Induction et la Validation de la sénescence cellulaire dans les cellules humaines primaires

Alejandra Hernandez-Segura; Simone Brandenburg; Marco Demaria

doi:10.3791/57782

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Article de méthode

Induction et la Validation de la sénescence cellulaire dans les cellules humaines primaires

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DOI :

10.3791/57782

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20 juin 2018

Alejandra Hernandez-Segura¹ , Simone Brandenburg¹ , Marco Demaria¹

¹European Research Institute for the Biology of Aging, University of Groningen, University Medical Center Groningen

Dans cet article

Résumé

Ici, nous discutons une série de protocoles pour l’induction et la validation de la sénescence cellulaire dans les cellules cultivées. Nous nous concentrons sur différents stimulus induisant la sénescence et décrire la quantification de marqueurs communs liés à la sénescence. Nous fournissons des détails techniques à l’aide de fibroblastes comme modèle, mais les protocoles peuvent être adaptés aux différents modèles cellulaires.

Résumé

Sénescence cellulaire est un état d’arrêt permanent cycle cellulaire activé en réponse à différents stimuli nocifs. Activation de la sénescence cellulaire est une caractéristique de diverses conditions physiopathologiques, y compris la suppression tumorale, remodelage et le vieillissement des tissus. Les inducteurs de la sénescence cellulaire in vivo sont encore mal caractérisés. Toutefois, un certain nombre de stimuli peut servir à promouvoir la sénescence cellulaire ex vivo. Parmi eux, les plus courantes de sénescence-inducteurs sont réplicative épuisement, ionisant et non ionisant, génotoxique drogues, stress oxydatif et demethylation et agents d’acétylation. Ici, nous fournirons des instructions détaillées sur l’utilisation de ces stimuli pour induire des fibroblastes en sénescence. Ce protocole peut être facilement adapté pour différents types de piles et de lignées cellulaires, y compris les cellules cancéreuses. Nous décrivons également différentes méthodes pour la validation de l’induction de la sénescence. En particulier, nous nous concentrons sur la mesure de l’activité de l’enzyme lysosomale associés à la sénescence β-galactosidase (SA-β-gal), le taux de synthèse de l’ADN à l’aide d’analyse 5-éthynyl-2'-déoxyuridine (EdU), les niveaux d’expression du cycle cellulaire inhibiteurs p16 et p21 et l’expression et la sécrétion des membres de la phénotype sécrétoire Senescence-Associated (SASP). Enfin, nous fournir les résultats de l’exemple et en discuter plus les applications de ces protocoles.

Introduction

En 1961, Hayflick et Moorhead a signalé que les fibroblastes en culture primaires perdent leur potentiel prolifératif après passages successifs¹. Ce processus est provoqué par le séquentiel raccourcissement des télomères après chaque division cellulaire. Quand les télomères atteignent une critique courte longueur, ils sont reconnus par la réponse de lésions de l’ADN (DDR) qui active un arrêt irréversible de prolifération — aussi défini comme la sénescence réplicative. La sénescence réplicative est actuellement l’un des nombreux stimuli qui sont connus pour induire un état de l’arrestation de cycle de cellules permanentes qui rend les cellules i....