Suivi de l’Expression génique par la détection d’activité β-galactosidase dans des embryons de souris entière

Résumé

Nous décrivons ici le protocole standard pour la détection de l’activité β-galactosidase dans des embryons de souris tout au début et à la méthode paraffine sectionnement et contre-coloration. Il s’agit d’une procédure simple et rapide pour contrôler l’expression des gènes au cours du développement qui peut également être appliquée à des coupes de tissus, organes ou cellules en culture.

Résumé

Le gène de l’Escherichia coli LacZ , codant la β-galactosidase, est largement utilisé comme reporter pour l’expression des gènes et comme traceur dans les études de lignée de cellules. La réaction classique histochimique est issue de l’hydrolyse du substrat X-gal en combinaison avec les ions ferreux et ferreux, qui produit un précipité insoluble bleu qui est facile à visualiser. Par conséquent, activité β-galactosidase sert de marqueur pour le modèle d’expression du gène d’intérêt à mesure que le développement progresse. Nous décrivons ici le protocole standard pour la détection de l’activité β-galactosidase dans des embryons de souris tout début et la méthode suivante paraffine sectionnement et contre-coloration. En outre, une procédure pour clarifier les embryons entiers est fournie pour mieux visualiser le X-gal de coloration dans les régions plus profondes de l’embryon. Résultats cohérents obtenus à la suite de cette procédure, bien que l’optimisation des conditions de réaction est nécessaire pour réduire l’activité de fond. Limitations lors de l’essai devraient être considérées, notamment quant à la taille de l’embryon dans la coloration entière de support. Notre protocole prévoit un sensible et une méthode fiable pour la détection de la β-galactosidase lors du développement de souris qui peut s’appliquer davantage à la sections cryostat, mais aussi les organes entiers. Ainsi, les patrons d’expression de gène dynamique tout au long du développement peuvent être analysés facilement à l’aide de ce protocole dans les embryons entiers, mais aussi expression détaillée au niveau cellulaire peut être évaluée après le sectionnement de la paraffine.

Introduction

Afin de décrire des profils d’expression génique spécifique, l’utilisation de gènes marqueurs a été primordiale de drosophile aux mammifères. Dans les expériences impliquant des animaux transgéniques et knock-out, le gène de la β-galactosidase bactérienne (LacZ) d' Escherichia coli (e. coli) est l’un des plus largement utilisé^{1,2,3, 4}. β-galactosidase (β-gal) catalyse l’hydrolyse des β-galactosides (tels que le lactose) dans son monosaccharides (glucose et galactose)⁵. Son substrat ....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité sur l’éthique de l’expérimentation animale du CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) et de la Comunidad Autónoma de Madrid pour assurer minimal animal souffrant.

1. la collecte d’embryons de souris enceintes (à partir de E8.5 à E12.5)

1. Sacrifier des souris enceintes par dislocation cervicale ou inhalation de CO₂ . Le jour de la première observée plug vaginal était considéré comme embryonnaire jour 0.5 (E0.5).
2. Posez l’animal en position couchée sur le tampon absorbant et nettoyer la peau abdominale de la souris avec l’éthan....

Résultats

Ici, nous montrons les résultats de l’application du protocole standard pour la réaction histochimique de β-galactosidase en utilisant X-gal comme substrat dans des embryons de souris entière (Figure 1 et Figure 2). En utilisant ce protocole, nous examinons la Membrane type 4-matrice métalloprotéinases (mmp-Mt4) expression à différents stades de développement embryonnaires (E9.5, E11.5 et E12.5) en utilisant des souris mutantes M.......

Discussion

Le gène LacZ d’e. coli a été employé couramment comme reporter dans les études des profils d’expression génique en raison de sa grande sensibilité et de la facilité de détection. Le présent protocole décrit une méthode classique pour la détection des β-gal expression basée sur une réaction enzymatique qui est facile et rapide à jouer aussi bien que bon marché. Cette méthode peut être également appliquée sans modifications majeures dans des embryons de support entier, organes intacts, des sections de tissu cryost.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
FORTS
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	24137-1L-R
Agarose	SCHARLAU	50004/ LE3Q2014
Milieu de montage aqueux	VECTOR LABS	H-5501
Média de montage synthétique	MERCK	100579
96 % Ethanol	PROLABO
20824365 99,9 % d’éthanol absolu	SCHARLAU	ET00021000
50 % de glutaraldéhyde	solution SIGMA-ALDRICH	G6403-100ml
85 % de glycérol	MERCK	104094
99,9 % de glycérol	SIGMA-ALDRICH	G5516
Chlorure de magnésium hexahydraté	SIGMA-ALDRICH	63064
Tensioactif non ionique (Nonidet P-40)	SIGMA-ALDRICH	542334
Nuclear Fast Red contre-coloration	SIGMA-ALDRICH	N3020
Pastilles de paraffine	MERCK	111609
Paraformaldéhyde	SIGMA-ALDRICH	158127-500g
Solution saline tamponnée au phosphate (comprimés)	SIGMA-ALDRICH	P4417-50TAB
Ferrocyanate de potassium	MERCK	1049840500
Ferrocyanure de potassium	MERCK	1049731000
Azoture de sodium	SIGMA-ALDRICH	S8032
Désoxycholate de sodium	SIGMA-ALDRICH	30970
Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté	SIGMA-ALDRICH	106346
Phosphate de sodium dibasique dihydraté	SIGMA-ALDRICH	71638
Thymol	SIGMA-ALDRICH	T0501
Chlorhydrate de tris (Tris HCl)	SIGMA-ALDRICH	10812846001 (Roche)
X-GAL	VENN NOVA	R-0004-1000
Xylene	VWR CHEMICALS	VWRC28973.363
EQUIPMENT
Cryomoules jetables en plastique 15x15x5 mm	SAKURA	4566
Microtome rotatoire	Leica	RM2235
Cassettes	Oxford Trade	OT-10-9046
Lunettes de protection de microscope 24x60 mm	VWR	ECN631-1575
Lames de microscope	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄ ; SER	AGAA000001#12E
Lames de microscope à adhérence	Thermo Scientific, MENZEL-GLÄ ; SER	J1820AMNZ
Flottaison Bain-marie	Leica	HI1210
Lames de microtome jetables à profil bas	Feather	UDM-R35
Four à paraffine	J.R. SELECTA
parerreur de cire	J.R. SELECTA
Stéréomicroscope	Leica	DM500
Microtubes à centrifuger en polypropylène 2,0 mL	SIGMA-ALDRICH	T2795
Tubes à centrifuger en polypropylène 1,5 mL	SIGMA-ALDRICH	T9661
Agitateur orbital	IKA Labortechnik	HS250 BASIC
Agitateur Plaque chauffante	Bibby	HB502
Agitateur	Vortex IKA Labortechnik	MS1
Balance de laboratoire	GRAM	FH-2000
Balance de précision	Sartorius	ISO9001
pHmètre	Crison	Basic 20
Fibre optique	Optech	PL2000

2000205 Distributeur de 4000490