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Article de méthode

Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique

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DOI :

10.3791/57796

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3 juillet 2018

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1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit des méthodes spécifiques pour obtenir des quantités biochimiques de TRPV1 solubilisée détergent pour analyse spectroscopique. Les protocoles combinés offrent des outils biochimiques et biophysiques qui peuvent être adaptées afin de faciliter les études structurales et fonctionnelles des canaux ioniques mammifères dans un environnement contrôlé en membrane.

Résumé

Canaux ioniques polymodal transduce multiples stimuli de différentes natures allostérique de l’évolution ; ces conformations dynamiques sont difficiles à déterminer et demeurent largement inconnus. Avec les progrès récents en lumière délestage de la particule cryo-electron microscopy (cryo-EM) sur les caractéristiques structurales des sites de fixation agoniste et le mécanisme d’activation de plusieurs canaux ioniques, le décor est planté pour une analyse approfondie et dynamique de leurs processus de blocage mécanismes utilisant des méthodes spectroscopiques. Techniques spectroscopiques comme la résonance paramagnétique électronique (RPE) et électron-électron double résonance (cerf) ont été principalement limités à l’étude des canaux ioniques procaryotes qui peut être purifié en grandes quantités. L’obligation pour les grandes quantités de protéines membranaires fonctionnelle et stable a entravé l’étude des canaux d’ion mammifères à l’aide de ces approches. EPR et DEER offre de nombreux avantages, y compris la détermination de la structure et des changements dynamiques des régions de la protéine mobile, mais à basse résolution, ce qui pourrait être difficile d’obtenir par cristallographie aux rayons x ou cryo-EM, et suivi d’une ouverture de porte réversible transition (c.-à-d., fermée, ouverte, sensibilisés et désensibilisés). Ici, nous fournissons des protocoles pour l’obtention de milligrammes de récepteur transitoire fonctionnel solubilisée détergent potentiels cation V membre du subfamily canal 1 (TRPV1) qui peut être marqué pour la spectroscopie RPE et le cerf.

Introduction

Avec les progrès récents dans la particule cryo microscopie électronique (cryo-EM), structures de canal ionique mammifères ont été obtenus à un rythme extraordinaire. En particulier, des études structurales des canaux ioniques de polymodal, tels que le récepteur transitoire potentiels VANILLOÏDE 1 (TRPV1), ont fourni davantage comprendre son activation des mécanismes1,2,3, 4 , 5. Toutefois, des informations dynamiques sur les canaux ioniques intégrée dans un environnement membranaire sont nécessaires pour comprendre leurs mécanismes de blocage et drogue-liaison polymodal.

Résonance paramagnétique électronique (RPE) et la spectroscopie de résonance (cerf) double électron-électron ont fourni certains des modèles mécanistes plus définitifs pour ion canaux6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. ces approches ont été principalement limitées à l’examen des procaryotes et des canaux d’archeal ion qui produisent une grande quantité de protéines purifiées détergent lorsque surexprimée dans les bactéries. Avec le développement de la production de protéines eucaryotes membrane dans l’insecte et des cellules de mammifères pour la caractérisation structurale et fonctionnelle de15,14,16, il est maintenant possible d’obtenir biochimiques quantités de protéines purifiées détergent pour études spectroscopiques.

Les signaux RPE et DEER découlent d’une étiquette de paramagneticspin (SL) (p. ex., méthanethiosulfonate) fixée à un résidu cystéine-unique dans la protéine. Les marqueurs de spin rapport trois types d’informations structurelles : motion, accessibilités et distances. Ces informations permettent de déterminer si les résidus sont enterrés dans la protéine ou sont exposés à la membrane ou le milieu aqueux dans l’apo et le ligand lié aux États13,17,18,19. Dans le cadre d’une structure à haute résolution (si disponible), les données de l’EPR et le cerf fournissent une collection des contraintes qui fixeront les modèles dynamiques dans leur environnement natif tout en surveillant réversible gating transition (c.-à-d., fermée, ouverte, sensibilisés et désensibilisés). En outre, régions flexibles qui peuvent être difficiles de déterminer par cristallographie aux rayons x ou cryo-EM pourraient être obtenues en utilisant ces ensembles de données environnementales pour attribuer les structures secondaires ainsi que l’emplacement au sein de la protéine20. Structures de Cryo-EM obtenues en lipides nanodiscs a fourni des informations précieuses sur le déclenchement de l’ion canaux3,21,22,23,24, 25; Cependant, méthodes spectroscopiques pourraient fournir des informations dynamiques des États conformationnels (p. ex., changements thermiques) qui peut être difficile de déterminer à l’aide de cryo-EM.

Nombreuses difficultés doivent être surmontées pour implémenter l’EPR et les cerfs, notamment le manque de fonction de protéine en enlevant tous les résidus de cystéine (particulièrement abondants dans les canaux de mammifères), rendement faible en protéines, l’instabilité de la protéine durant la purification et après marquage de spin et l’agrégation de la protéine de détergent ou de liposomes. Ici, nous avons conçu des protocoles à surmonter ces obstacles essentiels et ont obtenu des renseignements de spectres DEER et EPR pour un récepteur sensoriel chez les mammifères. Le but ici est de décrire les méthodologies pour la construisent de l’expression, purification, étiquetage et reconstitution d’un rat fonctionnelle de la cystéine-moins minime TRPV1 (eTRPV1) pour les analyses spectroscopiques. Cette méthode est appropriée pour les protéines de la membrane qui gardent leur fonction malgré l’élimination des résidus de cystéine ou qui contiennent des cystéine formant des ponts disulfures. Cette collection de protocoles pourrait être adaptée pour l’analyse spectroscopique d’autres canaux d’ion chez les mammifères.

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Protocole

1. TRPV1 mutagenèse

Remarque : Une construction TRPV1 minimale pour l’analyse spectroscopique26 fut construite entre le canal de cystéine-moins long TRPV127 à l’aide de la méthode de réaction en chaîne (PCR) polymérase (Figure 1). Cette construction de cystéine-moins TRPV1 minime (ci-après comme eTRPV1) est composé de résidus 110-603 et 627-764. eTRPV1 a été cloné en pMO (un pcDNA3.1 vectoriel) pour l’analyse fonctionnelle et un vecteur recombinant donneur28 qui contenant 8 x protéines histidine-liant le maltose (MBP)-tabac etch virus (TEV), expression et purification (Figure 2 a). cystéine de single–eTRPV1 mutants ont été générés à l’aide de mutagenèse dirigée. Séquences de vecteur et de canal sont spécifiées dans le supplémentaire 1 fichier : méthodes complémentaires.

  1. Concevoir des amorces de mutagenèse avec des outils en ligne29.
  2. Mélanger dans un tube à 0,2 mL : 5 μL de 10 x tampon de réaction, 1 μL de mélange dNTP (100 mM), 1 μL de 10 μM et inverses des oligonucléotides, 1 μL de modèle d’eTRPV1 100 ng/μL ADN26, 1,5 μL de DMSO, 1 μl d’enzyme de mutagenèse et 38,5 μL d’eau désionisée. Tourner le mélange avant de placer les tubes dans le thermocycleur.
  3. Effectuer la mutagénèse PCR.
    1. Effectuer une dénaturation à 95 ° C pendant 2 min, et (b) la dénaturation à 95 ° C pendant 20 s, (c) recuit à 60 ° C pendant 10 s et d allongement à 68 ° C pendant 4 min (30 s par 1 Ko). Répétez les étapes b à d de 18 cycles, puis effectuer l’allongement à 68 ° C pendant 5 min et maintenir la réaction à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  4. Ajouter 2 μL de Dpnj’ai enzymatique à la réaction ; mélanger et puis incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  5. Effectuer la transformation
    1. Décongelez les cellules compétentes d’Escherichia coli sur la glace.
    2. Dans un tube stérile un refroidissement préalable de 14mL, ajouter 75 μl de cellules compétentes et 10 μL de mélange PCR j’ai traités Dpn. Mélanger doucement.
    3. Incubez la réaction sur la glace pendant 30 min. maintenir le tube à 42 ° C pendant 45 s puis immédiatement Placez-le sur la glace pendant 2 min. plaque le mélange sur le bouillon Luria (LB)-Gélose contenant la carbénicilline (0,2 mg/mL). Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C.
    4. Récolter au moins trois colonies individuelles de la plaque et ensemencer chacun dans 4 mL de LB contenant la carbénicilline (0,2 mg/mL) à l’aide d’un tube stérile de 14 mL. Incuber les cultures pendant une nuit à 37 ° C et agiter à 250 tr/min.
    5. Tournez en bas des cultures durant la nuit à 8 000 x g pendant 10 min et extraire l’ADN suivant les instructions de trousses de préparation mini disponibles dans le commerce.
    6. Vérifier la présence de mutants de single-cystéine par séquençage automatisé standard (voir la Table des matières).

2. functional Analysis of Single-cystéine Mutants et d’eTRPV1

  1. Transfection de ligne HEK293 cellulaire 30
    1. La culture de cellules HEK293 dans 6 - plats dans 2 mL de milieu de l’hyperglycémie (DMEM) / puits (37 ° C, 5 % CO2, 95 % humidité). Préparer les cellules HEK293 qui sont 70 \u2012 80 % anastomosé.
    2. Préparer le mélange de transfection dans deux tubes distincts de micro-centrifugeuse 1,5 mL.
      1. Pour la réaction A, ajouter 0,5 µg eTRPV1 ou la cystéine contenant du mutant pMO à 250 µL de milieu minimal essentiel (p. ex. Opti-MEM). Pour la réaction B, ajouter 3 µL de réactif de transfection de 250 µL de milieu minimal essentiel. Incubez chaque réaction pendant 5 min à température ambiante (RT).
      2. Mélanger les réactions A et B avec une pipette 1 mL. Incuber le mélange pendant 45 min à température ambiante.
    3. Retirer 500 µL de milieux de culture depuis le confluent de 70-80 % bien et ajouter 500 µL du mélange réactionnel. Ranger les assiettes du jour au lendemain pour Ca2 + d’imagerie (37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité).
  2. Ca2 + imagerie dans les cellules HEK293 30
    1. Nettoyer les lamelles de verre 12 mm de diamètre avec l’éthanol et l’eau et les placer dans une plaque de 24 puits.
    2. Ajouter 75 µL de la poly-l-lysine dans le centre de chaque lamelle et stocker la plaque pendant 45 min (37 ° C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité).
    3. Retirez l’excès lamelles poly-l-lysine et laver trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour enlever tout résidu.
    4. Une fois que les lamelles sont prêts, procéder pour détacher des cellules de la plaque 6 puits.
    5. Retirez le support et ajouter 500 µL de PBS tiède (37 ° C) pour le lavage.
    6. Supprimer les PBS, ajouter 500 µL de trypsine et incuber pendant 1 min.
    7. Ajouter 500 µL de milieux de culture chaude (37 ° C) pour arrêter la réaction de la digestion et mélanger avec la pipette. éviter la formation de bulles. Si nécessaire, ajuster la concentration en cellules Diluer cette resuspension avec plusieurs milieux de culture.
    8. 250 µL de cellules HEK293 transfectées (confluent de 70 %) des graines plus 250 µL de milieux de culture (500 volume final µL / puits) sur les lamelles pré-traitées et laissez-les s’installent (à joindre) pour 1-2 h dans l’incubateur (37 ° C, 5 % CO2, 95 % d’humidité).
    9. Pendant ce temps, préparer une solution de chargement en ajoutant l’acide Pluronique 0,02 % et 1 µM Fluo-4-AM au tampon d’une solution de Ringer. Bien mélanger la solution.
    10. Retirer les milieux de culture HEK293 du puits et ajouter 500 µL de la solution de chargement. Incuber les cellules pendant 1 h (37 ° C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité). Laver les cellules Fluo-4-chargé deux fois avec un tampon de Ringer chaud.
    11. Placez un lamelle couvre-objet avec cellules chargées dans un plat de Pétri de 10 mm dans une platine du microscope (avec un 10 X objectif ; 494 nm excitation et 506 nm d’émission) pour effectuer des mesures intracellulaires de Ca2 + .
    12. Mesurer les changements dans l’intensité de fluorescence après perfusant les ligands respectifs (par exemple, 10 μM capsaïcine) à l’aide de logiciels disponibles sur le marché (voir Table des matières).
  3. ARNm et préparation des ovocytes de Xenopus laevis 30
    1. Linéariser eTRPV1 et single-cystéine contenant des mutants pMO avec Pmej’ai pendant 1 h à 37 ° C. ADN propre suivant les instructions de kits de purification disponible dans le commerce.
    2. Utilisation linéarisé et nettoyé l’ADN pour synthétiser RNAs plafonnés avec un kit commercialement disponible compatible avec l’ARN polymérase T7.
    3. Nettoyer le RNAs plafonnés selon des kits de purification disponible dans le commerce. Quantifier la quantité de RNA en mesurant l’absorbance à la longueur d’onde de 260 nm.
    4. \U2012 transfert 5 10 mL d’ovocytes X. laevis (disponibles dans le commerce) dans un tube conique de 50 mL contenant 20 mL de solution de ND96 (96 mM NaCl, KCl, 5 mM HEPES, 2 mM 1 mM MgCl2; pH 7,4) avec la collagénase de 1 mg/mL et nutate pendant 50 min à température ambiante.
    5. Rincez les ovocytes dans ND96 jusqu'à ce que la solution est claire ; Ajouter frais collagénase et agiter pendant 30 min à RT. Examinez les ovocytes sous un microscope stéréo et la digestion s’arrête lorsque la couche extérieure folliculaire (couche brillant avec les vaisseaux sanguins rouges) est absente dans la plupart des ovocytes (90 %). Rincez les ovocytes dans ND96 jusqu'à ce que la solution est claire.
    6. Transfert des ovocytes dans un tube de 50 mL en polystyrène avec ND96 plus 1 mM CaCl2 et secouer pour les ovocytes digérés sous 1 h. collera au tube en polystyrène.
    7. Laver les ovocytes avec ND96 plus 1 mM CaCl2 et supplément solution avec 50 µg/mL de gentamicine et de 50 µg/mL de tétracycline.
      Remarque : Protéger les solutions contenant tétracycline d’exposition à la lumière.
    8. Sélectionnez gros ovocytes sans membranes endommagées et en affichant une nette séparation entre l’animal et végétales pôles. Laisse les ovocytes à récupérer pendant 4 h avant microinjection à 16 ° C.
    9. Utiliser des pipettes en verre (O.D. : 1,11 mm, diamètre intérieur : 0,5 et longueur 8,8 cm) 1-5 ng d’ADN messagère de mutants eTRPV1 et single-cystéine d’injecter dans les ovocytes en utilisant un système d’injecteur nanolitre (46 nL/s) et un microscope stéréo (2 X grossissement). Stocker les ovocytes à 16 ° C en ND96 additionné de CaCl2 et antibiotiques (gentamicine/tétracycline 1 x).
    10. Après 72 h, mesurer le courant macroscopique à l’aide de deux électrodes de voltage clamp (TEVC) acquisition système31.
    11. Tirez sur les pipettes en verre borosilicaté (0,3 MΩ) et remplissez-les de 3M KCl.
    12. Placer l’ovocyte dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette de transfert et perfuse la solution bain (120 mM NaCl, KCl, 2 mM solution de MgCl2, EGTA 1 mM et 10 mM HEPES à 2 mM, pH 7,4) à faible vitesse.
    13. Plonger les deux électrodes dans la solution du bain pour ajuster leurs décalages de pipette. Poussez doucement les électrodes de la pipette (pipettes de verre borosilicaté ; O.D. : 1,5 mm, diamètre intérieur : 1.10 et longueur 10 cm) dans l’ovocyte jusqu'à ce qu’une minuscule échancrure est observée sous un microscope stéréo (2 X grossissement), ainsi qu’un changement dans le potentiel de membrane.
    14. Changer les réglages de l’amplificateur à la mode et la mesure des courants macroscopiques d’enregistrement tout en appliquant une rampe de voltage clamp de -80 à + 80 mV pour 1 s. charge le système de perfusion avec la solution utilisée dans l’étape 2.3.12 à pH 7,4 (sous forme de contrôle) et à pH 5 pour vérifier l’activité eTRPV1.

3. générer la recombinaison Bacmid et Baculovirus pour l’Expression de la protéine

  1. Bacmid
    1. Transformer 100 μL de DH10Bac e. coli cellules compétentes avec 7,5 ng du vecteur recombinant donneur contenant des mutants eTRPV1 et/ou single-cystéine.
    2. Ajouter 900 μL de médias SOC (20 mg/mL Tryptone, 5 mg/mL extrait de levure, KCl 2,5 mM, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4et 20 mM de glucose) et incuber pendant 6-7 heures à 37 ° C et 225 t/mn.
    3. 100 µL directement à partir du mélange et de dilutions en série des graines (1/10 et 1/100), en LB-géloses contenant 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, 7 μg/mL gentamicine, 10 tétracycline μg/mL et la kanamycine 50 μg/mL. Incuber les boîtes pendant au moins 48 h à 37 ° C.
    4. Sélectionner des colonies blanches qui sont de 2 mm de diamètre, car colonies bleues n’ont pas l’insertion d’intérêt. Utiliser un microscope stéréo pour vérifier que les colonies blanches ne contiennent pas toutes les taches bleues.
    5. Récolter au moins trois colonies individuelles et de les transférer dans un tube de 14 mL stérile contenant 4 mL de milieu LB avec 7 μg/mL gentamicine, 10 tétracycline μg/mL et 50 kanamycine μg/mL. Incuber les cellules pendant la nuit (~ 16 h) à 37 ° C et 250 tr/min.
    6. Prendre 1,5 mL des cultures pendant la nuit et isolat bacmid recombinant DNA (voir le fichier 1 supplémentaire pour le protocole détaillé). Stocker le bacmid à 4 ° C pendant deux mois.
      Remarque : Préparer les stocks de glycérol de DH10Bac de e. coli contenant l’ADN de bacmid. Prendre 300 μL de la culture et ajouter 200 μl de glycérol à 50 % (concentration finale de glycérol de 20 %). Conserver l’aliquote à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
    7. Vérifier la présence d’eTRPV1 dans la bacmid recombinant par PCR (voir 1 de fichier supplémentaire pour protocole détaillé).
  2. Baculovirus
    Remarque : Pour cette procédure, transfecter des cellules d’insecte Sf9 dans un format de 6 puits. Toutes les quantités et les volumes sont donnés sur une base par puits. Éviter l’utilisation d’antibiotiques.
    1. Plaque de 1 x 106 Sf9 cellules dans 2 mL de milieux cellulaires insectes. Permettre aux cellules d’attacher pendant au moins 45 min.
    2. Diluer 1 μg de bacmid recombinant DNA dans 100 μl de milieux cellulaires insectes. Mélanger doucement.
    3. Diluer 100 μl de milieux cellulaires insectes 6 μl de réactif de transfection (TR). Mélanger doucement.
    4. Combiner les solutions d’ADN et TR (des étapes 3.2.2 et 3.2.3, respectivement). Mélanger doucement et laisser incuber 30 min à température ambiante.
    5. Ajouter 0,8 mL de milieux cellulaires insectes au mélange ADN/TR ; mélanger doucement.
    6. Retirez le support de cellule insectes des cellules Sf9 et laver une fois avec 1 mL de milieu frais.
    7. Retirez le support de lavage et ajouter le mélange de l’ADN/TR (3.2.2 \u2012 3.2.5) aux cellules. Incuber les cellules à 27 ° C pendant 5 h (sans agitation).
    8. Retirez le mélange de transfection et remplacez par 2 mL de support de cellule insectes contenant 0,5 % sérum fœtal (SVF). Incuber les cellules à 27 ° C pendant cinq jours.
      Mise en garde : Éviter l’évaporation des médias cellulaire en remplissant les puits vides avec les médias et couvrir la plaque de 6 puits avec deux couches de film de paraffine.
    9. Transférer les milieux de culture de cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL. Isoler le premier passage (P1) du parc de virale en faisant tourner le tube à 8 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger de 15 mL nettoyer et ranger immédiatement à 4 ° C.
      Remarque : Protéger le virus de l’exposition à la lumière en recouvrant le tube avec le papier d’aluminium.
    10. Pour la seconde génération (P2) du parc de virale, mettre une culture en suspension de 25 mL de milieux cellulaires insectes à 1 x 106 Sf9 cellules/mL contenant 2 % FBS dans un flacon de 125 mL (fond clair et aéré). Ajouter 25 μL du virus P1 à la culture de 25 mL.
    11. Incuber la culture à 27 ° C pendant 72 h.
    12. Pour récolter le stock viral P2, la culture de transfert dans un nouveau tube de 50 mL et il centrifuger à 8 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
    13. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL et rangez-le immédiatement à 4 ° C.
      Remarque : Protéger le virus de l’exposition à la lumière en recouvrant le tube avec le papier d’aluminium. Réaliser une expérience à petite échelle pour titrer le ratio de virus/Sf9 P2 pour une expression optimale TRPV1 (voir 1 de fichier supplémentaire pour un protocole détaillé, Section 4 intitulée « Expérience à petite échelle pour P2 virus. »)
    14. Pour l’expression de la protéine à grande échelle, définir une culture en suspension cellules Sf9 1 L à 2 x 106 cellules/mL dans les médias de cellule insectes additionnés de 0,5 % FBS dans une fiole de verre borosilicaté 2,8-L.
    15. Ajouter 1 mL de stock de virus de P2 à la culture de 1 L et il incuber à 27 ° C pendant 72 h.
      Remarque : Le troisième jour, la densité cellulaire doit être à environ 1,5 à 2,5 x 106 cellules/mL.

4. eTRPV1 et Purification de Mutant de Single-cystéine

  1. Membranes d’isolement28
    1. Récolte de la culture en suspension cellulaire insectes 1 L de la filature à x 4 500 g, 4 ° C, pendant 20 min. peser le culot cellulaire (il devrait être autour de 6-9 g).
    2. Resuspendre le culot dans 25 mL de tampons glacee A (saccharose de 36,5 mM, 2 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) et 50 mM Tris ; pH 7,4) en présence d’inhibiteurs de la protéase (fluorure de sulfonyle de benzyle 1 mM (PMSF), 3 μg/mL leupeptine, 3 μg/mL aprotinine et 1 pepstatine μg/mL). Désagréger les amas de cellules pour obtenir une suspension homogène et tournez à 4 ° C pendant 20 min.
    3. Briser les cellules à l’aide d’un manuel (meuleuse de tissu dounce) ou un homogénéisateur haute pression. Enlever les débris de cellules par centrifugation à 8 000 x g pendant 20 min à 4 ° C.
      Remarque : Conservez les cellules lysées et les tubes sur la glace pendant tout le processus.
    4. Recueillir le liquide surnageant et centrifuger à 100 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot de membrane dans un volume total de 20 mL de glacee tampon B (NaCl 150 mM, 10 % de glycérol, 2 mM TCEP, 50 mM HEPES, pH 7,4), complété par des inhibiteurs de protéase (comme au point 4.1.2).
    5. Aliquote 20 mL de suspension de la membrane en tubes de 50 mL et flash-congélation dans l’azote liquide. Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  2. Purification de protéine26,28
    1. Décongeler les aliquotes de membrane sur la glace et ajouter 3 mL de n-dodécyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) par tube (stock de 200 mM). Tourner le tube pendant 2 h à 4 ° C.
    2. Centrifuger l’échantillon à 100 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. Récupérer le surnageant et ajouter 1 mL de résine d’amylose humide propre. Tourner le mélange pendant 2 h à 4 ° C. Charger le mélange de protéine/amylose dans les colonnes de chromatographie de flux gravité.
      Mise en garde : Ne laissez pas la résine sécher pendant les lavages.
    3. Laver la résine protéinique amylose et 10 fois les lit volumes de C glacé de tampon (NaCl 150 mM, 10 % de glycérol, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectine, 0,5 mM TCEP, pH 7,4). Laver avec 10 volumes de lit de glacee tampon D (NaCl 150 mM, 10 % de glycérol, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectine, pH 7,4).
      Remarque : Avant de laver, dégazer le tampon D sans détergent ni lipides, purge à l’azote. Après le dégazage, ajouter DDM et asolectine.
    4. Éluer les protéines d’eTRPV1 avec des fractions de 0,5 mL, jusqu'à 5 mL de glacee dégazé tampon D, additionné de maltose de 20 mM. Si possible, effectuer le lavage et élution à 4 ° C.
    5. Quantifier la quantité de protéines en mesurant l’absorbance à la longueur d’onde de 280 nm.
      Remarque : Ce protocole donne 0,5 à 1,0 mg de protéines par litre de culture. Rendement de protéine peut varier pour chaque mutant de single-cystéine eTRPV1. Pour des expériences EPR et cerfs, poussent 4 \u2012 6 L de la culture.

5. eTRPV1 Single-cystéine Mutant Site-Directed Spin Labeling

  1. Concentrer les fractions contenant des eTRPV1 à l’aide d’une unité de filtration centrifuge (coupure = 100 kDa) jusqu'à 2 \u2012 2,5 mg/mL pour l’étiquetage (cycles de 7 000 x g pendant 2 min à 4 ° C).
  2. Ajouter un excès molaire 10 fois (3 fois, toutes les 30 minutes) du marqueur de spin (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) méthyle méthanethiosulfonate (MTSSL) d’une solution mère de 100 mM dans le DMSO au concentré de protéine (monomère d’eTRPV1 : MTSSL à 01:10 rapport molaire) 17. maintenir la réaction dans l’obscurité à RT pendant 1 h 30 min, suivie d’une nuit d’incubation à 4 ° C.
    Remarque : Dans cette étape, MBP puisse être supprimée en ajoutant la protéase TEV pendant l’incubation de spin-étiquetage pendant la nuit.
  3. ETRPV1 de charge marqué sur une colonne de chromatographie d’exclusion dimensions équilibrées dans tampon E (NaCl, 20 mM HEPES, 0,5 mM DN 150 mM, pH 7,4), contrôlée par un système de chromatographie en phase liquide (FPLC) protéine rapide. Recueillir des fractions contenant eTRPV1 tétramère.
    Remarque : N’incluent pas les 10 % de glycérol dans cette étape, car il réduit l’efficacité de la reconstitution.
  4. Quantifier la quantité de protéines en mesurant l’absorbance à la longueur d’onde de 280 nm.
  5. Évaluer la pureté de l’échantillon en exécutant un gel SDS-PAGE (gel sans tache, 4 \u2012 20 %). L’échantillon est maintenant prêt pour des mesures spectroscopiques en solution et/ou protéoliposomes.

6. eTRPV1 marqué seule cystéine la Reconstitution du Mutant

  1. Sécher 10 mg d’asolectine à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide (≤100 mbar) pendant 1 h à 40 ° C. Pour faire asolectine liposomes, ajouter 1 mL de tampon F (200 mM NaCl, vadrouilles de 5 mM, pH 7,4) et laisser agir le mélange pendant 15 min ou jusqu'à ce que l’échantillon est homogène.
  2. Déstabiliser les liposomes en ajoutant DDM à une concentration finale de 2 mM et laisser incuber 30 min à température ambiante.
  3. Concentrer les protéines marquées à 2 mg/mL et ajoutez-le aux liposomes en utilisant le ratio protéines/lipides 1:5 (masse : masse).
    Mise en garde : Il est important de maintenir les concentrations de protéine susmentionnés, étant donné que l’efficacité d’essorage-étiquetage diminue à de faibles concentrations et à la puissance maximum, que la protéine pourrait précipiter.
  4. Ajouter le tampon F pour régler le mélange de protéine/aux liposomes à la concentration micellaire critique DDM (CMC) et incuber une nuit à 4 ° C avec agitation douce.
  5. Double de la quantité du mélange protéine/Liposome avec tampon F et enlever un détergent en ajoutant successivement trois aliquotes de non-polaires billes de polystyrène adsorbants (30 mg, 50 mg et 80 mg) à intervalles de 1 h avec agitation douce à température ambiante.
  6. Charger le mélange sur un filtre de colonne (colonne de chromatographie de flux gravité) pour enlever les billes et transvaser le mélange de protéoliposomes dans un tube ultracentrifugeuse. Centrifuger les échantillons à 100 000 x g pendant 1 h à 4 ° C. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 30 μL de tampon de F.
    Remarque : Les échantillons sont prêts pour l’analyse spectroscopique et injection dans des ovocytes de Xenopus . Si les échantillons ne peuvent être utilisés le jour même, flash gel eux dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C.
  7. Protéoliposomes -Xenopus ovocyte électrophysiologie26,32
    1. Injecter 50 nL des dilutions différentes de protéoliposomes marqué dans des ovocytes de Xenopus comme décrit à la section 2.2.
    2. Effectuer des mesures de TEVC après 12 h d’injection tel que décrit à l’article 2.3.10.
  8. Continuez à effectuer des mesures spectroscopiques et analyse (article 7).

7. les cerfs et les Spectroscopies RPE

  1. Spectroscopie de résonance (cerf) double électron-électron.
    1. Effectuer des mesures de cerfs dans un spectromètre de RPE pulsé fonctionnant à Q-bande de fréquence (34 GHz) et muni d’un amplificateur de 10 W avec la séquence de quatre-pulsation libre temps morts à 83° à l’aide de logiciels fournis par le fabricant,33.
    2. Supplément de 50 µM de mutants de cystéine marqué eTRPV1 purifié détergent en tampon E (étape 5.5) avec 30 % (v/v) de glycérol pour cryo-protection.
    3. Charger l’échantillon dans un tube capillaire de quartz scellé et un essorage jusqu’au fond du tube en bref centrifugation à basse vitesse (100 x g).
    4. Placer le tube capillaire dans l’azote liquide pour geler l’échantillon. Les échantillons peuvent être conservés en ce moment à-80 ° C pour mesurer ultérieurement.
    5. Placer l’échantillon directement dans la caisse de résonance micro-onde et laissez-le rééquilibrer-83 ° pour 10 \u2012 20 min.
    6. Mesurer l’échantillon à l’aide d’un protocole standard de DEER quatre impulsions, mw1 (π/2) – τ1 – mw1 (π) – τ1 – mw2 (π) – τ2 – (π) mw1 – τ2 – écho34. La longueur de l’impulsion pour mw1 (π/2) et (π) mw1 est respectivement de 10 et 20 ns et 40 ns pour mw2 (π). Définir l’espacement des fréquences à 63 MHz.
      Remarque : Données décomposition primaire chevreuil peuvent être analysées avec un accueil logiciel intégré (par exemple en Matlab) qui suppose une somme de distributions gaussiennes pour décrire les distances entre spin étiquettes19,35.
  2. Onde continue spectroscopie RPE (CW)
    1. Réaliser des expériences de CW EPR à ta sur un spectromètre X-band (9,6 GHz) en utilisant le logiciel de fabricant.
    2. Démarrer l’instrument en tournant sur le refroidisseur d’eau, la console et l’alimentation aimant. Vous connecter au logiciel de l’appareil, placer l’appareil dans l’air et attendre au moins 30 min pour l’instrument pour se réchauffer.
    3. Charger 20 µL de l’échantillon de l’étape 5.5 dans un tube capillaire de verre de 25 µL à l’aide de l’action capillaire et sceller l’extrémité du tube avec mastic.
    4. Chargez le tube capillaire dans la cavité du four à micro-ondes et couple critique du résonateur manuellement ou automatiquement à l’aide de la fonction automatique du logiciel.
    5. Recueillir le premier spectre dérivé dans des conditions standard instrument : 100kHz à micro-ondes modulation, modulation de champ magnétique de 1,6 G et puissance micro-ondes de 10 mW.
    6. Pour l’analyse des données et la présentation, corriger les spectres sur le fond et normaliser en divisant les spectres de la valeur de crête à crête de l’intégrale double.
    7. Déterminer la mobilité du marqueur de spin en mesurant l’inverse de la largeur de la ligne centrale du premier dérivé des spectres d’absorption (ΔHo-1)36.

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Résultats

Caractérisation fonctionnelle des minimes sans cystéine TRPV1 construire (eTRPV1) et Single-cystéine Mutants

La première étape vers des études spectroscopiques est d’ingénieur et de caractériser des constructions de cystéine-moins de protéine (Figure 2 a) qui sont fonctionnels et qui produisent des quantités biochimiques des protéines. eTRPV1 est fonctionnel, tel que déterminé par Ca2 + imag...

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Discussion

Expression et purification des protéines membranaires chez les mammifères, les technologies actuelles ont permis d’obtenir des quantités suffisantes de protéines pour des études spectroscopiques14,15,16,,42. Ici, nous avons adapté ces technologies pour exprimer, purifier, reconstituer et effectuez des analyses spectroscopiques en TRPV1.

Parmi les étapes cruciales dan...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes très reconnaissants à m. H. Mchaourab pour accéder à des spectromètres EPR et cerfs et Dr T. Rosenbaum pour fournir le plasmide de TRPV1 cystéine-moins long.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de mutagénèse dirigée par la foudre QuikChangeAgilent Technologies210519-5
2-Propanol (isopropanol)Fisher ScientificA416
Sérum bovin à l’albumine (BSA)GoldBio.comA-420-10
Résine d’amyloseNEBE8021L
AprotinineGoldBio.comA-655-25
Asolectine du sojaSigma11145
Système d’expression de baculovirus Bac-à-BacInvitrogen Life Technologies10359016
Biobeads SM-2 Adsorbants  ;Bio-Rad152-3920
Pipettes en verre borosilicaté (3.5'') (inyection des ovocytes)Drummond Scientific3-000-203 G/X
Pipettes en verre borosilicaté (enregistrements d’ovocytes)Sutter InstrumentB150-110-10HP
CaCl2 2H2OFisher ScientificC79
Carbenicilline (disodique)GoldBio.comC-103-5
Réactif CellfectinInvitrogen Life Technologies10362-010
cellSensOlympus
ChloroformFisher ScientificC606SK
Collagénase Type 1Worthington-BiochemLS004196
CritisealVWR18000-299
D-(+)-GlucoseSigma  ;G8270
D-(+)-Maltose MonohydratéFisher ScientificBP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside)AnatraceD310S
Milieu à haute teneur en glucose (Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium)SigmaD0572  ;
Colonnes de dessalage jetables-10GE Healthcare45-000-148
EGTAFisher ScientificO2783
Sérum de veau fœtalInvitrogen Life Technologies10082-147
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-PrepKit Epoch Life Science, Inc2160250
Kit de nettoyage PCR GenCatchEpoch Life Science, Inc2360050
Sulfate de gentamicineLonza17-518Z
Capillaire en verre (25 µ ; l)VWR53432-761
Flacon en verre 2800 mLPyrex USA4423-2XL
GlycérolFisher BioReagentsBP229
HEK293S GnTl-ATCCCRL-3022
HEPESSigma  ;H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside)GoldBio.comI2481C25
Sulfate de kanamycineFisher ScientificBP906-5
KClFisher ChemicalP217
LB Bouillon, MillerFisher bioReagentsBP1426
Hémisulfate de leupeptineGoldBio.comL-010-5
Lipofectamine 2000Invitrogen Life Technologies11668-019
MgCl2 6H2OFisher ScientificBP214
MgSO4 7H2OFisher ScientificBP213
mMESSAGE mMACHINE T7 KitAmbionAM1344
MOPSFisher bioReagentsBP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine-3-yl) Méthyl MéthanétiosulfonateToronto Research Chemicals, IncO873900
NaClFisher ChemicalS271
Opti-MEMLife Technologies31985-062
Pepstatine AGoldBio.comP-020-5
Acide pluronique F-127 (20 %)PromoKine  ;   ;CA707-59004
PMSFGoldBio.comP4170
Solution de poly-L-lysineSigma-AldrichP4707
Rneasy Mini KitQiagen74104
Capillaire scelléVitroComcommande
SF-900 II SFM (milieu cellulaire d’insecte)Gibco, Life Technologies10902-088
Sf9 Cellules (adaptées SFM)Invitrogen Life Technologies11496-015
Extrait de lipides polaires de sojaAvanti Polar Lipids, Inc541602C
SaccharoseFisherScientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare29091596
TCEP HClGoldBio.comTCEP1
Chlorhydrate de tétracyclineFisher ScientificBP912-100
Tris BaseFisher BioReagentsBP152
TryptoneDifco0123-01
X-galGoldBio.comX4281C
Ovocytes de xénopeNascoLM00935M
XL1 - Blue Competent CellsAgilent Technologies, Inc200249
Levure ExtraitDifco0127-01-7
Colonne de chromatographie Econo-PackBio-Rad7321010
Mini-PROTEAN TGX Gels préfabriqués sans colorationBio-Rad17000436
pFastBac1 Vecteur d’expressionInvitrogen Life Technologies10360-014
DH10Bac Cellules compétentesInvitrogen Life Technologies10361-012
Scellant pour tubes capillaires CritisealLeica Microsystems02-676-20
ABI Modèle 3130XL Analyseurs génétiquesApplied Biosystems4359571
Pipette de transfertFishebrand13-711-9AM
Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
spéciale

Références

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