Method Article

Axée sur la biotine Pulldown dosage à Validate ARNm cibles cellulaires miARN

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce rapport décrit une méthode rapide et fiable pour la validation de cibles ARNm des miARN cellulaire. La méthode utilise biotinylé synthétique basé sur Locked Nucleic Acid LNA miRNA imite pour capturer les cibles ARNm. Par la suite, streptavidine des billes magnétiques travaillent à menu déroulant la cible ADN messagère pour la quantification par qPCR polymerase chain reaction.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroARN (miARN) sont une classe de petits ARN non codants qui post-traductionnelle régulent l’expression des gènes cellulaires. MiARN et la lier à la région 3' non traduite (UTR) de cibler les ARNm à inhiber la traduction des protéines ou dans certains cas entraîner une dégradation des ARNm. La liaison de la miRNA pour la région 3' UTR de la cible qu'adn messagère est médié par une séquence de graine de nucléotides de 2 à 8 à l’extrémité 5' de miRNA. Alors que le rôle des miARN comme molécules régulatrices cellulaires est bien établi, identification de l’ARNm cible avec pertinence fonctionnelle demeure un défi. Outils bioinformatiques ont été utilisées pour prédire les séquences au sein de la région 3' UTR des ARNm comme des cibles potentielles pour la liaison de miRNA. Ces outils ont également été utilisés pour déterminer la conservation évolutive de telles séquences entre espèces apparentées pour tenter de prédire le rôle fonctionnel. Cependant, ces méthodes de calcul souvent génèrent des faux positifs et se limitent à prévoir canonique interaction entre l’ARNm et miRNA. Par conséquent, les procédures expérimentales qui mesurent une liaison directe de miRNA vers sa cible d’ARNm sont nécessaires pour établir des interaction fonctionnelle. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode sensible pour valider une interaction directe entre le cellulaire miARN miR-125 b et les 3' UTR de PARP-1 ARNm. Nous élaborons un protocole dans lequel mimétiques synthétiques biotinylé-miRNA ont été transfectés dans des cellules de mammifères et le complexe de miRNA-ARNm dans le lysat cellulaire a été tiré vers le bas avec la Streptavidine des billes magnétiques. Enfin, la cible qu'adn messagère dans la complexe d’acides nucléiques tiré vers le bas a été quantifiée à l’aide d’une stratégie axée sur le qPCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroARN (miARN) est de petite taille non-coding RNAs qui régulent négativement protein expression1. Précurseurs de miRNA résident en grappes à travers de nombreuses régions du génome, plus fréquemment dans les régions intergéniques et les introns de2,de gènes codant pour des protéines3. Biogenèse des miARN impliquent la transcription de la pri-miARN de miRNA-codage gènes4. Le pri-miARN subissent un traitement séquentiel, dans le noyau, puis dans le cytoplasme pour produire seul brin miARN matures4,5. Par la suite, les miARN matures est incorporés dans le complexe silencieux RNA-induced (RISC) : un complexe de protéine-ARN de multimères qui comprend un membre de la famille Argonaute de protéines pour cible reconnaissance4,5, 6,7. MiARN matures dans le complexe RISC principalement se lie à la région 3' UTR de cibles ARNm8,9,10 , mais peut également lier occasionnellement dans le codage et la région 5' UTR des ARNm10,11 . La liaison du miARN à l’ARNm des séquences résultats translationnelle silencieux12,13,14 et dans certains cas de déstabilisation ARNm15. Puisqu’un seul miRNA peut cibler plusieurs ARNm, ces molécules régulatrices sont impliqués dans presque tous les processus cellulaires et ont été impliqués dans diverses maladies conditions16,17,18.

Compréhension détaillée de comment les miARN réglemente voies cellulaires exige une identification de l’ARNm cible. Il existe plusieurs plates-formes de bio-informatique prédire les processus putatif des interactions19,20. Ces prédictions s’appuient sur la parfaite Watson-Crick base appariement entre la séquence 2 – 8 graines des nucléotides de la miRNA et une séquence complémentaire au sein de la cible ADN messagère4,21. En outre, ces outils génèrent une structure secondaire du processus duplex, calculer les paramètres thermodynamiques de cette interaction moléculaire et voir la conservation des sites de liaison à travers les espèces afin d’améliorer la pertinence fonctionnelle de la cible prédiction. Malheureusement, ces outils ont également la limitation de la prédiction de faux objectifs faisait positives à un taux très élevé (~ 27 – 70 %)15,22. Plus important encore, ces plates-formes en silico ne reconnaissent pas les interactions non-canoniques des miARN avec leurs cibles23. Par conséquent, ces analyses prédictives sont souvent combinées avec des méthodes expérimentales pour valider les objectifs pertinents sur le plan fonctionnel.

Plusieurs approches ont été développées afin de valider expérimentalement les interactions des processus. Les expériences génétiques à l’aide d’imitations de miRNA, éponges et inhibiteurs qui modifient les niveaux des miARN dans la cellule fournissent des indices pour son effet régulateur sur la cible gene expression24,25,26. En outre, journaliste basé à dosages par co transfection d’un clone contenant la région 3' UTR de l’imite de miRNA et de l’ARNm cible ou inhibiteurs en cellules de fournissent la preuve de la fonction régulatrice des miARN26. Bien que ces méthodes sont essentielles étudier la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes de miARN, transfection efficacité et pleotropic effets des altérations cellulaires miRNA niveaux sont les principales limites de ces approches génétiques23, 26. Par conséquent, les méthodes biochimiques complémentaires qui sonde l’interaction directe entre les miARN et sa cible sont employés afin de mieux comprendre le fonctionnement cellulaire des miARN.

Une méthode couramment utilisée pour étudier l’interaction directe entre les miARN et sa cible est l’immunoprécipitation des complexes le RISC, suivie par la détection d’ARNm cible dans le complexe de27,28,,29,30 . Récemment, une méthode améliorée de piège RISC était également utilisée pour identifier les cibles de miRNA ; Il est couplé stabilisation des cibles dans les intermédiaires de RISC-miRNA-ARNm à la purification des cibles de l’ARNm. Cependant, ces methodsface les défis inhérents des interactions non spécifiques entre les ARN et la liaison à l’ARN des protéines qui sont habituellement séparés par compartiments cellulaires31,32. En outre, ces tests dépendent de la présence de la protéine AGO2 pour l’immunoprécipitation du complexe RISC33. AGO2 n’étant pas le seul argonaute de médier les interactions des processus efficaces, exclusion des autres argonautes pourrait conduire à des résultats biaisés34. Par conséquent, des stratégies alternatives sont nécessaires pour étudier la liaison directe de miRNA d’ARNm.

Dans ce rapport, nous élaborons une approche en une seule étape pour sonder une interaction directe entre un miRNA et sa cible ADN messagère. Tout d’abord, 3' biotinylated verrouillé d’acide nucléique (LNA) miRNA imite est transfectés dans des cellules de mammifères. Ensuite, le processus complexe dans le lysat cellulaire est capturées à l’aide de billes magnétiques de streptavidine enduite. La cible de l’ARNm liée à sa complémentaire miRNA est quantifiée à l’aide de qPCR.

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Protocol

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1. la transfection de 3'-biotinylé miRNA

Remarque : Effectuez les opérations suivantes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile.

  1. Semences 4 x 10,5-5 x 105 HEK-293 t cellules / puits dans 2 mL d’achever modifié Eagle (DMEM de Dulbecco) [DMEM additionné de 10 % de sérum foetal bovin (FBS) et 1 x antibiotique strep-Pen]. La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C, 5 % CO2 pendant la nuit.
  2. Le lendemain, vérifier la santé et l’adhérence des cellules plaqués sous un microscope optique.
    Remarque : Assurez-vous que les cellules ont adhéré et atteint la morphologie appropriée avant de passer à l’étape suivante. Les cellules HEK-293 t sont généralement prêtes pour la transfection 18 – 24 heures post placage.
  3. Dans un tube à centrifuger stérile de 1,7 mL, diluer 75 picomoles de biotinylé miRNA dans 200 µL de milieu essentiel minimal. Transférer ce mélange dans un autre 1,7 mL microtubes tube contenant un Liposome transfection basée réactif (8 µL/puits) dilué dans 200 µL de milieu essentiel minimal. Mélanger soigneusement, mais doucement, en pipettant également et incuber pendant 20 à 25 min à température ambiante pour permettre la formation de complexes transfection.
  4. Retirez la plaque de culture bien 6 anciens médias en pipettant également, doux et de reconstituer chaque puits avec 1,6 mL de fraîchement préparée DMEM complet (sans 1 x antibiotiques strep-Pen).
  5. Ajouter goutte-à-goutte les complexes de transfection (de 1,3) aux cellules de la plaque 6 puits à l’aide d’une pipette bien calibrée. Agiter doucement la plaque tout en y ajoutant les complexes afin d’assurer leur répartition uniforme dans l’ensemble de la plaque.
    Remarque : Cette étape est très critique pour la réalisation de transfection de haute efficacité et doit être effectuée avec soin et patience.
  6. La culture des cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant au moins 36 h.

2. préparation de la Streptavidine recouvert de billes magnétiques — j’ai

  1. Remettre en suspension les billes magnétiques de streptavidine soigneusement au vortex. Transférer 30 µL de suspension de la perle (par exemple) à un tube à centrifuger exempte de nucléase 2 mL.
  2. Placer le tube contenant la suspension de la perle sur le stand de séparateur de billes magnétiques (« aimant » ci-après) pendant 2 min. Après s’être assuré que les perles sont attirés par le côté du tube en contact avec l’aimant, retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une micropipette.
  3. Ajouter 100 µL de tampon de lavage perle (10 mM Tris-Cl pH de 7,5, EDTA de 0,5 mM, 1 M NaCl) aux talons. Retirer le tube de l’aimant. Vortexer pendant 15 s à température ambiante pour laver les perles.
  4. Placer le tube contenant l’aimant pendant 2 min, les perles et soigneusement retirer et jeter le surnageant.
  5. Répétez les étapes 2.3 et 2.4 pour un total de trois lavages. Après l’étape de lavage final, retirez le tube de l’aimant.
  6. Ajouter 100 µL de RNase libérant une solution (NaOH 0,1 M, 0,05 M NaCl) aux talons, mélanger bien au Vortex pendant 15 s et incuber à température ambiante pendant 5 min. Placer le tube contenant l’aimant pendant 2 min, les perles et soigneusement retirer et jeter le surnageant.
  7. Répétez l’étape 2.6 pour un total de trois fois.
  8. Ajouter la solution de remise en suspension de perle (0,5 M de NaCl) aux talons, vortex 15 s et incuber à température ambiante pendant 5 min. Placer les billes remises en suspension sur l’aimant pendant 2 min et retirer délicatement le surnageant.
  9. Ajouter 200 µL de perle bloquant la solution (µg 1/µL BSA, 2 µg/µL tRNA de levure) aux talons. Mélange doux Vortexer pendant 15 s à température ambiante. Incuber à 4 ° C pendant 16 h (nuit) sur un rotateur multitube.

3. préparation des lysats cellulaires

  1. Récolter les cellules HEK-293 t transfectées en grattant doucement à l’aide d’un grattoir de cellules stériles à l’intérieur de la hotte laminaire, puis transférer chaque échantillon dans un tube à centrifuger stériles de 2 mL.
  2. Pellet les cellules grattées par centrifugation à 1 500 g pour 5 min. Resuspendre le culot dans 1 x PBS stérile (tampon Phosphate salin), pH 7,2. Centrifuger à nouveau à 1 500 g pendant 5 min obtenir un culot gratuit des restes de fluides. Immédiatement plonger le tube contenant des granulés dans la glace.
  3. Préparer le tampon de lyse cellulaire complet frais (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH à 7,5, 5mM DTT, 0,5 % IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 x inhibiteur de protéase).
    Remarque : Un stock de tampon de lyse cellulaire manque cocktail inhibiteur de la protéase, Superase et IGEPAL peut-être être préparé à l’avance et conservé à température ambiante. Préparer un nouveau lot de tampon de lyse cellulaire complet en ajoutant des suppléments ci-dessus aux concentrations finales recommandées pour le tampon de lyse cellulaire stock et en stockant sur glace.
  4. Ajouter 260 µL de tampon de lyse cellulaire complet glacée à chaque échantillon dans le tube à centrifuger (c.-à-d., chaque tube à centrifuger contienne des cellules prélevées d’un puits de la plaque 6 puits) et Resuspendre le culot dans une suspension homogène de pipetage.
  5. Lyse des cellules à l’aide de la méthode de gel / dégel : Incuber les tubes à-80 ° C pendant 10 à 15 min. Ensuite, permettre les cellules à dégeler sur la glace.
  6. Centrifuger la cellule résultante lysate à 16 000 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse de paillasse réfrigérés à 4 ° C.
  7. Transférer la cellule défrichée lysate d’un tube à centrifuger stérile de 1,7 mL sur la glace. Jeter le culot.
    Remarque : Le volume final d’effacées lysat devrait être ~ 240 – 250 µL.
  8. Ajouter 5 M NaCl à la défrichées lysat à une concentration finale de 1M et de maintenir les échantillons sur la glace.

4. préparation des billes magnétiques de streptavidine — II

  1. Préparer le tampon de lavage de menu déroulant complet frais (KCl 10 mM, 1,5 mM MgCl2, pH 10 mM Tris-Cl 7.5, 5 mM TNT, 1 M NaCl, 0,5 % IGEPAL, 60U/mL Superase et cocktail inhibiteur de la protéase 1 x)
    Remarque : Un stock de tampon de lavage de la liste déroulante manque cocktail inhibiteur de la protéase, Superase et IGEPAL peut être préparé à l’avance et conservé à température ambiante. Préparer un nouveau lot de tampon de lyse cellulaire complet en ajoutant des suppléments ci-dessus aux concentrations finales recommandées pour le tampon de lyse cellulaire stock et en stockant sur glace.
  2. Placer le tube contenant les perles préparés (de l’étape 2,9) sur l’aimant pour 2 min. Retirez avec précaution et éliminer le surnageant.
  3. Ajouter 150 µL de tampon de lavage glacée à menu déroulant complet aux talons. Vortexer pendant 15 s et incuber à température ambiante pendant 30 à 60 s. Place les tubes sur l’aimant pour 2 min. Retirer soigneusement et éliminer le surnageant.
  4. Répétez l’étape 4.3 pour un total de 3 fois.
  5. Remettre en suspension les perles dans 300 µL de tampon de lavage complet de menu déroulant.

5. menu déroulant des cibles ARNm-miRNA Complexes

  1. Transférer 300 µL du lysat cellulaire (de l’étape 3,8) pour le tube à centrifuger contenant 300 µL de perles (de l’étape 4.5).
  2. Incuber le mélange sur un mélangeur oscillant pendant 1 h à température ambiante.
  3. Placer le tube sur l’aimant pour 5 min. Retirez avec précaution et éliminer le surnageant.
  4. Ajouter 300 µL de tampon de lavage glacée à menu déroulant complet aux talons. Vortexer pendant 15 s à température ambiante et place le tube sur l’aimant pendant 5 min. Retirez délicatement et éliminer le surnageant.
  5. Répétez l’étape 5.4 deux fois plus.
  6. Remettre en suspension les perles dans 100 µL d’eau exempte de nucléase et incuber sur glace.

6. total Extraction de l’ARN, synthèse de cDNA et qPCR

  1. Extraire l’ARN total les billes remises en suspension (de l’étape 5,6) utilisant une méthode appropriée (voir Table des matières). Remettre en suspension l’extrait de l’ARN total dans 25 µL d’eau exempte de nucléase. Déterminer la concentration d’ARN et de la qualité à l’aide d’un spectrophotomètre (absorbance à 260/280). Préparation d’un stock de travail de l’ARN à 50 ng/µL.
  2. Effectuer la synthèse de cDNA, en géométrie, en utilisant 50 ng d’ARN total (de l’étape 6.1) à l’aide d’une synthèse de cDNA appropriée nécessaire (voir Table des matières) à l’aide des amorces oligo dT dans un volume final de 20 µL (tableau 1). Ensuite, charge à la tubes PCR dans l’instrument de qPCR pour effectuer des cycles thermiques selon les conditions décrites dans le tableau 2.
  3. Effectuer qPCR sur l’ADNc (de l’étape 6.2) à l’aide de chimie SYBR Green (voir Table des matières) :
    1. Effectuer toutes les réactions de qPCR en géométrie dans une plaque de fond bien claire 96 dans des conditions stériles.
    2. Aliquote 9 µL du mélange réactionnel de qPCR master mix (voir tableau 3) dans chaque puits de la plaque. Ensuite, ajouter 1 µL de l’ADNc dans chaque puits afin d’obtenir un volume final de 10 µL. flasque de la PCR à l’aide de film adhésif résistant à la chaleur PCR et charger dans l’appareil qPCR
    3. Effectuez des cycles thermiques selon les conditions décrites dans le tableau 4.
    4. Normaliser les niveaux d’expression de chaque échantillon pour les niveaux d’expression du contrôle brouillé (valeurs de Ct). Utilisez ces valeurs pour calculer le pli des changements dans l’expression.

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Results

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MiARN réglemente les processus cellulaires en se liant à l’ARNm cible. Identification des cibles ARNm sont donc une clé pour comprendre le fonctionnement du miRNA. Ici, nous élaborons une méthode pour identifier les cibles ARNm de miRNA cellulaire. Ce protocole est adapté à partir de Wani et al. 35 avec la modification d’utilisant biotinylé axée sur la LNA miRNA imite à menu déroulant cibles ARNm. L’utilisation des oligonucléotides axée sur la LNA imite am...

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Discussion

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Identification de cibles ARNm des miARN cellulaire est importante pour comprendre leur fonction régulatrice. Plusieurs outils informatiques sont utilisés pour prédire des cibles fondées sur la complémentarité de séquence de semences et de la conservation de cible séquences19,20. Bien que ces outils sont utiles, ils peuvent générer des niveaux élevés de faux positifs et faux négatifs. Par conséquent, ces prédictions sont couplées avec des méthodes expérimentales c...

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Disclosures

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Les auteurs déclarent sans intérêts financiers et non financiers concurrents.

Acknowledgements

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Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (NIH) subventions DA037779 (à J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 et MD007586 (au C.D.). Le travail a été également soutenu par la RCMI Grant G12MD007586, les Vanderbilt CSTC Grant UL1RR024975, le centre de recherche translationnelle Meharry (MeTRC) CSTC accorde (U54 RR026140 de RRRNC/NIH, le U54 Grant MD007593 de NIMHD/NIH et le centre du Tennessee pour le sida Recherche (P30 AI110527).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lignées cellulaires HEK293T cellulesATCCCRL-3216
Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (Hi-FBS)GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
Trypsine-EDTA (0,25 %)  ;GIBCO/Thermofisher25200-056
Pénicilline-Streptomycine solution (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNase  ;AmbionAM2238
Opti-MEM Milieu sérique réduitGIBCO/Thermofisher3198-088
Liopfectamine 2000 Réactif de transfectionInvitrogen/ Thermofisher11668-019
Has-miR-125b BiotinyléExiqon339178/ID-27281622
Contrôle brouillé biotinyléExiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
Streptavidine Perles magnétiquesPierce88816
ARNt de levureInvitrogen/Thermofisher15401-011
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA2153
Solution de chlorure de potassium (KCl)Sigma-Aldrich60142
Chlorure de magnésium (MgCl2)Sigma-AldrichM1028
Hydroxyde de sodium (NaOH)Sigma-Aldrich795429
Acide éthylènediamine tétraacétique, solution de sel disodique (EDTA), 0,5 M, pH 8,0Sigma-AldrichE7889
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
SuperaseAmbion/ThermofisherAM2694
Cocktail d’inhibiteurs de protéaseSigma-AldrichP8340
Eau libre RNAse/DNAseGIBCO/Thermofisher10977-015
RNeasy extractionkit Qiagen74104
iScript-Select kit de synthèse d’ADNcBiorad170-8897
qPCR Amorces  ;Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermixBiorad172-5120
DynaMag-SpinMagnet Invitrogen/Thermofisher12320D

References

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