Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour isoler efficacement les kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte. Cette méthode simplifie la procédure conventionnelle en utilisant le Y-27632 inhibiteur ROCK dans le milieu de l’inoculation pour séparer spontanément les cellules épidermiques des cellules dermiques.

Résumé

Des kératinocytes humains primaires isolés des tissus de la peau fraîche et leur expansion in vitro ont été largement utilisées pour la recherche en laboratoire et pour des applications cliniques. La méthode d’isolation classiques des kératinocytes humains implique une procédure en deux étapes séquentielles de la digestion enzymatique, qui s’est avérée inefficace dans la génération de cellules primaires provenant de tissus adultes en raison du taux de récupération des cellules faibles et cellulaire réduite viabilité. Nous avons récemment rapporté une méthode avancée pour isoler les cellules progénitrices épidermiques primaires humaines provenant de tissus de la peau qui utilise l’inhibiteur de kinase Rho Y-27632 dans le milieu. En comparaison avec le protocole traditionnel, cette nouvelle méthode est plus simple, plus facile et moins chronophage et augmente le rendement des cellules souches épithéliales et améliore leurs caractéristiques de cellules souches. De plus, la nouvelle méthodologie ne nécessite pas la séparation de l’épiderme, du derme et, est donc adaptée pour isoler les cellules de différents types de tissus adultes. Cette nouvelle méthode d’isolement surmonte les principales lacunes des méthodes conventionnelles et est plus adaptée pour produire un grand nombre de cellules épidermiques avec forte puissance pour laboratoire et pour des applications cliniques. Nous décrivons ici la nouvelle méthode en détail.

Introduction

L’objectif était d’élaborer un protocole simple et efficace pour isoler des kératinocytes humains primaires (HKCs) provenant de tissus adultes, en particulier pour des applications cliniques. Les cellules souches épidermiques peau, localisées dans la couche basale de la peau, possèdent un potentiel élevé de proliférer et de différencier et de fournir des kératinocytes pour maintenir les fonctions de la peau^{1,2,3, 4}. HKCs isolées de la peau, les tissus sont employés couramment pour peau tissu ingénierie et régénération, particulièrement dans....

Protocole

Les tissus humains utilisés dans le présent protocole ont été traités conformément aux directives du Comité d’éthique de l’Institution recherche humaine (NO.2015120401, date : 12 mai 2015).

1. les préparatifs

1. Tissus de la peau d’abdominale adultes frais virés écartés de chirurgie plastique à l’hôpital dans un tube de 50 mL avec 10 mL de Dulbecco glacee modifiée milieu Eagle (DMEM). L’échantillon peut être maintenu à 4 ° C pendant 72 h sans affecter sensiblement la viabilité des cellules.
2. Préparer les réactifs et le milieu de culture, tel que décrit ci-dessous.
   1. Ajouter 1 mL de pénicilline (100 U/mL) et à la strept....

Résultats

Diagrammes schématiques de la nouvelle méthode (Figure 1 a) et la méthode conventionnelle (Figure 1 b) sont présentés dans la Figure 1. La méthode conventionnelle est une digestion en deux étapes, qui nécessite une procédure de 2 jours. En revanche, la nouvelle méthode est une digestion en une seule étape, qui dure environ 3 heures à effectuer. Ce qui est important, la nouvelle méthode en une seule é.......

Discussion

HKCs primaires cultivées ont été largement utilisés pour traiter les plaies dans les cliniques pendant plus de trois décennies et, depuis lors, il a toujours été important obtenir efficacement un nombre suffisant de cellules pour des applications cliniques en temps opportun. Par conséquent, dans la pratique, la méthode conventionnelle d’isolement, qui requiert une séparation de l’épiderme du derme, rend difficile de répondre à ces demandes, en raison du faible rendement des cellules et la faible capacité de passage des c.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Compteur automatisé de cellules Countess	Invitrogen Inc.  ;	C10227	Comptage automatique des cellules  ;
Incubateur CO2	Thermo Scientific	51026333	Pour l’incubation cellulaire
Centrifugeuse Sorvall ST 16R Centrifugeuse	Thermo Scientific	75004380	Centrifugeuse
à cellules Agitateur à température constante	Shanghai Boxun	150036	Pour bain-marie
Balance électronique	Harbin Zhonghui	1171193	Pour le pesage de tissus
Plat de culture cellulaire	Eppendorf	30702115	Pour la culture cellulaire
50ml Tube à centrifuger	KIRGEN	171003	Pour centrifugeuse cellulaire
Crépine de cellule	Corning incorporé	431792	Filtration cellulaire
Solution tamponnée	au phosphate Solarbio Life Science  ;	P1020-500	Solution de lavage
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Composant du milieu de neutralisation
Défini K-SFM	Life Technologies	10785-012	Milieu de culture de cellules épidermiques
Pénicilline Streptomycine	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotiques
Sérum fœtal bovin	Biological Industries	04-001-1AC5	Composant du milieu de neutralisation
0,05 % Trypsine	Life Technologies	25300-062	Pour la dissociation HKC
0,25 % Trypsine  ;	Beijing Solarbio Science & Technologie	T1350-100	Pour la dissociation HKC
Kit de matrice d’enrobage	Life Technologies	R-011-K	Pour l’enrobage de la matrice
Dispase	Gibco	17105-041	Pour l’isolation HKC
Collagénase Type I	Life Technologies	17100-017	Pour l’isolement HKC
Déoxyribonucléase I	Sigma	9003-98-9	Pour l’isolation HKC
F12 Mélange de nutriments, Hams	Life Technologies	31765035	Composant du G-medium
B27 Supplément	Technologies	17504044	Facteur de croissance en G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Facteur de croissance en G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	Inhibiteur de ROCK
Fungizone	Gibco	15290026	Préparation pour
protéine humaine recombinante EGF G-medium	Gibco	PHG0311	Facteur de croissance dans le G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	tests de prolifération cellulaire et de cytotoxicité
Cytokératine anti-humaine chez la souris5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	Pour la coloration par immunofluorescence afin de vérifier le marqueur de différenciation des HKCs
Loricrine anti-humaine de lapin	Covance	PRB-145p	Pour la coloration par immunofluorescence afin de vérifier le marqueur de différenciation des HKCs Technologie de
signalisation cellulaire	anti-humaine Vimentine de souris	3390	Pour la coloration par immunofluorescence des fibroblastes dermiques
Intégrine et alpha ; 6(GOH3)	Santa Cruz  ;	SC-19622	Analyse par cytométrie en flux des HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz  ;	SC-2831	anticorps de contrôle négatif de &alpha ; 6-intégrine  ; en analyse par cytométrie en flux  ;

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