Unicellulaire quantification des ARNm et Expression de protéines de Surface CD4 infectées par le Virus d’immunodéficience simien+ T les cellules isolées de macaques rhésus

Andrey Tokarev; Matthew Creegan; Michael A. Eller; Mario Roederer; Diane L. Bolton

doi:10.3791/57776

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Article de méthode

Unicellulaire quantification des ARNm et Expression de protéines de Surface CD4 infectées par le Virus d’immunodéficience simien⁺ T les cellules isolées de macaques rhésus

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DOI :

10.3791/57776

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25 septembre 2018

Andrey Tokarev¹ , Matthew Creegan¹ , Michael A. Eller¹ , Mario Roederer² , Diane L. Bolton¹

¹US Military HIV Research Program, Henry M. Jackson Foundation, Walter Reed Army Institute of Research, ²Vaccine Research Center, NIAID, NIH

Dans cet article

Résumé

Décrit est une méthodologie pour quantifier l’expression des 96 gènes et 18 protéines de surface de cellules uniques ex vivo, permettant d’identifier de façon différentielle exprimée des gènes et des protéines dans les cellules infectées par le virus par rapport aux cellules non infectées. Nous appliquons la démarche d’étude CD4 infectés par le SIV⁺ T cellules isolées de macaques rhésus.

Résumé

Analyse de cellules individuelles est un important outil de dissection des populations hétérogènes de cellules. L’identification et l’isolement de cellules rares peuvent être difficiles. Pour relever ce défi, une combinaison de méthodologie indexé de cytométrie en flux et haut débit multiplex quantitative PCR (qPCR) a été développé. L’objectif était d’identifier et de caractériser le virus de l’immunodéficience simienne (vis)-infecté les cellules présentes au sein de macaques rhésus. Par dosage de la protéine de surface par un tri de cellule activée par fluorescence (FACS) et de l’ARNm par qPCR, cellules infectées par le virus sont identifiés par l’expression des gènes viraux, qui est combinée avec les mesures de gènes et des protéines hôte pour créer un profil multidimensionnel . Nous appelons l’approche, évaluation unicellulaires Proteo-transcriptional ciblée ou tSCEPTRE. Pour exécuter la méthode, des cellules viables sont colorées avec des anticorps fluorescents spécifiques de marqueurs de surface utilisés pour isoler les FACS d’un sous-ensemble de cellules et/ou d’analyse phénotypique en aval. Cellules individuelles sont triés suivis par lyse immédiate, multiplexe transcription inverse (RT), les pré amplification par PCR et haut débit qPCR de jusqu'à 96 transcrits. Les mesures de FACS sont enregistrées au moment du tri et liés ultérieurement pour les données d’expression de gène en position bien à créer une protéine combinée et le profil transcriptionnel. Pour étudier les infectés par le SIV cellules directement ex vivo, les cellules ont été identifiés par la détection de qPCR de multiples espèces d’ARN virales. La combinaison des transcriptions virales et la quantité de chaque fournissent un cadre pour la classification des cellules en étapes distinctes du cycle de vie viral (p. ex., productives et non productives). En outre, tSCEPTRE des cellules SIV⁺ ont été par rapport à des cellules isolées du même spécimen pour évaluer des protéines et gènes différentiellement exprimés hôtes. L’analyse a révélé précédemment incomprises hétérogénéité d’expression de RNA virale chez les cellules infectées comme in vivo la régulation des gènes post-transcriptionnels induite par le SIV avec résolution unicellulaire. La méthode tSCEPTRE est pertinente pour l’analyse d’une population cellulaire se prête à l’identification par l’expression du marqueur de la protéine de surface, ou des gènes pathogène ou d’un hôte ou une combinaison.

Introduction

De nombreux pathogènes intracellulaires dépendent de machinerie cellulaire hôte à répliquer, souvent modifier la biologie cellulaire hôte ou ciblage très certaines sous-populations de cellules de l’hôte pour maximiser leurs chances de propagation. Ainsi, les processus biologiques de cellule sont communément perturbés, avec des conséquences délétères sur la santé globale de l’hôte. Compréhension des interactions entre les virus et les cellules de l’hôte dans lequel ils répliquent élucidera les mécanismes de la maladie qui pourraient contribuer à l’élaboration de stratégies et d’amélioration des traitements pour prévenir l’infection. Les outils d’analyse directes qui pe....