’indice de réfraction. Placer la chambre entre les faisceaux émis par les lentilles de l’objectif.
  9. Installer un microscope stéréo avec un 1 X objectif de grossissement et une caméra à semi-conducteurs (sCMOS) oxyde de métal complémentaire scientifique perpendiculaire à l’illumination d’avion (voir Figure 2).

2. imagerie système de calibrage

  1. Récupérer les billes de polystyrène fluorescents qui 0.53 μm de diamètre.
  2. Préparation des échantillons de billes fluorescentes en diluant la solution de perle dans une solution correspondant d’indice de réfraction (jantes) avec agarose pointage bas point de fusion de 1 % à 1 : 150, 000. Couper un bout de tube en verre borosilicate avec un diamètre intérieur de 12 mm et un diamètre extérieur de 18 mm sur une longueur de 30 mm.
    Remarque : Le tube de verre de borosilicate est utilisé pour correspondre à l’indice de réfraction (1,47).
  3. Mélanger l’échantillon dilué perle avec 1 % d’agarose et Pipeter la solution perle / d’agarose dans la tubulure de borosilicate. Permettre l’agarose à se solidifier à température ambiante (23 ° C).
  4. Remplir la chambre de l’ABS (de l’étape 1.7) avec une solution de glycérol à 99,5 %. Déposer le tube de verre de borosilicate contenant les billes à l’intérieur de la chambre. Placer la chambre de l’ABS dans le système d’imagerie afin qu’il soit au centre du faisceau gaussien créé par le système de double éclairage.
  5. Fixer une platine translationnelle motorisée 3-d sur le tube de verre de borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon dans la chambre de l’ABS (voir la Figure 1).
  6. Acquisition d’images à l’aide de la caméra sCMOS à raison de 30 images par seconde (fps). En utilisant le contrôleur de moteur, déplacer l’échantillon de 1 mm dans le sens latéral et acquérir des images à chaque incrément de 1 mm à l’aide de la caméra sCMOS. Continuez jusqu'à ce que la totalité de l’échantillon a été photographié.
  7. Empiler les images acquises à l’aide d’un logiciel de visualisation (voir Table des matières). Mesurer la fonction de point propagation (PSF) du système à l’aide de ces images de perle. Utilisez cette PSF de déconvolution pendant le traitement dans les étapes ultérieures de l’image.

3. préparation des échantillons

  1. Disséquer les cœurs d’une souris de type sauvage P1 et par un double sarcolipin-Cre hétérozygotes knockin de souris avec le gène Rosa26-YFP (SlnCre / +; R26journaliste YFP / +) à P7.
    Remarque : L’euthanasie a été effectuée à l’aide de pentobarbital et la technique décrite par Robbins et al. 10. la dissection a été réalisée selon la technique décrite par le National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)10,11.
  2. Effectuer un produit chimique de compensation des cœurs murines, comme décrit par Kevin Sung et al. 12.
    Remarque : Les étapes suivantes devraient être effectuées sous une hotte étant donné que les produits chimiques utilisés sont toxiques.
    1. Rincer les coeurs en 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 3 x pendant 10 min. Après le rinçage, placez les coeurs dans une solution de paraformaldéhyde de 4 % et incuber les échantillons à 4 ° C jusqu’au lendemain.
    2. Placer les échantillons dans une solution de 4 % d’acrylamide contenant 0,5 % p/v de 2, 2'-Azobis dichlorhydrate. Laisser les échantillons incubés à 4 ° C durant la nuit. Après l’incubation d’une nuit ou plus, retirer les échantillons et les incuber à 37 ° C pendant 2-3 h.
    3. Rincez les échantillons avec du PBS et ensuite les placer dans une solution de dodécylsulfate de sodium 8 % p/v et 1,25 % p/v d’acide borique. Incuber les échantillons à 37 ° C jusqu'à ce qu’elles sont claires. Cela peut prendre plusieurs heures selon l’épaisseur de l’échantillon. Après compensation, supprimer les échantillons et les placer dans 1 x tampon phosphate salin pendant 1 nuit.
    4. Préparer un indice de réfraction correspondant solution avec 40 g de milieu gradient de densité non ioniques (voir Table des matières) dans 30 mL de tampon phosphate de 0,02 M (PB), 0,1 % Tween-20 et 0,01 % d’azide de sodium. Porter la solution à un pH de 7,5 à l’hydroxyde de sodium.
  3. Placer l’échantillon déboisée dans jantes avec un indice de réfraction de 1,46-1,48 et 1 % d’agarose. Insérer l’échantillon dans le tube en verre borosilicate et permettre l’agarose à se solidifier à température ambiante (23 ° C).
  4. Fixer une platine translationnelle motorisée 3-d sur le tube de verre de borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon dans la 3-d imprimé chambre ABS (voir la Figure 1).

4. imagerie cardiaque adultes

  1. Injecter 8,7 x 1012 virus du vecteur de virus adeno-associé de type 9 (AAV9) contenant un promoteur spécifique cardiaque troponine T (cTnT) et la protéine fluorescente verte (GFP) dans un volume de 100 μL dans la veine de la queue d’une souris de type sauvage de 2 mois (C57BL/6).
    Remarque : Le AAV9 a été développé selon la technique décrite par Yuan et al. 13. cela provoque GFP lier au canal potassium médullaire externe rénale (ROMK) produisant AAV9-cTnT-ROMK-GFP (voir Table des matières).
  2. Disséquer le coeur de souris adultes à 7,5 mois selon la technique décrite par le NHLBI11. Préparer les échantillons à l’aide de mesures 3.1 à 3.3.
  3. Connectez le contrôleur de moteur à l’actuateur moteur. Fixer le vérin sur le tube de verre de borosilicate pour contrôler le mouvement et l’orientation de l’échantillon dans la 3-d imprimé chambre ABS.
  4. Positionner l’échantillon pour qu’il soit au centre du faisceau gaussien créé par le système de double éclairage. Acquisition d’images à l’aide de la caméra sCMOS à un taux de 100 fps.
  5. En utilisant le contrôleur de moteur, déplacer l’échantillon de 1 mm dans le sens axial et acquérir des images à chaque incrément de 1 mm avec la caméra sCMOS. Continuez jusqu'à ce que la totalité de l’échantillon a été photographié.
    Remarque : Le système est contrôlé par un logiciel de contrôle d’instruments développés sur mesure.
  6. Empiler les images acquises à l’aide d’un logiciel de visualisation (voir Table des matières). Développer des images 3D à l’aide de ces piles de l’image et le logiciel de visualisation14. Donne les fibres discontinues de polyesters de l’étape 2.6 avec la pile de l’image acquise. Définir une valeur d’intensité de seuil pixel pour observer les contours du cœur et de Pseudo-colorisation des images basées sur cette intensité de gris.

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Résultats

La technique décrite ici utilise un faisceau d’éclairage double face combiné avec une compensation optique souris coeur d’échantillons de tissus pour atteindre une profondeur d’imagerie plus profonde et un plus grand volume d’imagerie avec une résolution suffisante d’imagerie (Figure 1). Pour calibrer le système, les perles fluorescentes ont été placés à l’intérieur du tube de verre et au sein du système d’imagerie. Les perles ont été imagées et visualisés da...

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Discussion

Le système LSFM et la technique décrite ici utilise un faisceau d’éclairage double face combiné avec une compensation optique d’image au coeur de souris post-natale à adulte stades de son développement. Un faisceau d’éclairage unique traditionnel souffre de diffusion du photon et l’absorption par les tissus plus épais et plus grands échantillons1,3. Les poutres recto-verso fournissent un éclairage plus homogène de l’échantillon, réduisant ainsi au minimum l’effet...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Thao Nguyen et Atsushi Nakano d’UCLA de fournir l’échantillon de souris à l’image. Cette étude a été financée par les STARS de subventions HL118650 NIH (à Tzung K. Hsiai), HL083015 (à Tzung K. Hsiai), HD069305 (pour N. C. Chi et Tzung K. Hsiai.), HL111437 (à Tzung K. Hsiai et N. C. Chi), HL129727 (à Tzung K. Hsiai) et système de l’Université du Texas (à Nancy Lee).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CW LaserLaserglow TechnologiesLMM-GBV1-PF3-00300-05Excitation des fluorophores
Filtre à densité neutreThorlabsNDC-50C-4MContrôle la quantité de lumière entrant dans le système
Extenseur de faisceau achromatiqueThorlabsGBE05-AÉlargit le faisceau de lumière
Fente mécaniqueThorlabsVA100CContrôle la largeur du faisceau
Séparateurde faisceau ThorlabsBS013Forme un faisceau à double éclairage
Stéréomicroscope avec objectif 1XOlympusMVX10Utilisé pour l’observation d’un échantillon
ORCA-Flash4.0 LT Caméra sCMOSHamamatsu PhotonicsC11440-42UUtilisé pour capturer des images
Acrylonitrile butadiène styrène (ABS)StratasysuPrintMatériau utilisé pour imprimer en 3D un porte-échantillon
Billes de polystyrène fluorescentesSpherotech IncPP-05-10Utilisé pour l’étalonnage du système d’imagerie
Tube en verre borosilicatéCorningPyrex 7740Tube pour l’enrobage d’échantillons
GlycérolFisher ScientificBP229-4Remplissage pour chambre d’échantillonnage
Solution saline tamponnée au phosphateFisher ScientificBP39920Solution de rinçage pour cœurs de souris
ParaformaldéhydeSciences de microscopie électroniqueRT-15700Première solution d’incubation
AcrylamideWako ChemicalsAAL-107Mélangé avec du dichlorhydrate de 2,2'-Azobis pour la deuxième solution d’incubation pour le cœur de souris
Dichlorhydrate de 2,2'-AzobisWako ChemicalsVA-044Mélangé avec de l’acrylamide pour la solution de deuxième incubation pour le cœur
de sourisDodécylsulfate de sodium  ;Sigma Aldrich71725Mélangé avec de l’acide borique pour une solution de troisième incubation pour le cœur de souris
Acide boriqueFischer ScientificA74-1Mélangé avec du dodécylsulfate de sodium pour une troisième solution d’incubation pour le cœur
de souris Sigma D2158 Sigma AldrichD2158Mélangé avec du PB, du Tween-20 et de l’azoture de sodium comme solution d’adaptation de l’indice de réfraction
Tween-20Sigma Aldrich11332465001Mélangé avec Sigma D2158, PB et Sodium Azide comme solution d’adaptation à l’indice de réfraction
Azoture de sodiumSigma AldrichS2002Mélangé à Sigma D2158, PB et Tween-20 comme solution d’adaptation à l’indice de réfraction
Vecteur viral adéno-associé 9 avec un promoteur de troponine T spécifique au cardiaque marqué avec unvecteur GFP BiolabsVB2045Exprime la GFP lorsqu’il est lié à l’actionneur
servomoteur ROMK DCThorlabsZ825BUtilisé pour le mouvement axial de l’échantillon dans la feuille de lumière
K-Cube Contrôleur de servomoteur DC brosséThorlabsKDC101Se connecte à l’actionneur du moteur et contrôle le mouvement de l’actionneur
AmiraFEI SoftwareN/ALogiciel de visualisation pour la production d’images 2D et 3D
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Références

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