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Article de méthode

Induction et la Validation de la sénescence cellulaire dans les cellules humaines primaires

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DOI :

10.3791/57782

⸱

20 juin 2018

 ,  , 
1European Research Institute for the Biology of Aging, University of Groningen, University Medical Center Groningen

Dans cet article

Résumé

Ici, nous discutons une série de protocoles pour l’induction et la validation de la sénescence cellulaire dans les cellules cultivées. Nous nous concentrons sur différents stimulus induisant la sénescence et décrire la quantification de marqueurs communs liés à la sénescence. Nous fournissons des détails techniques à l’aide de fibroblastes comme modèle, mais les protocoles peuvent être adaptés aux différents modèles cellulaires.

Résumé

Sénescence cellulaire est un état d’arrêt permanent cycle cellulaire activé en réponse à différents stimuli nocifs. Activation de la sénescence cellulaire est une caractéristique de diverses conditions physiopathologiques, y compris la suppression tumorale, remodelage et le vieillissement des tissus. Les inducteurs de la sénescence cellulaire in vivo sont encore mal caractérisés. Toutefois, un certain nombre de stimuli peut servir à promouvoir la sénescence cellulaire ex vivo. Parmi eux, les plus courantes de sénescence-inducteurs sont réplicative épuisement, ionisant et non ionisant, génotoxique drogues, stress oxydatif et demethylation et agents d’acétylation. Ici, nous fournirons des instructions détaillées sur l’utilisation de ces stimuli pour induire des fibroblastes en sénescence. Ce protocole peut être facilement adapté pour différents types de piles et de lignées cellulaires, y compris les cellules cancéreuses. Nous décrivons également différentes méthodes pour la validation de l’induction de la sénescence. En particulier, nous nous concentrons sur la mesure de l’activité de l’enzyme lysosomale associés à la sénescence β-galactosidase (SA-β-gal), le taux de synthèse de l’ADN à l’aide d’analyse 5-éthynyl-2'-déoxyuridine (EdU), les niveaux d’expression du cycle cellulaire inhibiteurs p16 et p21 et l’expression et la sécrétion des membres de la phénotype sécrétoire Senescence-Associated (SASP). Enfin, nous fournir les résultats de l’exemple et en discuter plus les applications de ces protocoles.

Introduction

En 1961, Hayflick et Moorhead a signalé que les fibroblastes en culture primaires perdent leur potentiel prolifératif après passages successifs1. Ce processus est provoqué par le séquentiel raccourcissement des télomères après chaque division cellulaire. Quand les télomères atteignent une critique courte longueur, ils sont reconnus par la réponse de lésions de l’ADN (DDR) qui active un arrêt irréversible de prolifération — aussi défini comme la sénescence réplicative. La sénescence réplicative est actuellement l’un des nombreux stimuli qui sont connus pour induire un état de l’arrestation de cycle de cellules permanentes qui rend les cellules insensibles aux mitogènes tant des signaux apoptotic2,3. Le programme de sénescence est normalement caractérisé par des fonctionnalités supplémentaires, y compris la forte activité lysosomale, dysfonctionnement mitochondrial, modifications nucléaires, réarrangements de la chromatine, stress du réticulum endoplasmique, dommages à l’ADN et associée à une sénescence phénotype sécrétoire (SASP)3,4. Les cellules sénescentes ont de multiples fonctions dans le corps : développement, wound healing et tumeur suppression2. De même, ils sont connus pour jouer un rôle important dans le vieillissement et, paradoxalement, en progression de tumeur5. Les effets négatifs et partiellement contradictoires, de sénescence sont souvent attribués à la SASP6.

Récemment, il a été démontré qu’élimination des cellules sénescentes de souris conduit à la prolongation de la durée de vie et à l’élimination d’un grand nombre du vieillissement caractéristiques7,8,9,10,11, 12. de la même façon, plusieurs médicaments ont été développés pour soit éliminer les cellules sénescentes (senolytics) ou de cibler les SASP13,14. Le potentiel thérapeutique de l’anti-aging a récemment attiré plus d’attention au champ.

L’étude des mécanismes liés à la sénescence cellulaire et les projections pour les interventions pharmacologiques insistent beaucoup sur les modèles ex vivo , particulièrement sur les fibroblastes humains primaires. Bien qu’il existe certaines caractéristiques communes activés par des inducteurs de sénescence divers, une grande variabilité dans le phénotype de la sénescence est observée et dépend de divers facteurs, notamment la cellule type, stimulation et temps point3,15, 16,17. Il est impératif de tenir compte de l’hétérogénéité pour l’étude et le ciblage des cellules sénescentes. Par conséquent, ce protocole vise à fournir une série de méthodes utilisées pour induire la sénescence dans des fibroblastes de primaires à l’aide de différents traitements. Comme il sera expliqué, les méthodes peuvent facilement être adaptés à d’autres types de cellules.

En dehors de la sénescence réplicative, les auteurs décrivent cinq autres traitements induisant la sénescence : rayonnement ionisant rayonnement, rayonnement ultraviolet (UV), doxorubicine, le stress oxydatif et les changements épigénétiques (à savoir la promotion de l’acétylation des histones ou de déméthylation de l’ADN) . Rayonnements ionisants et rayonnement UV endommager directe de l’ADN et, à la dose appropriée, déclenchent la sénescence18,19. Doxorubicine provoque également la sénescence principalement par le biais de dommages à l’ADN par intercalation dans l’ADN et perturbent la fonction de topoisomérase II et ainsi mettre un terme à l’ADN réparation mécanismes20. L’expression des gènes essentiels à la sénescence est normalement contrôlée par l’acétylation des histones et la méthylation de l’ADN. En conséquence, les inhibiteurs d’histone déacétylase (p. ex., le butyrate de sodium et SAHA) et ADN demethylating (p. ex., 5-aza) agents déclenchent sénescence dans les cellules normales sinon21,22.

Enfin, quatre des marqueurs plus communs associés aux cellules sénescentes sera expliqué : l’activité de la sénescence associés-β-galactosidase (SA-β-gal), taux de synthèse de l’ADN par EdU analyse, la surexpression des régulateurs de cycle cellulaire et p16 inhibiteurs de kinase cycline-dépendante et p21 et surexpression et la sécrétion des membres de la SASP.

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Protocole

1. préparation générale

  1. Préparer D10 milieu. Supplément du moyen-Glutamax DMEM avec 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine (concentration finale : 100 U/mL).
  2. Préparer une solution PBS stérile. Dissoudre les comprimés dans de l’eau selon les instructions du fabricant. Stériliser à l’autoclave.
  3. Préparer la trypsine x 1. Diluer 5 mL de trypsine-Versene EDTA/10 x 01:10 dans 45 mL de PBS stérile.
    Remarque : Dans tout le protocole, nous utilisons les conditions de culture cellulaire qui sont plus proches de la physiologique conditions de fibroblastes primaires. Cela signifie que nous Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 , comme c’est normalement fait, mais en utilisant 5 % O2 au lieu de la « norme » 20 % O2.
  4. Manipuler tous les échantillons dans des conditions stériles en utilisant une hotte à flux laminaire, blouse et gants. Gardez les cellules à 20 % O2 (des conditions ambiantes) seulement tout en étant gérée.

2. l’induction de la sénescence

  1. Sénescence réplicative
    1. Lors de la manipulation des cellules ou tout matériel qui sera en contact avec eux (pipettes, flacons, médias, etc.) fonctionnent dans des conditions stériles, en utilisant une hotte à flux laminaire, blouse et des gants. Gardez les cellules à 20 % O2 (des conditions ambiantes) seulement tout en étant gérée.
    2. Graines de 7 x 105 fibroblastes primaire viable dans une faible population doublement (DP) dans une fiole de T75 (~9.3 x 103 cellules/cm2) contenant 10 mL de D10.
    3. Cultiver les cellules dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2 à cellule jusqu'à ce qu’ils atteignent 70 – 80 % confluence (3 à 4 jours pour les cultures proliférants dans une DP faible).
    4. Détacher les cellules à l’aide de 3 mL de 1 x de la trypsine et en incubant pendant ~ 5 – 7 min dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2. Surveiller régulièrement les cellules avec un microscope de culture cellulaire pour vérifier le processus de déconnexion.
    5. Lorsque les cellules sont sphériques, arrêter la réaction de la trypsine en ajoutant 9 mL de D10. Incuber pas plus de 10 min.
    6. Faire tourner les cellules à 300 g pour 5 min. cellules formeront un culot au fond du tube, alors que les débris et particules plus petites resteront dans le surnageant.
    7. Retirez le surnageant et dissoudre le culot dans 1 mL de D10 et effectuer un nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées selon les instructions du fabricant ou d’une chambre de Neubauer pour le comptage manuel. Lors du décompte, notamment un test afin de vérifier la viabilité des cellules (par exemple, le bleu Trypan exclusion23).
    8. Calculer la periode cumulative à l’aide de cette formule :
      PDnouvelle = 3.32* (LOG(cell number total)-(LOG (nombre de cellules ensemencée)) + PDold
      Nombre total de cellules = toutes les cellules comptées : morts ou vivants.
      Nombre de graines de cellules = nombre de cellules viables épépiné (8 x 105 cellules).
      PDvieux = population doubler au moment de l’ensemencement.
      PDnouvelle = population doubler au moment du comptage (après incubation).
      Remarque : Si 7 x 10,5 primaires fibroblastes (35,2 PD) ont été ensemencées sur une fiole de T-75 et, après 4 jours, ils atteignent 80 % confluence et sont divisent encore, comptant maintenant 1,3 x 106 cellules total (+ morts vivants).
      PDnouvelle = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35,2
      PDnouvelle = 36,1
    9. Réamorcez 8 x 105 cellules dans un nouveau T75, répéter les étapes 2.1.2–2.1.8.
      NOTE : Après plusieurs passages consécutifs, la culture prendra plus de temps pour obtenir confluentes, jusqu'à ce que les cellules arrêtent de division du tout. Une fois que les cellules arrêtent de diviser, vérifier pour les marqueurs de sénescence et/ou récolter pour applications en aval.
    10. Considérer que la plus grande taille de cellules sénescentes peut causer la culture s’affichent complet et ont encore une faible de globules. Ainsi, la sénescence peut présumer que lorsque le DP est stable et d’autres marqueurs de sénescence apparaissent dans la culture (voir protocoles 3.1 à 3.5).
      Remarque : Utilisez la prolifération des fibroblastes primaires comme contrôle.
  2. Sénescence induite par le rayonnement ionisant
    1. Lors de la manipulation des cellules ou tout matériel qui sera en contact avec eux (pipettes, flacons, médias, etc.), travailler dans des conditions stériles en utilisant une hotte à flux laminaire, blouse et gants. Gardez les cellules à 20 % O2 (des conditions ambiantes) seulement tout en étant gérée.
    2. Graines de 7 x 105 viable primaire fibroblastes dans une faible DP dans une fiole de T75 (~9.3 x 103 cellules/cm2) contenant 10 mL de D10.
    3. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2.
    4. Exposer les cellules à 10 gris de l’irradiation gamma conformément aux instructions de la machine en cours d’utilisation.
    5. Aspirer le milieu des cellules et remplacer par 10 mL de D10.
    6. Incuber les cellules dans 10 mL de D10 dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2 pendant encore 10 jours remplaçant le milieu régulièrement, environ tous les 3 jours.
    7. Après 10 jours, vérifier pour les marqueurs de sénescence et/ou utiliser les cellules pour les applications en aval.
      Remarque : Utilisez la prolifération des fibroblastes primaires le PD même (avant l’irradiation) comme témoin.
  3. Ultraviolets (UV) radio-induit la sénescence
    1. Lors de la manipulation des cellules ou tout matériel qui sera en contact avec eux (pipettes, flacons, médias, etc.), travailler dans des conditions stériles en utilisant une hotte à flux laminaire, blouse et gants. Gardez les cellules à 20 % O2 (des conditions ambiantes) seulement tout en étant gérée.
    2. Semences 1,5 – 2 x 105 viable primaire fibroblastes dans une DP faible dans un puits d’une plaque de 6 puits (de 1,5 à 2,0 x 104 cellules/cm2), ajoutent 2 mL de milieu de D10.
    3. Placer les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2 et leur permettre d’adhérer au plastique pendant au moins 5 h.
    4. Décoller le support des cellules. Placer la plaque de 6 puits au milieu de la chambre de rayonnement UV et retirer le couvercle en plastique. Irradier avec UVB, 20 à 30 mJ/cm2.
    5. Ajouter 2 mL de milieu / puits.
    6. Incuber les cellules dans 2 mL de D10 dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2 pendant encore 7 jours remplaçant le milieu régulièrement, environ tous les 3 jours.
      Remarque : Après 7 jours, les cellules peuvent être testés pour les marqueurs de sénescence et utilisés pour des applications en aval. Prolifération des fibroblastes primaires le PD même (avant l’irradiation) servir de contrôle.
  4. Sénescence induite par la doxorubicine
    1. Préparer 1 000 x solution stock de doxorubicine : faire un stock de 250 µM de la doxorubicine dans du PBS 1 x, filtre-stériliser la solution et l’aliquote dans 500 µL par tube stérile. Magasin le stock de doxorubicine à-80 ° C.
    2. Lors de la manipulation des cellules ou tout matériel qui sera en contact avec eux (pipettes, flacons, médias, etc.), travailler dans des conditions stériles en utilisant une hotte à flux laminaire, blouse et gants. Gardez les cellules à 20 % O2 (des conditions ambiantes) seulement tout en étant gérée.
    3. Graines de 7 x 105 viable primaire fibroblastes dans une faible DP dans une fiole de T75 (~9.3 x 103 cellules/cm2) contenant 10 mL de D10.
    4. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2.
    5. Diluer 11 µL des 1000 x solution doxorubicine dans 11 mL de D10 à une concentration finale de 250 nM.
    6. Aspirer le milieu des cellules et remplacer par 10 mL de D10 + doxorubicine.
    7. Incuber les cellules pendant exactement 24 h dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2.
    8. Aspirer le milieu des cellules et se laver soigneusement une fois avec 10 mL de D10.
    9. Incuber les cellules dans 10 mL de D10 pour un autre 6 jours remplaçant le milieu régulièrement, environ tous les 3 jours.
    10. Au jour 7, vérifier pour les marqueurs de sénescence et/ou utiliser pour des applications en aval.
      NOTE : dans le contrôle, utilisation, prolifération des fibroblastes primaires le même parkinsoniens traités pendant 24 h avec véhicule (PBS) 1 : 1 000 D10.
  5. Sénescence induite par le Stress oxydative
    1. Lors de la manipulation des cellules ou tout matériel qui sera en contact avec eux (pipettes, flacons, médias, etc.) fonctionnent dans des conditions stériles en utilisant une hotte à flux laminaire, blouse et des gants. Gardez les cellules à 20 % O2 (des conditions ambiantes) seulement tout en étant gérée.
    2. Graines de 7 x 105 viable primaire fibroblastes dans une faible DP dans une fiole de T75 (~9.3 x 103 cellules/cm2) contenant 10 mL de D10.
    3. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur à cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2.
    4. Préparer une solution de ~ 200 μM de peroxyde d’hydrogène dans un milieu D10 en ajoutant 22,6 μL de peroxyde d’hydrogène 30 % dans 11 mL de D10.
      NOTE : Optimiser le traitement pour le type de cellule d’intérêt en faisant une courbe dose-réponse pour évaluer la toxicité.
    5. Aspirer le milieu des cellules et ajouter 10 mL de fraîchement préparée D10 moyen + peroxyde d’hydrogène. Incuber pendant 2 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2.
    6. Aspirer le milieu des cellules et laver une fois frais D10 sans peroxyde d’hydrogène.
    7. Ajouter 10 mL de D10 sans peroxyde d’hydrogène.
    8. Incuber pendant 48 h dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2.
    9. Répétez les étapes 2.5.4–2.5.8 deux fois plus pour un total de trois traitements.
    10. Recherchez les marqueurs de sénescence ou la récolte pour les applications en aval.
      Remarque : Que de contrôle, les cellules en prolifération utilisation le PD même traités avec 22,6 µL d’eau stérile en D10 pendant 2 h.
  6. Épigénétiques induites par la sénescence
    1. Préparer le stock et les solutions de travail pour les petites molécules à utiliser selon le tableau 1. Filtre-stériliser les solutions. Aliquote dans des tubes stériles. Conserver à-20 ° C.
    2. Lors de la manipulation des cellules ou tout matériel qui sera en contact avec eux (pipettes, flacons, médias, etc.) fonctionnent dans des conditions stériles, par exemple, en utilisant une hotte à flux laminaire, blouse et des gants. Gardez les cellules à 20 % O2 (des conditions ambiantes) seulement tout en étant gérée.
    3. Graines de 7 x 105 viable primaire fibroblastes dans une faible DP dans une fiole de T75 (~9.3 x 103 cellules/cm2) contenant 10 mL de D10.
    4. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2.
    5. Préparer 11 mL de milieu de D10 + solution de travail pour le traitement souhaité. La dilution exacte par le traitement peut être vu dans le tableau 1.
      1. Préparer 11 µL de solution de travail de SAHA de 1 mM à 11 mL de D10.
      2. Préparer les 44 µL de solution de travail de butyrate de sodium de 1 M dans 11 mL de D10.
      3. Préparer 11 µL de solution de travail 5-aza de 10 mM à 11 mL de D10.
        Remarque : Optimiser les traitements pour le type de cellule d’intérêt, par exemple, en faisant une courbe dose-réponse pour évaluer la toxicité.
    6. Ajouter moyen D10 + solution de travail pour le traitement souhaité à la culture.
    7. Incuber pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2.
    8. Répétez les étapes 2.6.4–2.6.6 deux fois plus, pour un total de trois traitements.
    9. Moyen de changement pour D10 simple sans drogue.
    10. Après 3 jours de plus, les cellules deviennent sénescentes et prêt pour le test des marqueurs de sénescence et applications en aval.
      NOTE : dans le contrôle, utilisation, prolifération des fibroblastes primaires le PD même traitée pendant trois jours avec D10 moyen + véhicule. Le D10 moyen + véhicule doit être actualisé toutes les 24 h durant ces trois jours. Le véhicule repose sur le traitement utilisé : 1 : 1 000 DMSO pour SAHA et aza-5 et 1/250 eau stérile pour le Butyrate de Sodium.

3. les marqueurs de sénescence

  1. Préparation
    1. Préparation de 20 mg/mL X-gal : dissoudre 20 mg de X-gal dans 1 mL de diméthylformamide ou le DMSO. Conserver à-20 ° C, abri de la lumière.
    2. Préparer la solution 0,1 M d’acide citrique : dissoudre 2,1 g d’acide citrique pur monohydraté dans 100 mL d’eau. Conserver à température ambiante.
    3. Préparer une solution de phosphate de sodium 0,2 M : dissoudre 2,84 g de phosphate dibasique de sodium ou de 3,56 g de phosphate dibasique de sodium déshydrater dans 100 mL d’eau. Conserver à température ambiante.
    4. Préparer les 0,2 M citrique acide/base phosphate pH 6.0 : dissoudre 36,85 mL de solution d’acide citrique 0,1 M et 63,15 mL de phosphate de sodium 0,2 M. Réduire/agrandir exactement à pH 6.0. Conserver à température ambiante.
    5. Préparer le ferrocyanure de potassium 100 mM : dissoudre 2,1 g de ferrocyanure de potassium dans 50 mL d’eau. Conserver à 4 ° C, abri de la lumière.
    6. Préparer le ferricyanure de potassium 100 mM : dissoudre 1,7 g de ferrocyanure de potassium dans 50 mL d’eau. Conserver à 4 ° C, abri de la lumière.
    7. Préparer les 5 M de chlorure de sodium : dissoudre 14,6 g de chlorure de sodium dans 50 mL d’eau. Conserver à température ambiante.
    8. Préparer le chlorure de magnésium 1 M : dissoudre 4,8 g de chlorure de magnésium dans 50 mL d’eau. Conserver à température ambiante.
    9. Préparer les 2 % de formaldéhyde + 0,2 % de glutaraldéhyde dans du PBS : dissoudre 800 µL de glutaraldéhyde 25 % et de 12,5 µL de 16 % de formaldéhyde dans 100 μl de PBS. Conserver à température ambiante, abrie de la lumière.
    10. Préparer la solution colorante frais selon tableau 2.
  2. Coloration de la β-galactosidase associée à la sénescence
    1. Pour chaque échantillon, graines 1 x 104 cellules dans au moins un puits d’une plaque 24 puits (5.2 x 103 cellules/cm2) contenant 500 µL de D10 afin que les cellules sont rares. Traitements (le cas échéant) peuvent être effectuées directement sur cette plaque, ou, les cellules traitées déjà peuvent également être ré-ensemencés dans une plaque de 24 puits.
    2. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2.
    3. Laver les cellules deux fois avec 500 μl de PBS.
    4. Difficulté 3 à 5 min à température ambiante à l’aide de 500 μL/puits de formaldéhyde 2 % + 0,2 % de glutaraldéhyde dans du PBS.
    5. Laver les cellules deux fois avec 500 μl de PBS.
    6. Préparer les frais coloration solution, selon le nombre d’échantillons sur la tache.
    7. Ajouter la solution colorante (500 µL/puits) et sceller la plaque avec du parafilm pour éviter l’évaporation.
      NOTE : Évaporation peut causer des cristaux de forme et gênent l’observation au microscope.
    8. Incuber les cellules dans l’obscurité (p. ex. couvert de papier d’aluminium) à 37 ° C dans une étuve sèche (sans CO2) pendant 12 à 16 h.
      Remarque : CO2 peuvent influer sur le pH et donc modifier les résultats. Certains types de cellules peuvent exiger des temps d’incubation plus courtes.
    9. Laver deux fois avec 500 μl de PBS.
    10. Évaluer les résultats. Les cellules positives présentent un bleu (pour la plupart) périnucléaire coloration sous un microscope à lumière normal (Figure 1 a).
    11. Pour la quantification, observer au moins 100 cellules par exemple et de dénombrer les cellules positives. Puisque les cellules sénescentes modifie la forme, il est souvent difficile de définir les limites d’une cellule et de compter les cellules. Contre-coloration au DAPI pour faciliter la visualisation et la quantification des cellules individuelles (Figure 1 b). Quantifier les échantillons (pourcentage de cellules positives par rapport à un montant total de cellules) à l’aide d’un microscope à fluorescence (Figure 1). Prendre plusieurs photos du même échantillon afin qu’à la fin, vous pouvez compter au moins 100 single-cellules et évaluer le pourcentage de cellules positives SA-β-gal en eux.
    12. Comparer les résultats des cellules sénescentes contre leur contrôle approprié pour le traitement utilisé.
      Remarque : Une coloration conjointement avec EdU sur le même échantillon est possible. Considérer que les cellules devraient ensuite être semées sur lamelles couvre-objet.
  3. Analyse EdU
    1. Mettre un lamelle couvre-objet/puits dans une plaque 24 puits selon le nombre d’échantillons à évaluer.
    2. Graines de 1 x 104 cellules dans au moins un puits d’une plaque de 24 puits (5.2 x 103 cellules/cm2) par condition contenant 500 µL de D10 afin que les cellules sont rares. Traitements (le cas échéant) peuvent être effectuées directement sur cette plaque ou cellules déjà traitées peuvent également être ré-ensemencés dans une plaque de 24 puits.
    3. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % O2.
    4. Préparer une solution de 20 µM de EdU D10 (1/250) selon le nombre d’échantillons à traiter (250 μL / échantillon).
    5. Retirer la moitié de la moyenne (250 μL) de chaque puits pour traiter et remplacez-la par la D10 + EdU solution préparée juste. Concentration finale de EdU est 10 µM.
    6. Incuber 18-24h dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et 5 % d’O2. Utilisez le même temps d’incubation dans le contrôle et les cellules sénescentes.
    7. Laver 2 x avec 500 μl de PBS.
    8. Fixer les cellules pendant 10 min avec 500 μL de 4 % de formaldéhyde dans du PBS.
    9. Incuber 5 min à 500 μL de 100 mM Tris (pH 7,6).
    10. Permeabilize les cellules pendant 10 min à 500 μL de 0,1 % Triton X-100 dans du PBS.
    11. Laver 3 fois avec du PBS.
    12. Préparer 50 μL de mélange d’étiquette pour chaque lamelle, en ajoutant les composants dans l’ordre suivant : 44,45 µL de PBS, 0,5 µL du Cu (II) SO4, 0,05 µL de sulfo-Cy3-azide, 5 µL d’ascorbate de sodium.
    13. Mettre 50 μL de la combinaison de label sur un morceau de parafilm. Soulevez la lamelle à l’aide d’une paire de pinces à épiler et une aiguille et laissez-la reposer sur le dessus de la composition de l’étiquette avec la surface contenant les cellules vers le bas. S’assurer qu’il n’y a pas de bulles et que toute la surface de la lamelle est en contact avec le mélange de l’étiquette. Incuber 30 min à l’obscurité.
    14. Remettre les cellules dans les puits de la plaque 24 puits et laver trois fois avec du PBS.
    15. Monter avec montage des médias (y compris le DAPI pour visualiser les noyaux) sur lames de verre et laissez-les sécher pendant la nuit.
    16. Visualiser l’incorporation de EdU à l’aide d’un microscope à fluorescence. Utiliser un filtre approprié pour Cy3 (excitation/émission : 552/570 nm).
    17. Prenez plusieurs photos des cellules pour la quantification ultérieure d’au moins 100 cellules par État (Cy3 et DAPI).
    18. Quantifier le pourcentage de cellules incorporé EdU en utilisant la formule suivante :
      EdU cellules positives (%) = (nombre d’éléments positifs de EdU (Cy3) / nombre total de globules (DAPI)) * 100
    19. Comparer les résultats des cellules sénescentes contre leur contrôle approprié pour le traitement utilisé.
      Remarque : Une coloration conjointement avec SA-β-gal sur le même échantillon est possible. Considérer que les cellules devraient toujours être semées sur les lamelles.
  4. Expression des gènes de p16, p21 et SASP
    1. Préparer les amorces des gènes d’intérêt (amorce de 50 µM de chaque).
      Remarque : Un qPCR de p16, p21 et certains facteurs pertinents de la SASP est informatif de l’état de sénescence. Le protocole décrit ici fait utilisent le système de bibliothèque de sonde universelle (UPL) pour la quantification relative à l’aide d’une PCR en temps réel. Le tableau 3 présente un aperçu des amorces utilisées pour la détection des CDK inhibiteurs p16 et p21 et des membres SASP plus pertinents, ainsi que pour la tubuline et l’actine, qui servent de gènes de référence pour le dosage. La dernière colonne du tableau 3 s’inscrit la sonde UPL particulière à utiliser pour chaque dosage.
    2. Préparer mélange réactionnel de qPCR distinct pour les dosages désirées. Incluez toujours le gène de référence aussi bien selon le tableau 4.
    3. Exécutez tous les échantillons en double ou triple exemplaire.
    4. Charge 7,5 µL/puits du mélange sur une plaque 384 puits réaction qPCR.
    5. Ajouter ~ 5 ng de l’ADNc dissous dans 2,5 µL d’eau exempte de RNase.
      Remarque : Il est préférable d’avoir des quantités similaires de cDNA de tous les échantillons à comparer. Ceci peut être réalisé en utilisant des quantités égales d’ARN pour la transcriptase inverse.
    6. Couvrir la plaque avec un sceau et s’assurer qu’il colle correctement couvrant uniformément tous les puits de la plaque.
    7. Faites tourner la plaque à 2 000 x g pendant 1 min.
    8. Exécuter la plaque dans le Lightcycler pendant 40 cycles en utilisant le protocole suivant :
      95 ° C pendant 7 min
      40 cycles de 95 ° C pour 5 s et 60 ° C pendant 30 s
      37 ° C pendant 1 min
    9. Pour l’analyse des résultats, utilisez la méthode proposée pour Livak et ses collègues pour analyser qPCR données24. Utiliser la tubuline ou actine comme gènes de référence pour calculer la ΔCt valeur et utilisent le contrôle approprié pour calculer la pour la valeur de ΔΔCt pour le traitement spécifique induisant la sénescence.
  5. Expression des protéines et la sécrétion d’IL6
    1. Semences 5-10 x 104 cellules dans au moins un puits d’une plaque de 6 puits (5.2 – 10,5 x 103 cellules/cm2) par condition contenant 2 mL de D10. Traitements (le cas échéant) peuvent être effectuées directement sur cette plaque, ou, les cellules traitées déjà peuvent également être ré-ensemencés dans une plaque de 24 puits. Laissez reposer toute la nuit après l’ensemencement.
    2. Enlever le support et le remplacer pour 2 mL de DMEM moyen sans FBS. Incuber dans des conditions normales pendant 24 h.
    3. Recueillir le milieu dans un tube de 15 mL.
    4. Centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 min moyenne peut être stockée à-80 ° C jusqu'à ce que les traités.
    5. Suivez les instructions du fabricant pour effectuer le test ELISA.
    6. Comparer les résultats des cellules sénescentes versus le contrôle approprié pour le traitement spécifique induisant la sénescence

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Résultats

Enrichissement de SA-β-gal de coloration dans les fibroblastes sénescents

Β-galactosidase (β-gal) est une enzyme lysosomiale qui s’exprime dans toutes les cellules et qui a un pH optimum de 4,025,26. Cependant, au cours de la sénescence, les lysosomes augmentent en taille et, par conséquent, les cellules sénescentes accumulent β-gal. Les quantités accrues de cette enzyme pe...

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Discussion

Les protocoles expliqués ici ont été optimisées pour des fibroblastes humains primaires, en particulier les cellules BJ et WI-38. Les protocoles pour la sénescence réplicative, rayonnements ionisants et la doxorubicine, ont été appliquées avec succès à d’autres types de fibroblastes (HCA2 et IMR90) et dans d’autres types de cellules (à savoir néonatales mélanocytes et kératinocytes ou cardiomyocytes dérivés iPSC) dans notre laboratoire. Toutefois, des adaptations pour les types de cellules supplémentaires peuvent être op...

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Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Demaria pour des discussions fructueuses et Thijmen van Vliet pour le partage de données et protocole sur la sénescence induite par l’UV.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Média DMEM - GlutaMAXGibco31966-047
Sérum de veau fœtalHycloneSV30160.03
Pénicilline-Streptomycine (P/S ; 10 000 U/ml)LonzaDE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichSC-202581
Eau sans nucléases (non traitée au DEPC)AmbionAM9937
Fiole T75Sarstedt833911002
Trypsine/EDTASolution LonzaCC-5012
Comprimés PBSGibco18912-014
Tubes à centrifuger de 1,5 mlSigma-AldrichT9661-1000EA
Corning  ; Tubes à centrifuger de 15 mLSigma-AldrichCLS430791
Plaque à 6 puitsSarstedt83.3920
Plaque à 24 puitsSarstedt83.3922
Lamelles rondes de 13 mmSarstedt83.1840.002
SteriflipMerck ChemicalsSCGP00525
CésiumSource 137IBL 637 Césium-137machine à rayons gamma
chambreOpsytec, Dr. Gö ; bel BS-02
Dichlorhydrate de doxorubicine  ;BioAustralis Fine ChemicalsBIA-D1202-1
Solution de peroxyde d’hydrogèneSigma-Aldrich7722-84-1
5-aza-2'-désoxycytidineSigma-AldrichA3656
SAHASigma-AldrichSML0061
Butyrate de sodium.Sigma-AldrichB5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta ;-D-galactopyranoside)Fisher Scientific7240-90-6
Acide citrique monohydratéSigma-Aldrich5949-29-1
Phosphate dibasique de sodiumAcros organics7782-85-6
Ferrocyanure de potassium  ;Fisher Scientific14459-95-1
Ferricyanure de potassiumFisher Scientific13746-66-2
Chlorure de sodiumMerck Millipore7647-14-5
Chlorure de magnésiumFisher Chemicals7791-18-6
25 % de glutaraldéhydeFisher Scientific111-30-8,7732-18-5
16 % de formaldéhyde (p/v)Thermo-Fisher Scientific28908
EdU (5-éthynyl-2'-désoxyuridine)Lumiprobe10540
Azoture de sulfo-cyanine3 (Sulfo-Cy3-Azide)LumiprobeD1330
Ascorbate de sodiumSigma-AldrichA4034
Sulfate de cuivre(II) pentahydraté (Cu(II)SO4.5H2O)Sigma-Aldrich209198
Triton X-100Acros organics215682500
base TRISRoche11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, blanc  ;Roche4729749001
Lightcycler 480 feuille d’étanchéité  ;Roche4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit  ;BiolineBIO-84020
UPL Bibliothèque de sondesSigma-AldrichDivers
Humains IL-6 DuoSet ELISAR& DD6050
Bio-Rad TC20Bio-Rad
Lames de comptageBio-Rad145-0017
Incubateur secThermo-Fisher ScientificHeratherm
DiméthylformamideMerck Millipore1.10983
Parafilm 'M' film de laboratoireBemis  ;
pince à épiler
aiguilles
à rayonnement UV #PM992

Références

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key? Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997(2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34(2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188(2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

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