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Article de méthode

Un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les Interactions protéine

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DOI :

10.3791/57801

⸱

6 juin 2018

 ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Dans cet article

Résumé

Traitement par lots des écrans 2-hybride de levure permet une comparaison directe des profils interaction de plusieurs protéines d’appât avec un ensemble très complexe de protéines de fusion de proies. Nous décrivons ici des méthodes raffinées, nouveaux réactifs et comment mettre en œuvre leur utilisation pour ces écrans.

Résumé

Dépistage des interactions protéine-protéine à l’aide de l’essai 2-hybride de levure a longtemps été un outil efficace, mais son utilisation a été largement limitée à la découverte des Interactiens de haute affinité qui sont hautement enrichi dans la bibliothèque des candidats qui interagissent. Dans un format traditionnel, le dosage de 2-hybride de levure peut produire trop de colonies à analyser lorsque menée à la raideur bas où se trouvent les Interactiens faible affinité. Par ailleurs, sans un interrogatoire exhaustif et complet de la bibliothèque même contre des plasmides différents appâts, une analyse comparative ne peut être atteint. Bien que certains de ces problèmes peuvent être traités à l’aide de bibliothèques en proie, le coût et l’infrastructure nécessaire pour faire fonctionner ces écrans peuvent être prohibitifs. Comme alternative, nous avons adapté le test 2-hybride de levure pour découvrir en même temps des dizaines de transitoire et interactions de protéine statique au sein d’un seul écran utilisant une stratégie appelée DEEPN (enrichissement dynamique pour réseaux d’évaluation des protéines), qui incorpore le séquençage à haut débit et calcul de suivre l’évolution d’une population de plasmides codant les partenaires qui interagissent. Nous décrivons ici personnalisées réactifs et protocoles qui permettent un écran DEEPN à exécuter facilement et à moindre coût.

Introduction

Une compréhension complète des processus biologiques de cellule s’appuie sur la recherche des réseaux d’interactions protéiques qui sous-tendent leurs mécanismes moléculaires. Une approche pour identifier les interactions entre protéines est la levure 2-hybride (Y2H), qui fonctionne en assemblant un facteur de transcription chimérique fonctionnement une fois que les deux domaines de la protéine d’intérêt lient à un autre1. Un écran Y2H typique est effectué en créant une population de levures qui abrite les deux une bibliothèque des plasmides codant des protéines qui interagissent, fusionnés à un activateur de la transcription (e.g., « la proie » protéine de fusion) et un plasmide de donnée « appât » composé de la protéine d’intérêt fusionné à un domaine de liaison de l’ADN (par exemple, le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 qui se lie à la séquence activatrice Gal4-amont). L’un des principaux avantages de l’approche Y2H est qu’il est relativement facile et peu coûteux à réaliser dans un laboratoire typique équipé pour les travaux courants de biologique moléculaire2. Toutefois, lorsque traditionnellement effectué, un utilisateur échantillonne des colonies individuelles qui surviennent après la sélection d’une interaction positive de Y2H. Cela limite fortement le nombre de clones de « proies » de bibliothèque qui peuvent être interrogés. Ce problème est aggravé lorsque l’abondance d’une proie interaction particulière est très élevé par rapport aux autres, ce qui diminue les chances d’apercevoir l’interaction de plasmides de proies de faible abondance.

Une solution pour utiliser le principe Y2H dans une couverture complète du protéome est l’utilisation d’une matrice au format dans lequel un tableau contenant des plasmides de proies individuels connus peut être interrogé numériquement. Toutefois, une telle approche exige une infrastructure qui n’est pas facilement accessible et le plus rentable pour les chercheurs qui s’intéressent à la définition de l’interactome d’un petit nombre de protéines ou domaines3. En outre, bibliothèques de proies très complexe qui peuvent coder plusieurs fragments de protéines qui interagissent augmenterait la taille de tels tableaux matrice aux tailles impraticables. Une alternative consiste à effectuer des essais avec des bibliothèques complexes en lots et d’évaluer la présence de clones interagissants avec le séquençage haut débit parallèle massive4. Ceci peut être appliqué pour doser la présence de plasmides de proies qui se posent dans plusieurs colonies au moyen d’un typique Y2H formaté approche dans laquelle la levure cellules abritant une paire d’interaction des protéines de fusion sont autorisés à cultiver sur un plaque5,6. Cette idée générale peut être accentuée pour augmenter la requête de deux appâts multiples et la proie de composants dans le même temps7,8.

Pourtant, nombreuses enquêtes exigent qu'une plus facile encore plus concentré efforts sur quelques protéines « appâts » et puissent bénéficier davantage par une requête exhaustive et semi-quantitative d’une bibliothèque de proies complexe unique. Nous avons développé et validé une approche pour effectuer des études d’interaction de protéine à grande échelle en utilisant un principe Y2H lot format4. Celui-ci utilise le taux d’expansion d’un plasmide de proie particulière en tant que proxy pour la force relative de Y2H interaction9. Séquençage en profondeur de tous les plasmides au sein d’une population soumise à une croissance normale ou des conditions de croissance sélective produit une carte complète de clones qui donnent des interactions Y2H fortes et faibles. Le répertoire d’interacteurs pouvant être obtenu et directement comparé à travers plusieurs plasmides d’appât. Le flux de travail qui en résulte, appelé DEEPN (dynamique d’enrichissement pour les réseaux d’évaluation des protéines) permet ainsi d’identifier les interactomes différentiels des bibliothèques proies même d’identifier des protéines, permettant la comparaison entre une protéine contre un autre.

Ici, nous démontrons DEEPN et introduire des améliorations dans les méthodes de laboratoire qui facilitent son utilisation, qui sont décrites dans la Figure 1. Des améliorations notables incluent :

Génération de populations de levures proies. Une des exigences clés de DEEPN génère des populations de levure avec des appâts différents plasmides qui ont la même distribution des bibliothèques de proies du plasmide. Les populations de base équivalent de la bibliothèque de plasmide de proies sont essentielles pour faire des comparaisons précises entre les interactomes des appâts différents. C’est plus facilement atteintes qu’un plasmide de bibliothèque occupe déjà une population de levure haploïde et pénétrant un plasmide d’appât donné de cette population est obtenue par croisement pour produire une plante diploïde. Ici, nous fournissons un guide clair dans Comment faire de ces populations en utilisant les librairies commerciales logés chez la levure haploïde. Bien que nous avons trouvé des méthodes qui génèrent un grand nombre d’espèces diploïdes, l’efficacité globale d’accouplement de ces souches de levures commerciales bibliothèque contenant était faible. Par conséquent, nous avons construit une nouvelle souche qui peut accueillir des bibliothèques de la proie qui donne beaucoup plus de diploïdes par réaction d’accouplement.

New jeu de plasmides d’appât. Plusieurs actuelles plasmides exprimant des protéines de fusion « appât » composés de la protéine d’intérêt et un domaine de liaison à l’ADN sont axés sur les 2µ, leur permettant d’amplifier leur nombre de copies. Ce nombre de copies peut être assez variable dans la population et mener à la variabilité de la réponse transcriptionnelle Y2H. Cela pourrait à son tour incliner la capacité de mesurer la force de l’interaction protéine donnée basée sur la réaction de la croissance des cellules sous sélection. Cela peut être en partie adresse à l’aide d’un plasmide de faibles copies, dont certains ont été décrits précédemment tels que le pDEST32 disponible dans le commerce10. Nous avons construit un nouveau plasmide d’appât (pTEF-GBD) qui produit des protéines de fusion Gal4-DNA-binding domain dans un plasmide d’axée sur les centromères faible copie TRP1 porteuses du gène de résistance Kanr qui permet aussi de clonage de fragments d’appâts les deux en amont et en aval du domaine de liaison à l’ADN de Gal4.

Bibliothèque de fragment nouveau High-Density Y2H. Nous avons construit un nouveau plasmide aux bibliothèques de proies Y2H maison et utilisé pour construire une bibliothèque Y2H hautement complexe, faite de fragments cisaillés au hasard de l’ADN génomique de Saccharomyces cerevisiae. Le séquençage a révélé que cette bibliothèque plus 1 million de différents éléments, beaucoup plus complexes que la levure décrite précédemment Y2H génomique plasmidique de bibliothèques11. Avec cette nouvelle bibliothèque, nous avons pu montrer que le flux de travail DEEPN est assez robuste pour accueillir des bibliothèques complexes avec plusieurs plasmides différents de manière fiable et reproductible.

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Protocole

1. préparation des plaques et des médias

Remarque : Toutes les plaques il faut faire au minimum 2 jours avant de commencer le protocole. Les médias peuvent être faites à tout moment. Toutefois, l’adénine de dextrose peptone tamponnée levure extrait (bYPDA) doit être faite le jour dont il sera utilisé. Certains médias s’effectue avec un mélange de supplément contenant une concentration de l’adénine est supérieure à ce qui est généralement utilisé. La plupart des suppléments de milieu minimal spécifient adénine de 10 mg/L. Suppléments étiquetés « + 40Ade » spécifier un total d’adénine 40 mg/L.

  1. Préparer une Solution de Glucose (50 % p/v). Pour 1 L, dissoudre 500 g de D-(+)-Glucose dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Régler le volume à 1 000 mL d’utiliser une éprouvette graduée et un filtre sur un filtre stérile de 0,2 µm dans un flacon stérile de 1 000 mL de médias.
  2. Extrait de levure préparer les plaques de peptone dextrose (DPJ). Pour 1 L, dissoudre 20 g de Peptone et 10 g d’extrait de levure dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 960 mL d’eau distillée. Verser dans un erlenmeyer de 2 000 mL et ajouter 15 g de gélose. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 40 mL de glucose à 50 %. Bien mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  3. Préparer le milieu minimal synthétique complet (CSM)-plaques de Trp. Pour 1 L, dissoudre 6,7 g de levure azote Base sans acides aminés dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 960 mL d’eau distillée. Versez dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 0,7 g de - Trp-rencontre mélange d’abandon, 20 mg de méthionine et 15 g d’agar. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 40 mL de glucose à 50 %. Bien mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  4. Préparer les assiettes CSM-Leu-Met. Pour 1 L, dissoudre 10,05 g de levure azote Base sans acides aminés dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée et remplissez-le à 940 mL d’eau distillée. Versez dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 1,005 g de - Leu-rencontre mélange d’abandon et 15 g d’agar. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 60 mL de glucose à 50 %. Bien mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  5. Préparer les assiettes de CSM-Leu-Trp. Pour 1 L, dissoudre 10,05 g de levure azote Base sans acides aminés dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 940 mL d’eau distillée. Verser dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 1,005 g de - Trp-Leu + mélange d’abandon 40Ade, 240 mg de l’adénine et 15 g d’agar. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 60 mL de glucose à 50 %. Bien mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  6. Préparer les assiettes CSM-Leu-Trp-His. Pour 1 L, dissoudre 10,05 g de levure azote Base sans acides aminés dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 940 mL d’eau distillée. Verser dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 0,975 g de - Trp-Leu-ses + mélange d’abandon 40Ade, 240 mg de l’adénine et 15 g d’agar. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 60 mL de glucose à 50 %. Bien mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  7. Préparer les assiettes CSM-Leu-Trp-His-3AT. Pour 1 L, dissoudre 10,05 g de levure azote Base sans acides aminés dans 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 940 mL d’eau distillée. Verser dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 0,975 g de - Trp-Leu-ses + mélange d’abandon 40Ade, 240 mg de l’adénine et 15 g d’agar. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Utiliser une pipette pour ajouter 60 mL de glucose à 50 %. Mélanger dans 100 µL d’un stock stérile 1 M 3-amino-1,2,4 triazoles (3AT) en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  8. Préparer les assiettes LB-Kanr. Pour 1 L, dissoudre 10 g de Tryptone, 5 g de levure extrait et 10 g de NaCl dans 800 mL de l’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL. Versez dans une éprouvette graduée, remplir jusqu'à 1 000 mL d’eau distillée. Verser dans un 2 000 mL de fiole Erlenmeyer et ajouter 15 g de gélose. Autoclave et laisser refroidir dans le bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la température de bain de l’eau a refroidi à environ 42-50 ° C. Ajouter 50 mg kanamycine et mélanger en agitant.
    1. Verser une série de plaques de 100 mm avec 20 mL de médias la pipette.
  9. Préparer la DPJ, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp et CSM-Leu-Trp-His médias. Utilisez la procédure ci-dessus pour les plaques sauf au lieu de verser dans un erlenmeyer, versez dans une bouteille de stockage de médias et omettre l’agar.
  10. Préparer bYPDA (YPDA tamponnée). Prendre le milieu YPD stérile et ajouter adénine 200 mg/L dans l’eau distillée stérile. Ajuster le pH à 3,7 avec HCl filtrer à travers un filtre stérile de 0,2 µm dans un flacon stérile.
  11. Préparer la Transformation tampon : 2 M sorbitol, dihydrate d’acétate de lithium 1 M, 10 mM Tris pH 7.6, 0,5 mM EDTA, le chlorure de calcium dans l’eau distillée de 0,2 mM. Filtrer sur un filtre stérile 0,2 µm dans un flacon stérile.
  12. Préparer la solution de PEG : 70 % w/v polyéthylène glycol 3350 dans l’eau distillée. Stériliser à l’autoclave.
  13. Préparer le tourbillon : 8 M urée, 4 % w/v SDS, 50 mM Tris pH 6,8, 10 % v/v de glycérol, 0,02 % w/v bleu stérile de bromophénol eau distillée.
  14. Préparer les sTE (fort TE) : 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8,0 dans l’eau distillée. Filtrer sur un filtre stérile 0,2 µm dans un flacon stérile.
  15. Préparer la solution mère de Zymolase : Zymolase 100 t 10 mg/mL dans 50 mM potassium phosphate dibasique de pH 7.5, 50 % v/v glycérol tampon stérile distillée (conservé à-20 ° C).

2. le clonage et la vérification des plasmides d’appât

Remarque : La Construction du domaine de Gal4-DNA-binding plasmides. Actuellement, il existe une variété de systèmes Y2H commercialement disponibles et sur le plan académique. DEEPN peut accueillir bon nombre d'entre eux, pourvu que l’appât de plasmide exprimant la protéine d’intérêt fusionné à un domaine de liaison à l’ADN se trouve dans un TRP1-contenant le plasmide. Autres exigences en aval qui sont de l’ordre immédiatement en amont de la bibliothèque de proies insert est connu et qu’une interaction Y2H positive peut être marquée par la production d’His3 permettant une sélection dans des milieux dépourvus d’histidine. Ici, nous allons décrire l’utilisation d’un nouveau plasmide d’appât Y2H (pTEF-GBD, Figure 2), cependant, autres plasmides d’appât Y2H y compris pGBKT7 peuvent être utilisés aussi bien. Pour la construction et l’évaluation des plasmides d’appât, nous décrirons utilisationdes pTEF-GBD. Nous proposons comme une note générale, synthèse de gène de produire un cadre de lecture ouvert qui adhère à la partialité de codon de levure pour aider à assurer la bonne expression et la facilité avec le clonage. S’assurer que le système de clonage permet à l’hameçon dans le cadre avec le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 et que lors du clonage dans le site 3', un codon stop suit la région codant pour appât.

  1. Préparer le vecteur plasmidique. Plasmide pTEF-GBD permet pour le clonage d’un fragment codant la protéine d’intérêt 5' ou 3' de la région codant le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 en utilisant une méthode d’assemblage rapide. Pour insertion au site de 5', 3 µg de pTEF-GBD avec NarI et EcoRI de digérer ou d’insertion sur le site de 3', digérer avec BamHI et XhoI pour 2-4 h. échantillon d’électrophorèse en gel d’agarose de l’ADN 1 % gel contenant 0,2 - bromure d’éthidium de 0,5 µg/mL (EtBr) à 100 V. exciser le bp de coupe 5 630 TEF-GBD et purifier à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN gel conformément aux instructions du fabricant et quantifier l’ADN de l’absorbance à 260 nm par spectrophotomètre12.
    NOTE : Génération d’appât-encodage des inserts. Fragments d’ADN codant les protéines ou les fragments de protéine d’intérêt peuvent être faite à l’aide de la synthèse de gènes et disponibles comme des fragments non clonées. Il est recommandé que les codons sont optimisés pour l’expression chez Saccharomyces cerevisiae et outils en ligne pour l’optimisation de codons sont inclus dans la liste des matériaux.
  2. Pour 5' insertion, flanquent le fragment d’ADN codant un codon de début ATG par 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'et 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', respectivement. Pour 3' insertion dans le cadre avec le domaine de liaison de Gal4 ADN, flanquent le fragment de codage de 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'et 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. Pour la construction plasmidique, utilisez la méthode assemblage rapide tel que spécifié dans les instructions du fabricant pour le clonage de fragments en coupe pTEF-GBD.
    1. Plaque tous transforment e. coli dans LB-Kanr assiettes et incuber pendant 16 à 20 h à 37 ° C. Colonies pTEF-GBD avec l’insertion désirée de logement peuvent être identifiés par l’amplification par PCR en utilisant des oligonucléotides : 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' et 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' pour insérer 5' et 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' et 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' à 3' insérer. Ces oligonucléotides peuvent aussi servir d’amorces de séquençage de l’insert.
    2. Plan sur la préparation > 10 µg de chaque dérivé pTEF-GBD et pTEF-GBD seul à fournir des éléments pour les transformations de séquençage et de la levure.
    3. Utiliser les conditions PCR suivantes : 3 min à 98 ° C, suivie de 25 cycles de 30 s à 98 ° C, 30 s à 55 ° C et 2 min à 72 ° C, suivie de 5 min à 72 ° C à l’aide d’un tampon contenant 2,5 mM MgCl2 , U/100 0,5 µL ADN polymérase et tampon de propriété industrielle.

3. l’expression des protéines de Fusion de Gal4-DNA-binding Domain

  1. Faire des levures compétentes.
    1. Strie sur levure PJ69-4 a sur une plaque de la DPJ en prenant un applicateur en bois stérile, grattage 1 mm3 -80 ° c congelés stock et frottant doucement à travers la plaque de la DPJ. Déplacer l’applicateur en bois vers le bas de la plaque pour que chaque passage traverse une partie intacte de la surface de médias. Incuber la plaque de la DPJ à 30 ° C pendant 2 jours ou jusqu'à ce que les colonies individuelles sont visibles. Faire le stock congelé de levure PJ69-4 a en suspendant la levure dans l’eau ou la croissance des médias, en complétant avec le DMSO à 7 % et en stockant à-80 ° C.
    2. Ensemencer une seule colonie dans 5 mL de la culture de la DPJ dans un tube à culture 20 x 150 mm à l’aide d’un applicateur en bois stérile et se développer pendant la nuit à 30 ° C dans un incubateur à agitation à 200 tr/min.
    3. Ensemencer à 50 mL de la DPJ dans un 250 mL de la fiole d’Erlenmeyer stérile avec 4 mL de la culture au jour le jour de la souche de levure PJ69-4 a. Grandir dans un incubateur à agitation à 30 ° C, 200 tr/mn à une densité optique (OD600) d’environ 1,2, telle que déterminée par spectrophotométrie avec un chemin de lumière standard de 1 cm. La croissance prend habituellement 5-7 h.
    4. Isoler les levures par sédimentation dans 50 mL de tube conique à 4 696 x g pendant 5 min à température ambiante dans une centrifugeuse de paillasse. Jeter le surnageant par déversement dans les eaux usées. À l’aide d’une pipette, resuspendre le culot dans 5 mL de tampon de transformation et de transfert de 15 mL de tube à fond conique. Resediment à jeter le surnageant et remettre en suspension la levure dans 1 mL de volume final du tampon de transformation avec une pipette de 1000 µL.
    5. Incuber les cellules de levure pendant 60 min à 30 ° C en agitant à 200 tr/min et placez sur la glace pendant 30 à 90 min.
  2. Transformation de levure de plasmide.
    1. En 1,5 mL de tubes de microcentrifuge stérile, ajouter 1 µg de plasmide pTEF-GBD-basé et 5 µL de transporteur de sperme de saumon 10 mg/mL solution d’ADN. Comprennent également un tube contenant seulement saumon sperme transporteur ADN comme un contrôle de la transformation négative. Ajouter 100 µL de la suspension de cellules de levure glacée à chaque tube pipette. Ajouter 100 µL de 70 % solution PEG avec une pipette de 1000 µL et mélangez doucement en effleurant le tube 5 - 10 fois (ne pas de vortex).
    2. Incuber à 30 ° C, dans un incubateur à agitation pendant 45 min à 200 tr/min.
    3. Choc thermique à 42 ° C pendant 15 min.
    4. Sédiments dans une micro-centrifugeuse à 845 x g pendant 3 min à température ambiante, Pipeter hors et jeter le surnageant, resuspendre le culot dans 150 µL d’eau stérile par pipetage de haut en bas et répartis sur la surface d’une plaque de CSM-Trp.
    5. Placer les plaques de droite vers le haut dans incubateur à 30 ° C et incuber pendant 2 ou 3 jours jusqu'à ce que les colonies sont visibles. Plaques peuvent être tournés à l’envers pour éviter la condensation sur la surface de la plaque après incubation à 30 ° C pendant 6 à 12 h.
    6. Prendre 2-3 colonies par transformation et streak comme un patch sur une plaque de CSM-Trp à l’aide d’un cure-dent stérile. Permettre de croître pendant 24 h à 30 ° C.
  3. Faire des lysats d’expression de la protéine.
    1. Ensemencer de 3 mL de milieu liquide CSM-Trp avec un match de football-tête-taille de levure du patch et croître durant la nuit à 30 ° C dans un tube à culture 20 x 150 mm, en agitant à 200 tr/min. Faire deux cultures au jour le jour par l’appât et vecteur vide pTEF-GBD.
    2. Ajouter 1 mL de la DPJ à chaque 3 mL d’une culture de CSM-Trp. Croître durant 1 h à 30 ° C, et en agitant à 200 tr/min. Vérifier le diamètre extérieur de cellules par le spectrophotomètre.
    3. Il s’agit un nombre équivalent de cellules, normalisant selon la Division d’opposition. Utilisez stérile des microtubes à centrifuger de 1,5 mL avec un spin 5 min à 2 348 x g à la température ambiante dans une micro-centrifugeuse. Utiliser une pipette pour jeter le surnageant. Le stock final correspond à un minimum de 2,1 OD.
      Remarque : Lors du calcul d’un nombre équivalent de cellules, il peut arriver que des volumes différents peuvent être nécessaires de chaque culture une nuit ou plus pour atteindre l’OD 2.1 minime.
    4. Resuspendre le culot dans 450 µL de 0,2 M NaOH par pipetage de haut en bas. Incuber 5 min à température ambiante. Recentrifuge cellules pendant 2 min à 2 348 x g à la température ambiante et éliminer le surnageant de la pipette.
    5. Resuspendre le culot avec 50 µL de tampon de tourbillon de pipetage de haut en bas avec soin quant à ne pas faire des bulles. Échantillon de chaleur pendant 5 min à 70 ° C.
  4. Recherchez l’expression de la protéine par SDS-PAGE.
    1. Utiliser un gel à gradient de 4 à 20 % pour assurer un large éventail de poids moléculaires peut être résolu. Montant équivalent de la charge (même OD) des échantillons dans une SDS-PAGE de gel et prenez soin d’inclure au moins un échantillon contenant la non modifiées pTEF-GBD vector13,14,15.
    2. Après séparation par électrophorèse, transférer le gel de nitrocellulose et immunoblot en utilisant des anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-myc et solution de détection ECL (Figure 3).

4. activation de l’essai

  1. Strie sur la levure de MATalpha de la crosse de-80 ° C correspondant à la souche logeant la bibliothèque de proies d’intérêt sur une plaque de la DPJ en prenant un applicateur stérile en bois, en grattant une petite quantité de levure dans le flacon et en il fendant la plaque de la DPJ. Incuber la plaque de la DPJ à 30 ° C pendant 2 jours ou jusqu'à ce que les colonies individuelles sont visibles. Patch de quelques colonies individuelles sur une plaque de la DPJ et incuber une nuit à 30 ° C.
    Remarque : La nouvelle souche développée ici, à la bibliothèque de proies de maison est PLY5725 alors que certaines bibliothèques de Y2H commercialement disponibles compatibles sont logés dans des Y187.
  2. Suivez les procédures dans 3.3.1 - 3.3.4 pour transformer PLY5725 avec le LEU2-basé plasmide abritait la bibliothèque proie désirée. Pour les bibliothèques développées ici, le plasmide correspondant est pGal4AD (pPL6343). Pour récupérer les transformants de levure, plaque sur plaques CSM-Leu-Met. Après colonies surviennent, strie sous forme de taches sur une plaque de CSM-Leu-Met et incuber pendant 24 h à 30 ° C.
  3. Suivre le protocole en 3.4 pour confirmer l’expression de pPL6343 vecteur vide utilisant-HA anticorps monoclonaux ou polyclonaux et solution de détection ECL.
  4. Strie que chacun de la levure PJ69-4 a transformé en croix avec PLY5725 construit sur une plaque de la DPJ qui a été confirmée pour exprimer la protéine dans le protocole l’article 3.4 et 4.3 et incuber à 30 ° C durant la nuit. Prenez 1 mm3 des cellules où les deux souches ont grandi ensemble et patch sur séparer CSM-Leu-Met, CSM-Trp et plaques de CSM-Trp-Leu et grandir 24h.
    NOTE : Souhaitées diploïdes seront développera sur les plaques de CSM-Trp-Leu. Croissance sur CSM-Leu-Met et CSM-Trp plaques servent de témoin positif pour la croissance de la levure.
  5. Cultiver des diploïdes dans 1 mL de médias de CSM-Trp-Leu nuit à 30 ° C. Cellules de 500 µL de sédiments dans un 1,5 mL de microcentrifuge tube à 2 348 x g, 3 min à température ambiante dans une micro-centrifugeuse. Jeter le surnageant de la pipette. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL d’eau stérile et répétez la sédimentation et la remise en suspension. Vérifier l' OD600 des cellules.
  6. Faire une série de 01:10 série de dilutions de chaque suspension de cellules à l’aide de l’eau stérile avec la plupart de départ concentré solution de chacun à une OD de 0,5. Spot 5 µL de chaque dilution dans une assiette de CSM-Leu-Trp, une plaque de CSM-Leu-Trp-His et un CSM-Leu-Trp-3AT plaque son +. Incuber à 30 ° C et inspecter de croissance par jour pendant 3 jours (Figure 4).
    Remarque : pour le 01:10 dilutions, déposer 10µl du tube contenant un OD 0,5 dans 90 µL d’eau et mélanger en pipettant également de haut en bas. Continuer à faire 01:10 des dilutions successives jusqu'à ce qu’il y a un total de six différentes concentrations à repérer.

5. créer des Populations de levure avec appât et de la bibliothèque de proies

Remarque : La souche Y187 qui abrite des plasmides de bibliothèque de proie commerciale mate pas bien. Ainsi, les conditions optimisées suivantes sont nécessaires pour maintenir la complexité de la bibliothèque. Le PLY5725 souche contenant Y2H proies bibliothèques mates mieux et la même procédure d’accouplement peut être utilisée avec cette souche (Figure 5).

  1. Inoculer une 3 mL des cultures de chacun des transformants de PJ69-4 a portant les divers TRP1-contenant le plasmide appât pTEF-GBD CSM-Trp médias dans un tube à culture. Inclure deux cultures distinctes contenant le plasmide vecteur de pTEF-GBD seul pour servir en tant que contrôles procédures. Incuber les cultures à 30 ° C, 200 tr/min pendant 6 h et puis diluer dans un 25 mL de la culture dans un erlenmeyer stérile de croissance durant la nuit.
  2. Décongeler un flacon de congelés (-80 ° C) des MATalpha des cellules contenant le LEU2-transportant des « proies » bibliothèque à température ambiante. Ensemencer une 125 mL de CSM-Leu-Met les médias dans un erlenmeyer stérile avec le flacon entier décongelé. Se développer toutes les cultures du jour au lendemain à 30 ° C sous agitation à 200 tr/min.
    Remarque : L' OD600 des cultures doit varier entre 1,0 et 1,5 avant de procéder aux étapes suivantes.
  3. Centrifuger 21 équivalents OD de chacune des cultures PJ69-4 a transformant avec un spin 5 min à 4 696 x g à la température ambiante. Pour chaque 10 réactions d’accouplement désiré, pellet OD 39600 équivalents de la souche MATalpha transportant les plasmides de bibliothèque en séparé 50 mL de tubes coniques.
    1. Remettre en suspension les cellules dans 10 mL d’eau stérile et re-pellet dans nouveau 50 mL de tube conique 4 696 x g 5 min à température ambiante dans une centrifugeuse de paillasse. À l’aide d’une pipette, retirez délicatement le surnageant sans perturber les cellules granulés.
    2. Remettre en suspension les pastilles de PJ69-4 a 4 mL de cellules et les cellules de PLY5725 dans 10 mL de bYPDA (pH 3,7).
  4. De mettre en place des réactions accouplements, ajouter 1 mL de PJ69-4 a transformé des cellules et 1 mL de MATalpha cellules de bibliothèque contenant 1 mL de bYPDA pH 3,7 à nouveau 50 mL de tube à fond conique. Incuber à 30 ° C avec agitation orbitale douce (100-130 tr/min) pendant 90 min.
    1. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 4 696 x g, à température ambiante dans une centrifugeuse de paillasse. Retirez le surnageant par pipette et Resuspendre le culot dans 2 mL de bYPDA:YPD 1:1. Tous les 2 mL de sur une plaque de la DPJ de 100 mm sur plaque de pipette et incuber à 30 ° C pendant environ 20 h.
  5. Récolte des cellules sur les plaques de la DPJ à l’aide d’un grattoir de cellules pour déloger les cellules dans 2-3 mL de CSM-Leu-Trp médias. Pipetter délogent les cellules dans 50 mL de tube à fond conique. Rincer les plaques 4 - 5 fois avec 2-3 mL de CSM-Leu-Trp médias en haut les médias avec un 1000 µL Pipeter de pipetage et éjecte délicatement le support sur toute la surface de plaque de la DPJ.
    1. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 4 696 x g à température ambiante dans une centrifugeuse de paillasse. Jeter le surnageant par pipette et remettre en suspension les cellules dans 40 mL de CSM-Leu-Trp médias en pipettant également, haut et bas (do pas de vortex).
  6. Pour estimer le nombre de cellules diploïdes formé, diluer 4 µL du mélange diploïde dans 200 µL et médias de CSM-Trp-Leu 2000 µL. Plaque de 200 µL de chaque dilution sur une plaque de CSM-Leu-Trp.
    Remarque : Les deux plaques représentent une dilution de 1/10 000 et 1/100 000 pli du stock des diploïdes récoltés et produisant une colonies attendu ~ 9 000-27 000 sur la plaque de dilution de 1/10 000 après incubation à 30 ° C pendant 36-40 h. plaques de cocher après l’étape 5,7. Il faut un nombre minimum de 200 colonies sur la plaque de dilution de 1/10 000 pour passer à l’étape 5.8
  7. Immédiatement prendre le reste de chaque 40 mL de remise en suspension cellulaire et ensemencer un 1 000 mL d’erlenmeyer contenant 500 mL de Trp-Leu-CSM media. Prendre une initiale de l’OD600. Incuber ces flacons à 30 ° C sous agitation à 180 tr/min, jusqu'à ce qu’ils atteignent la saturation (~2.0 OD/mL). Cela prend généralement environ 36-40 h. surveiller la croissance après 24 h et puis à 36 h par OD600.
  8. À l’aide d’une pipette, retirer 20 mL d’aliquotes de chacune des 500 mL saturé de cultures et inoculer 2 000 mL d’erlenmeyers, un contenant 750 mL de Trp-Leu-CSM media et le second contenant 750 mL de CSM-Leu-Trp-His au niveau le plus bas de 3AT qui élimine le fond (préalablement déterminée à la Section 4.5). Les nouvelles cultures (770 mL) bien mélanger en agitant et prendre une initiale de l’OD600.
  9. Incuber les cultures à 30 ° C en agitant à 180 tr/min jusqu'à arriver à saturation, qui généralement se produit moins de 24 h pour la culture de CSM-Leu-Trp désélectionnée et peut prendre plus de 70 h pour les cultures sous sélection Y2H interactions.
  10. Une fois que les cultures ont atteint saturation (OD ~ 2.0), supprimer 11 mL d’une pipette, sédiments de cellules avec un spin 5 min à 4 696 x g à la température ambiante, jeter le surnageant par pipette et congeler à-20 ° C ou continuer sur l’extraction de l’ADN. Les échantillons sélectionnés et non sélectionnés tous deux serviront pour le séquençage en profondeur.

6. préparation de séquençage profonde DEEPN

  1. Extraction de l’ADN.
    1. Utiliser une pipette pour remettre en suspension les pastilles de cellule de protocole section 5.7 dans 500 µL de tampon de sTE et le transfert à un 1,5 mL de tubes de microcentrifuge. Ajouter 3 µL de betamercaptoethanol et 10 µL de Zymolase stock. Bien mélanger et laisser incuber dans un incubateur à 37 ° C pendant 24 à 36 h.
    2. Extraire l’échantillon deux fois avec de l’alcool de phénol/chloroforme/isoamylique 500 µL tout en utilisant une fumée capot16.
    3. Ajouter 7 µL de 4 M NaCl, 900 µL de glace froide 100 % d’éthanol (ETOH), mélanger par inversion et soit gel-20 ° C ou continuer d’ADN des sédiments de la filature à 21 130 x g pendant 10 min à température ambiante dans une micro-centrifugeuse.
    4. Jeter le surnageant de la pipette. Laver le granule trois fois avec 900 µL de 70 % ETOH.
    5. Sédiments pellet 21 130 x g pendant 2 min et retirez résiduelle lavage ETOH en pipette. Granulés secs pendant 7 min à 42 ° C.
    6. Resuspendre le culot dans 120 µL de 0,1 x sTE dans un bain-marie à 37 ° C pendant 90 min, feuilleter les tubes pour mélanger toutes les 30 minutes.
    7. Pipetter 60 µL d’extrait d’ADN dans un stérile de 1,5 mL de tubes de microcentrifuge. Ajouter 120 µL de sTE, 3,5 µL du stock de la RNase A, sélecteur pour mélanger et laisser incuber à 37 ° C pendant 1 h.
    8. Précipité d’éthanol faite précédemment dans la Section 6.1.3 - 6.1.5, mais l’utilisation de 7 µL d’acétate d’ammonium 5 M au lieu de 4 M de NaCl.
    9. Resuspendre RNase imprégnées d’insecticide A ADN dans 55 µL de 0,1 x sTE dans un bain-marie à 37 ° C pendant 90 min, feuilleter les tubes pour chaque 30 min. de quantifier l’ADN de la composition de l’absorbance à 260 nm sur un spectrophotomètre.
  2. PCR cDNA insère.
    1. Effectuer deux, réactions de PCR 50 µL par échantillon d’ADN. Chaque réaction contient 25 pmol de chaque amorce avant et arrière correspondant le plasmide de proies-bibliothèque (voir documentation). Réactions aussi contenir 25 µL de High-Fidelity 2 x PCR Master Mix, 5 µg de l’échantillon d’ADN et l’eau jusqu'à 50 µL. amplifier des réactions pour 25 cycles avec des temps d’extension de 3 min à 72 ° C, une température de recuit de 55 ° C pendant 30 s et dénaturation à 98 ° C pendant 10 s. Precede cyclisme par une dénaturation de s de 30 à 98 ° C et suivez avec une incubation de 5 min à 72 ° C.
    2. Analyser les 4 µL de chaque réaction de PCR par électrophorèse de gel d’agarose ADN 1 % avec l’agarose de l’ADN de gel contenant 0,2 - 0,5 µg/mL de bromure d’éthidium17. Visualiser l’échantillon d’ADN par transillumination UV. Échantillons montrera un frottis de l’ADN autour de 1-3 kb, où le marquage chromosomique peut être trouvée pour échantillons où une interaction Y2H a été sélectionné (Figure 6).
    3. Combiner des doubles des échantillons PCR et de purifier à l’aide de la trousse de purification du PCR conformément aux instructions du fabricant et de quantifier l’ADN de l’absorbance à 260 nm sur un spectrophotomètre.

7. deep séquençage

NOTE : Préparation de l’échantillon et le séquençage sur une plate-forme de séquençage en profondeur est généralement disponible dans les installations centrales du séquençage de l’ADN commerciales et universitaires.

  1. Cisaillement 600 ng du produit PCR utilisant un haute performance ultra-sonicateur pour donner des fragments d’une longueur moyenne d’environ 300 bp.
  2. Générer des bibliothèques de séquençage indexée en utilisant un kit de préparation pour le séquençage en profondeur qui ajoute des linkers codant des codes à barres, d’amorçage sites, et de capturer des séquences asymétriquement sur les extrémités des fragments d’ADN.
  3. Effectuer la préparation de la bibliothèque selon les instructions du fabricant. Piscine indexé bibliothèques et séquence que les lectures de long jumelé-fin sur une plate-forme de séquençage en profondeur (par exemple, 2 x 150 bp PE lectures). Le nombre désiré de lectures ciblées pour chaque échantillon est entre 10 et 40 millions, avec des lectures plus désirées pour les populations non sélectionnées qui sont généralement plus complexes. Nous recommandons au moins 20 millions ou plusieurs lectures pour les populations non sélectionnées.

8. bioinformatique traitement et vérification

  1. Analyse statistique des données en enrichissement de gène entre les ensembles de données () 3) effectuer des processus ADN ordonnançant des données sous forme de fastq avec un ensemble de logiciels autonomes programmes construits pour (1) carte séquence lire 2) quantifier les fichiers dans un format universel de SAM () afin de classer quel candidat gènes sont positifs pour l’interaction Y2H () 4) offrent de fournir des informations qu’elles ce qui s et quel cadre translationnelle chaque de l’ADNc de la proie par gène des fragments qui donnent Y2H positive des interactions sont composées et (5) outils pour reconstruire non seulement la 5', mais aussi l’extrémité 3' des fragments interdépendants permettant leur reconstruction et la vérification dans un format traditionnel de Y2H. Fonctionnement de ces programmes est détaillée dans l’étude qui l’accompagne.

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Résultats

Le dosage Y2H a été largement utilisé pour trouver des interactions de protéine : protéine et plusieurs adaptations et systèmes ont été développés. Pour l’essentiel, les mêmes considérations qui aident à assurer le succès de ces approches précédentes sont importantes pour DEEPN. Parmi les critères importants : assurer l’expression du domaine de liaison à l’ADN des protéines de fusion, un faible bruit de fond des rayonnements non essentiels à assurer son + croissance dans les diploïdes con...

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Discussion

Ici, nous fournissons un guide pour savoir comment effectuer les dosages Y2H en lot à l’aide de méthodes optimisées. Il y a quelques étapes cruciales dans la procédure pour s’assurer que la population de levures qui seraient placés sous la sélection est représentatif de la bibliothèque de départ et que suffisamment de la population de levures départ sert à subir une sélection afin de limiter la variabilité . Ce qui est important, ces repères sont relativement faciles à réaliser aux côtés d’adapter les méthodes et les mat...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Remerciements

Nous remercions le personnel au sein de l’Institut de génétique humaine de séquençage et de préparation de bibliothèque NGS. Nous remercions Einat Snir pour son expertise dans la préparation des fragments de banque génomique pour la bibliothèque de plasmide Y2H faite ici. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health : NIH R21 EB021870-01 a 1 et de subvention de projet de recherche FNS : 1517110.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Illumina HiSeq 4000Plateforme de séquençage profond Illumina
Anticorps monoclonaux anti-HABiolegend901514Anticorps primaire pour détecter l’expression de HA dans les constructions pGal4AD
Anticorps polyclonaux anti-mycQED Biosciences Inc18826Anticorps primaire pour détecter l’expression de MYC dans les constructions pTEF-GBD
NarINew England BioLabsR0191S
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
BamHI-HFNew England BioLabsR3236S
XhoINew England BioLabsR0146S
Polyéthylène Glycol 3350, poudreJ.T. BakerU2211-08
Salmon Sperm DNATrevigen, Inc vendu par Fisher Scientific50-948-286ADN porteur pour la transformation de la levure section 3.2.1.
Monosulfate de kanamycineResearch Products InternationalK22000
LE AgaroseGeneMateE-3120-500utilisé pour la fabrication de gels d’agarose d’ADN
Chlorure de sodiumResearch Products InternationalS23025
TryptoneResearch Products InternationalT60060
D-SorbitolResearch Products InternationalS23080
Acétate de lithium dihydratéMP Biomedicals155256
Chlorure de calciumThermoFisherC79
EDTA Sel de sodiumResearch Products InternationalE57020
Extrait de levure en poudre Produitsde recherche InternationalY20020
Base d’azote de levure (sulfate d’ammonium) sans acides aminésResearch Products InternationalY20040
CSM-TRP-Leu+40ADEFormediumDCS0789
CSM-TRP-Leu-His+40ADEFormediumDCS1169
CSM-Leu-MetFormediumDCS0549
CSM-TRP-MetBio 101, Inc4520-922
L-MethionineFormediumDOC0168
AdenineResearch Products InternationalA11500
D-(+)-GlucoseResearch Products InternationalG32045
Bacto AgarBD214010utilisé pour la fabrication de plaques de média dans la section 1
PeptoneResearch Products InternationalP20240
3-amino-1,2,4 TriazoleSigmaA8056
2- Mercaptoehanol (BME)Sigma-AldrichM6250
Zymolyase 100TUSBiologiqueZ1004
Phosphate de potassium dibasiqueSigmaP8281
Phénol :Chloroforme :IAAAmbionAM9732
Acétate d’ammoniumSigma-Aldrich238074
EthanolDecon Laboratories, INC2716
RNAse AThermoFisherEN0531
UreaResearch Products InternationalU20200
SDSResearch Products InternationalL22010
glycérolSigma AldrichG5516
Tris-HClGibco15506-017
bleu de bromophénolAmresco449
Gibson Assembly Cloning KitNew England BiolabsE5510SMéthode d’assemblage rapide pour le clonage des plasmides dans la section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541SUtilisé pour l’amplification des produits pour l’assemblage Gibson dans la section 2.3 ainsi que pour la préparation des échantillons pour le séquençage profond DEEPN dans la section 6.2.1
Bromure d’éthidiumAmresco0492-5G
Kit de purification PCR QIAquickQiagen28104Utilisé pour la purification des produits PCR dans la section 6.2.3
Kit d’extraction de gel d’ADN QiaquickQiagen28704Utilisé pour la purification du pTEF-GBD digéré dans la section 2.1
KAPA Hyper Prep KitKAPA BiosystemsKK8500Kit de préparation pour le séquençage profond Optimisation des
codonshttp://www.jcat.de
Optimisation des codonshttps://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Technologiesde l’ADN intégrées Fragments d’ADNutilisés pour le clonage dans la section 2.2
Chaînes FragmentsThermofisherutilisés pour le clonage dans la section 2.2
Trousse de mini-préparation de l’ADN plasmidique GenCatchEPOCH Life SciencesUtilisé pour préparer des quantités d’ADN dans la section 2.3
Covaris E220Ultra-sonicateur haute performanceCovaris
oligo nucelotide 5'- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'		Technologies d’ADN intégrées ou Thermofisherutilisées pour l’amplification et le séquençage de l’insert 5' pTEF-GBD pendant la construction du plasmide
oligonucléotide 5'-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3'		Integrated DNA Technologies ou Thermofisherutilisé pour l’amplification et le séquençage de la pcr 5' insert pTEF-GBD pendant la construction du plasmide
oligonucelotide 5'-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3'		Integrated DNA Technologies ou Thermofisherutilisé pour l’amplification et le séquençage de l’insert 3' pTEF-GBD pendant la construction du plasmide
oligonucléotide 5'-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3'		Technologies d’ADN intégrées ou Thermofisherutilisées pour l’amplification et le séquençage de l’insert 3' pTEF-GBD pendant la construction du plasmide
oligonucléotide 5'-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3'		Integrated DNA Technologies ou Thermofisher5' Pimer utilisé pour l’amplification d’insertion de l’oligonucelotide pGAL4AD
5'-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3'		Technologies d’ADN intégrées ou Thermofisher3' Pimer utilisé pour l’amplification d’insert de l’oligonucelotide pGAL4AD
5'-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3'		Integrated DNA Technologies ou Thermofisher5' Pimer utilisé pour l’amplification d’insertion de l’oligonucelotide pGADT7
5'- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3'		Integrated DNA Technologies ou Thermofisher3' Pimer utilisé pour l’amplification d’insertion de la souche de levure pGADT7
PJ69-4A MatAhttp://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA : Banques génomiques et une souche hôte conçue pour une sélection bi-hybride très efficace chez la levure. GÉNÉTIQUE 1996 144:1425-1436MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2 ::GAL1-HIS3 met2 ::GAL7
pTEF-GBDDr. Robert Piper LabGal4-DNA binding doimain expression plasmide
pGal4AD (pPL6343)Dr. Robert Piper LabPlasmide d’expression du domaine d’activation Gal4
100 mm boîtes de PétriKord-Vallmark vendues par VWR2900
Fiole Erlenmeyer en PYREX 125 mLFisher ScientificS63270
250 mL Fiole Erlenmeyer en PYREXFisher ScientificS63271
1 000 mL Fiole Erlenmeyer en PYREXFisher ScientificS63274
2 000 mL Fiole Erlenmeyer en PYREXFisher ScientificS63275
Tube de culture jetable 20 X 150 mmThermofisher14-961-33
Aide à la pipetteDrummond4-000-100
5 mL Pipette sérologiqueDenvilleP7127
10 mL Pipette sérologiqueDenvilleP7128
25 mL Pipette sérologiqueDenvilleP7129
1 000 mL PYREX Bécher GriffinFisher Scientific02-540P
1 000 mL PYREX Bouteille de stockageScientific06-414-1D
Cylindre gradué de 1 000 mLFisher Scientific08-572-6G
SpectraMax 190Dispositifsutilisés pour mesurer la densité optique des cellules
NanoDrop 2000Spectrophotomètre Thermo ScientificND-2000utilisé pour quantifier la quantité d’ADN
UV électronique transilluminateurUltra LumMEB 20utilisé pour visualiser l’ADN dans un gel d’agarose au bromure d’éthidium
P1000 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123602G P200
Gilson PIPETMANFisher ScientificF123601G
P20 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123600G
P10 Gilson PIPETMANFisher ScientificF144802G
1250 et micro ; L Pointes de pipette à faible rétentionGeneMateP-1236-1250
200 µ ; LLow Pointes de pipette de rétentionVWR10017-044
10 & micro ; L XL Pointes de pipette à faible rétentionVWR10017-042
50 mL Tube coniqueVWR490001-627
15 mL Tube coniqueVWR490001-621
Racleur de cellulesDenville ScientificTC9310
1,5 mL Microtubes à centrifugerUSA Scientific1615-5500
HClFluka Analytical318949-1L
NaOHJ.T. Baker5674-02
Applicateurs en boisSolon Care55900
Microcentrifugeuse Eppendorf 5424Fisher Scientific05-400-005Microcentrifugeuse
Sorvall ST16RThermo Fisher Scientific75004381centrifugeuse de paillasse
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP linked whole Ab (from donkey)GE Soins de santéNA934-1MLAnticorps secondaire
Amersham ECL IgG de souris, AB entier lié à la HRP (provenant de moutons)GE HealthcareNA931-1MLAnticorps secondaire
SuperSignal West Pico Substrat chimiluminescentThermo Fisher Scientific34080Solution de détection ECL
Incubateur Isotemp IncubateurThermo Fisher Scientific
Mutitron 2INFORS HTIncubateur à secousses
Isotemp Bain-marie à commande numérique Modèle 205Fisher ScientificBain d’eau
Y2H Bibliothèque d’ADNc de souris dans Y187 (tissu de casserole)Clontech630482Bibliothèque d’ADNc de
souris Y2H disponible dans le commerce Y187 (cerveau de souris)Clontech630488Bibliothèque d’ADNc disponible dans le commerce
pGADT7 AD VectorClontech630442vecteur AD disponible dans le commerce hébergeant de nombreuses banques d’ADNc
Vecteur pGBKT7 DNA-BDClontech630443disponible dans le commerce Vecteur DNA-BD
Biolase ADN polyméraseBiolineBIO-21042ADN polymérase utilisée pour la section 2.4
Thermocycleur GeneMate GCL-60BioExpressP-6050-60machine PCR TempAssure
0,5 mL Tubes PCRÉtats-Unis Scientifique1405-8100
d’ADN en section 7 Fisher moléculaires

Références

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Interactions prot ine prot inem thode DEEPNs quen age profondconstruction du plasmide app tpr paration de la biblioth que de proiesr actions d accouplement de levuresprotocole d extraction d ADNamplification par PCRtraitement bioinformatique
Un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les Interactions protéine
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