Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Résumé

La différenciation des adipocytes blancs et beiges de tissu adipeux progéniteurs vasculaire porte le potentiel d’amélioration métabolique dans l’obésité. Les auteurs décrivent des protocoles pour un CD34 + CD31 + isolation de cellules endothéliales de la graisse humaine ainsi qu’un subséquent in vitro de l’expansion et la différenciation en adipocytes blancs et beiges. Plusieurs applications en aval sont discutées.

Résumé

L’obésité s’accompagne d’un vaste remodelage du tissu adipeux principalement par l’intermédiaire de l’hypertrophie adipocytaire. Adipocyte extrême croissance résulte en une mauvaise réponse à l’insuline, l’hypoxie locale et l’inflammation. En stimulant la différenciation des adipocytes blancs fonctionnels de progéniteurs, hypertrophie radicale de la population d’adipocytes peut être évitée et, par conséquent, la santé métabolique du tissu adipeux peut être améliorée ainsi qu’une réduction de inflammation. En outre, en stimulant une différenciation des adipocytes beige/brun, la dépense d’énergie totale du corps peut être augmentée, entraînant une perte de poids. Cette approche pourrait prévenir le développement de co-morbidité de l’obésité comme les maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2.

Cet article décrit l’isolement, l’expansion et la différenciation des adipocytes blancs et beiges d’un sous-ensemble de cellules endothéliales de tissu adipeux humain qui expriment conjointement les marqueurs CD31 et CD34. La méthode est relativement bon marchée et n’est pas beaucoup de travail. Il requiert l’accès aux tissus adipeux humains et le dépôt sous-cutané est adapté pour l’échantillonnage. Pour ce protocole, les tissus adipeux frais échantillons provenant de sujets souffrant d’obésité morbide [indice de masse corporelle (IMC) > 35] sont collectées pendant les procédures de chirurgie bariatrique. À l’aide d’une immunoseparation séquentielle de la fraction stroma vasculaire, suffisamment de cellules est produites à aussi peu que 2 à 3 g de matières grasses. Ces cellules peuvent être développés en culture sur une période de 10 à 14 jours, peuvent être cryoconservés et conservent leurs propriétés adipocytaire avec passage jusqu'à passage 5-6. Les cellules sont traitées pendant 14 jours avec un cocktail à l’aide d’une combinaison de l’insuline humaine et l’agoniste-rosiglitazone PPARγ adipocytaire.

Cette méthode peut être utilisée pour l’obtention de preuve d’expériences de notion sur les mécanismes moléculaires qui animent les réponses adipocytaire dans les cellules endothéliales adipeuses, ou pour le dépistage des nouveaux médicaments qui peuvent augmenter l’adipocytaire réponse dirigée soit vers le blanc ou différenciation adipocytaire beige/marron. À l’aide de petites biopsies sous-cutanée, cette méthodologie permet d’écarter les sujets non-répondeur pour des essais cliniques visant à stimuler les adipocytes beige/marron et blancs pour le traitement de l’obésité et les comorbidités.

Introduction

Des données récentes montrent que, chez les souris et chez l’homme, un sous-ensemble de cellules résidant dans la vascularisation du tissu adipeux peut être différencié en soit les adipocytes blancs ou beige/marron^1,2,3. Le phénotype de ces cellules est un sujet de controverse, avec preuves à l’appui des cellules endothéliales, musculaires lisses/pericyte ou un spectre de phénotypes intermédiaires^4,5,6,7. Le champ d’application de cette méthodologie de développement était de tester le potentiel adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales isolées de différents dépôts gras contre les hommes obèses. D’autres études dans la littérature mettent l’accent sur le potentiel de la fraction totale de vasculaire stromale ou des progéniteurs adipocytaires connu^2,8,9adipocytaire. Étant donné que les technologies existantes peuvent cibler spécifiquement les cellules endothéliales tissu adipeux pour drogue livraison¹⁰, compréhension du potentiel de ces cellules à subir adipocytaire induction vers les adipocytes blancs ou beiges est importante pour futures thérapies ciblées.

Différents groupes ont signalé la combinaison de marqueurs CD31 et CD34 comme substituts pour isoler les cellules endothéliales du tissu adipeux humain^11,12,13. En règle générale, l’isolement est effectuée à l’aide de deux étapes séquentielles et une sélection positive à l’aide de billes magnétiques. Dans ce rapport, immunoseparation à l’aide de CD34 + billes magnétiques combinés avec des perles en plastique CD31 a été utilisée. Nous avons constaté que cette technique est supérieure à l’immunoseparation magnétique séquentielle en ce qui concerne la conservation de la morphologie endothéliale pavées typiques. Aussi, nous étions en mesure de produire suffisamment de cellules nécessaires à l’expansion et adipocytaire induction à partir d’aussi peu que 1 à 2 g de matières grasses. Une biopsie du petit échantillon de graisse sous-cutanée est suffisant pour produire la quantité requise de cellules pour les applications en aval. Cet aspect est potentiellement important, surtout si cette méthode sera utilisée pour le dépistage d’une réactivité à induction adipocytaire chez des sujets humains.

Contrairement aux autres systèmes rapportés dans la littérature, cette méthode utilise seulement deux ingrédients pour l’induction adipocytaire des cellules CD34 + CD31 + : un agoniste PPARγ — rosiglitazone — et l’insuline humaine. Ce qui est important, la quantité d’insuline utilisée correspond à la fourchette de normale/haute de circulation insuline post-absorptif chez les humains,¹⁴. Le degré de sensibilité à l’insuline du cellules in vitro, mesurée par la phosphorylation de l’Akt, n’est pas corrélée avec leur capacité de répondre à l’induction cocktail. Fait intéressant, un mélange de blancs et beige/marron de cellules en utilisant des conditions expérimentales et cocktail cette induction, ont été obtenues tel que déterminé par la taille et le nombre de gouttelettes de lipides intracellulaires et l’expression des marqueurs moléculaires. Ce protocole d’induction simple et rentable ainsi que l’évaluation quantitative du phénotype des cellules répondeur (blanc ou beige) permet un dépistage d’agents qui peuvent potentiellement modifier l’équilibre du beige différenciée : blanc d’adipocytes.

Cette méthode fournit également une approche translationnelle pour comprendre les mécanismes sous-jacents de l’adipogenèse des progéniteurs endothéliales vasculaires dans le tissu adipeux humain. Utilisant cette technique d’isolation/différenciation spécifique, les enquêteurs peuvent interroger diverses voies chargées de l’adipogenèse dans un sous-ensemble de cellules endothéliales vasculaires de différents dépôts de graisse chez l’homme maigre et obèses.

Protocole

Le Comité d’examen institutionnel à Eastern Virginia Medical School a approuvé la recherche et la collecte d’échantillons de tissus adipeux humains utilisés dans l’étude. Consentement éclairé par écrit ont été recueilli chez les patients.

1. préparation des tampons, des médias et Instruments

1. Préparer une Solution de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS) : 135 mM chlorure de sodium, chlorure de potassium de 5 mM, 1 mM sulfate de magnésium, 0,4 mM de phosphate de potassium dibasique, glucose 5,5 mM, 1 mM l’adénosine, 0,01 % de mélange antibiotique/Antimycosique (50 µg/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine, 30 µg/mL de gentamicine, 15 ng/mL d’amphotéricine) et 10 mM HEPES (pH = 7,4). Cette solution est préparée fraîche chaque fois pour le prélèvement tissulaire et la digestion.
2. Préparer une solution de collagènase fraîches : 1 mg/mL de collagénase, tapez 1, dans KRBSS ; faire 3 mL/g de matière grasse. Réchauffez la solution de la collagénase à 37 ° C dans un bain d’eau avant la digestion du tissu.
3. Préparer un tampon d’isolement cellulaire CD34 : 2 % sérum fœtal (SVF) et 1 mM EDTA stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
4. Préparer l’adipogenèse Media : DMEM/F12, 5 % FBS, 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine, 1,25 µL/mL de l’insuline humaine (5 µg/mL ou 144 mU/mL) et 0,36 µL/mL de 2,8 mM rosiglitazone (1 µM).
5. Préparer une solution de réserve d’huile rouge O (ORO) 0,3 % (poids/volume) en dissolvant 0,3 g de ORO dans 100 mL d’isopropanol.

2. tissu adipeux Fraction vasculaire stromales isolement

Remarque : L’étude a inclus une cohorte transversale d’obésité morbide type 2 diabétiques (T2D) et des sujets non diabétiques, âgés de 18 à 65 ans, qui subissent une chirurgie bariatrique au Sentara métaboliques et centre de chirurgie de perte de poids (Sentara Medical Group, Norfolk, Virginie). Critères d’exclusion incluent une maladie auto-immune, y compris le diabète de type 1, conditions nécessitant une thérapie immunosuppressive chronique, anti-inflammatoires, thiazolinendiones, tabagisme actif, les infections chroniques ou aiguës ou une histoire de malignité traitées dans les 12 derniers mois. T2D était définie comme une glycémie plasmatique à jeun de 126 mg/dL ou plus, une glycémie de 200 mg/dL ou plus après une tolérance au glucose 2 h test ou l’utilisation de médicaments antidiabétiques.

1. Collecte humaine épiploïques (OM) et du tissu adipeux sous-cutané (SC) (AT) des sujets humains qui subissent une chirurgie bariatrique.
2. Garder l’OM et SC AT dans des flacons séparés contenant mis en mémoire tampon salin de Hank avec 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine à température ambiante immédiatement après l’extraction des tissus.
3. Soigneusement nettoyer et supprimer les articles fibreux et cautérisation du tissu à l’aide de pinces et ciseaux écouvillonnée de l’éthanol 70 % lorsque l’échantillon arrive au laboratoire après l’extraction des tissus.
4. Peser le tissu adipeux et partitionner les aliquotes de TI en 5 g (ou moins) pour la digestion de collagénase.
5. Finement hacher 5 g de l’AT dans 5 mL d’une solution de collagènase dans un flacon à scintillation à température ambiante, à l’aide de deux paires de ciseaux.
6. Ajouter 10 mL de solution de collagènase supplémentaire au tissu haché pour total 15 mL.
7. Digérer les échantillons pendant 1 h, à 37 ° C, dans un bain d’eau sous agitation continue.
8. Couper l’extrémité loin une seringue de 20 mL pour faire une extrémité arrondie.
9. Découper un carré de 9 x 9 cm d’un maillage de 250 µm et poussez-le à mi-chemin dans un tube conique de 50 mL à l’aide de la seringue à extrémité arrondie.
10. Versez les échantillons dans la seringue de 20 mL extrémité arrondie et le filtre à travers les mailles de nylon 250 µm dans le tube conique de 50 mL pour séparer les adipocytes et les cellules du stroma vasculaires des tissus non digérés.
    Remarque : N’utilisez pas plus de 5 g d’AT / tube conique de 50 mL, comme le maillage va se boucher à cause de l’excès de matériau fibreux non digérés.
11. Nettoyez le flacon à scintillation avec 10 mL de KRBBS et versez-la dans le filtre pour recueillir des cellules résiduelles.
12. Incuber les échantillons filtrés pendant 5 min à température ambiante.
    Remarque : Cette étape est importante pour permettre les adipocytes de flotter dans le haut du tube et certaines cellules stromales vasculaires à se déposent au fond du tube.
13. Utiliser une seringue de 20 mL et un 20 x 6 en pipettant aiguille pour enlever la couche stromale fraction vasculaire et l’introduire dans un tube conique propre 50 mL.
14. Ajouter 10 mL de KRBBS et laisser les échantillons de s’asseoir sur le banc pendant 5 min, à température ambiante.
15. Répétez les étapes 2.12 – 2.14 deux fois.
    Remarque : Ces étapes assurera qu’il n’y a aucune contamination des cellules stromales vasculaires avec les adipocytes flottants.
16. Garder les fractions stroma vasculaires de deux dépôts sur la glace pour un traitement supplémentaire, tel que décrit dans les étapes ci-dessous.
    Remarque : Ne laissez pas les cellules sur la glace pendant plus de 1 h, comme cela peut avoir une incidence sur la viabilité des cellules. Les adipocytes peuvent être congelés dans l’azote liquide pour le stockage à long terme flash ou utilisée fraîches pour des expériences.

3. isolement des cellules endothéliales du tissu adipeux

1. Faites tourner les fractions stroma vasculaires (SVF) à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C.
2. Enlever les échantillons de la centrifugeuse et soigneusement décanter le liquide surnageant ; Gardez le culot contenant les cellules SVF.
3. Resuspendre doucement les boulettes de cellule dans 5 mL de PBS.
   NOTE : Si plus de 5 g d’un dépot de AT a été transformé en plusieurs parties aliquotes (voir étape 2,4), regrouper les granules cellulaires.
4. Faites tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C.
5. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS compter les cellules non vides.
   NOTE : Ici, un compteur de cellule automatique a été utilisé pour le comptage des cellules. La viabilité cellulaire a été obtenue par mélange de 12 µL de suspension cellulaire avec 12 µL d’une solution de l’acridine orange/propidium iodure (AO/PI) (voir la Table des matières). Le nombre moyen de cellules par gramme d’AT pour chaque dépôt est : (a) Depot OM : 1,69 x 10⁵ ± 4.51 x 10⁴; (b) SC Depot : 1,24 x 10⁵ ± 6,45 x 10⁴. La viabilité des cellules de deux dépôts était > 90 %.
6. Pellet les échantillons à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C.
   Remarque : Un protocole de sélection d’immunomagnetic CD34 (voir Table des matières) a été adapté pour étapes 3.7 – 3,15.
7. Resuspendre le culot dans 100 µL de tampon d’isolement CD34.
   Remarque : Le nombre total de cellules nécessite les volumes suivants de la remise en suspension : (a) < 2 x 10⁷ cellules : Resuspendre le culot dans 100 µL ; (b) 2 x 10⁸– 5 x 10⁸ cellules : Resuspendre le culot dans 1 mL. En étapes 3,9 – 3.16, les volumes des réactifs utilisés ont été revus à la baisse pour < 2 x 10⁷ cellules.
8. Ajouter 10 µL de cocktail CD34 et incuber l’échantillon pendant 15 minutes, à température ambiante.
9. Ajouter 5 µL de billes magnétiques et incuber l’échantillon pendant 10 min, à température ambiante.
10. Ajouter 2,5 mL de tampon d’isolement CD34 dans chaque échantillon et placer les échantillons dans l’aimant, pendant 5 min, à température ambiante.
11. Inverser l’aimant pour 5 s pour décanter le tampon de l’isolement.
12. Enlever les échantillons de l’aimant et répétez les étapes 4 de x 3.10 et 3.11.
13. Retirer le tube de l’aimant et ajouter 2 mL de tampon d’isolement CD34.
14. Pellet les cellules à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C.
15. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 1 mL de tampon d’isolement CD34 et compter les cellules non vides.
    NOTE : Ici, le nombre moyen de cellules par gramme d’AT est : (a) Depot OM : 4.75 x 10⁴ ± 3,36 x 10⁴; (b) SC Depot : 1,06 x 10⁴ ± 9.53 x 10³. Un protocole de plastique immunobead CD31 a été adapté pour obtenir la procédure 3.16 – 3.34 (voir Table des matières).
16. Cellules à 500 x g pendant 5 min de granule et Resuspendre le culot dans 250 µL de tampon B et 250 µL de tampon de lavage.
17. Bien remettre en suspension les perles CD31 au vortex le tube.
18. Ajouter 20 µL de perles CD31.
    Remarque : En raison de la cellule total compte > 1 x 10⁶, le volume a été réduit après l’entrée du constructeur.
19. Incuber l’échantillon avec bascule pendant 30 minutes, à température ambiante.
20. Fixer un filtre dans un tube conique stérile de 50 mL.
    Remarque : L’ouverture plus grande de la crépine doit être sur le dessus.
21. Avant la séparation de la cellule, ajouter 1 mL de tampon de lavage s’équilibrer la crépine. Appliquer le mélange généré sous étape 3.16 à la crépine.
22. Lavez le filtre avec 5 mL de tampon de lavage dans un mouvement circulaire pour un volume total de 20 mL. Branchez le connecteur sur un tube conique stérile de 50 mL et fermer le raccord luer-lock.
23. Posez la passoire sur le connecteur. Ajouter 1 mL de tampon de lavage le long du mur de la crépine. Ajouter 1 mL de tampon activée D le long du mur de la crépine. Agiter l’échantillon doucement et il incuber pendant 10 min, à température ambiante.
24. Ajouter 1 mL de tampon de lavage. Séparer les cellules les perles en pipettant également monter et descendre de 10 x.
    Remarque : Ne pas produire des bulles d’air.
25. Ouvrir le raccord luer-lock et laisser les cellules individuelles s’écouler dans le tube conique de 50 mL. Lavez le tamis 10 x 1 ml de tampon de lavage chaque fois.
26. Jeter le connecteur et la crépine et centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 10 min, à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 2 mL d’EGM-2 médias de la culture.
    Remarque : Le nombre moyen de cellules par gramme d’AT, à ce stade est : (a) Depot OM : 5,92 x 10³ ± 4,27 x 10³; (b) SC Depot : 4.12 x 10³ ± 2.1 x 10³. La viabilité des cellules de deux dépôts était supérieur à 90 %.

4. l’induction de l’adipogenèse dans les cellules endothéliales isolées

1. Cultiver les cellules dans 6 plats traitée pour la culture de tissu avec les médias complet EGM-2 a 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur. Remplacer les médias tous les jours 3 et 4 jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence de 80 à 90 %.
   Remarque : Le doublement de la population est entre 2 à 3 jours.
2. Développez les cellules en les ensemençant sur boîtes de Petri de 100 mm et fractionner les cellules une fois 1:3. À ce stade, les cellules sont sur passage 2.
3. Compter les cellules à l’aide d’une cellule automatique contrer (voir Table des matières).
4. Cellules de graines environ 100 – 200 000 en plaques 6 puits assurant les puits dédoublés pour chaque dépôt et de la culture complète en EGM-2 supports pour 2 jours.
5. Aspirer hors des milieux de culture et remplacez-le par 2 mL de DMEM/F12 avec 5 % FBS et 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine pour le contrôle des cellules et remplacez-le par 2 mL de l’adipogenèse médias (Voir l’étape 1.4) pour le traitement de cellules.
6. Incuber les cellules à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO₂ incubateur pendant 13 jours, remplaçant les médias respectifs tous les 3 à 4 jours.
   Remarque : Les cellules commence à accumuler les lipides après 4 jours de traitement.
7. Conduite d’ORO et du Nil rouge de coloration selon les méthodes publiées^15–17.
8. Pour isoler des cellules pour une extraction de l’ARN, retirez le support des plaques induction 6 puits et lavez-le avec 1 mL de PBS stérile.
9. Ajouter 350 µL d’une solution de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidium (voir Table des matières) pour chaque bien et il incuber à température ambiante pendant 5 à 10 min.
10. Gratter les cellules de la plaque à l’aide d’un grattoir de cellules et de transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    Remarque : Les échantillons peuvent être conservés dans le congélateur-80 ° C pour l’extraction de l’ARN et la transformation ultérieure à une date ultérieure.
11. Extraire les ARNm des échantillons à l’aide d’une extraction adaptée de l’ARN du protocole (voir Table des matières).
12. Effectuer une réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) afin d’évaluer l’expression des gènes en utilisant les sondes suivantes : adiponectine, UCP-1 et CIDEA (voir Table des matières).
    NOTE : Ici, les procédures de RT-PCR ont été effectuées en utilisant le protocole standard suivant : dénaturation (95 ° C ; 15 s), recuit et extension (60 ° C, 1 min) pendant 40 cycles. Les échantillons qui expriment des gènes avec des valeurs de C_T > 35 étaient considérés comme indétectable.

Résultats

Notre protocole vise à fournir une approche in vitro afin de déterminer le potentiel adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules vasculaires de différents dépôts de tissus adipeux humains. Un diagramme de l’organigramme simplifié est montré dans la Figure 1 a. La première étape à l’aide d’une sélection positive de CD34 exprimant des cellules entraîne > 95 % cellules CD34 + dans la population des cellules fraîchement isolées (Fi...

Discussion

L’objectif de cet article est de fournir une méthodologie pour l’isolement, l’agrandissement et l’induction adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales de dépôts viscérales et sous-cutanée du tissu adipeux humain.

Méthodologies ont été rapportés pour l’isolement des cellules endothéliales de différents lits vasculaires des rongeurs ou des humains qui impliquent principalement les techniques utilisant des anticorps CD31 fluorescent étiquetés ou couplée à des billes magnétiques

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Large Equipment
Enceinte de biosécurité	Nuaire	nu-425-400
Incubateur de culture cellulaire	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Bain-de-bain	Forma Scientific	2568	Agitateur réciproque
RT-PCR	BIO-RAD	CFX96-C1000
Boîte d’électrophorèse	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 cellules
Boîte Transblot	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Bloc d’électrophorèse	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Proche infrarouge
Centrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	5810 R
centrifugeuse de table	Eppendorf	MiniSpin Plus
Microscope fluorescent	Olympus	BX50
Microscope inversé	Nikon	TMS
strong>KRBSS Buffer
HEPES <	p>Research Products International	H75030
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich	792519
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma-Aldrich	C7902
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P5655
Sulfate de magnésium	Sigma-Aldrich	M2643
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	746398
Phosphate monobasique monohydraté	Sigma-Aldrich	S9638
Potassium chlorure	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
adénosine	Acros Organics	164040250
Albumine sérique bovine	GE Bio-sciences de la santé	SH30574.02
pénicilline/streptomycine	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Digestion tissulaire
20 mL Seringue	Global Medical	67-2020
Nylon Mesh, 250 & micro ; m	Sefar	03-250/50
Aiguilles de pipetage	Popper	7934
ciseaux fins	Fine Science Tools	14058-11
Pince à tissus	George Tiemann & Co	160-20
collagénase de type I	Worthington Biochimique	LS004196
< p> Boîtes de Pétri, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Traitées
Tubes Eppendorf, 1,5 mL	USA Scientific	1615-5500
tubes coniques, 15 mL	Nest Scientific	601052
tubes coniques, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Flacons à scintillation	Kimble	74505-20	Tissus en dés
Isolation cellulaire
Cellomètre	Nexcelom	Auto 2000
Lames de cellomètre	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Coloration de viabilité au cellomètre	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Orange acridine/Propidie Iode de dium
Anti-CD34 Perles magnétiques	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastic Pearls	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Connecteur Ring	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Cell Strainer	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Traité
4- lames bien chambrées	Corning Life Sciences	354559	Fibronectine revêtue
4 lames bien chambrées	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Verre non revêtu
Cellules endothéliales microvasculaires adipeuses humaines (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Sérum fœtal bovin (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insuline	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Préparé à l’isopropanol
96 plaques de puits	USA Scientific	1837-9600
96 plaques PCR puits	Genesee Scientific	24-300
Extraction d’ARN	Zymo Research	R2072	Kit
Synthèse de l’ADNc	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polymérase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	> Démarrage à chaud, avec tampon PCR N
solution de chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final en réaction PCR
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay <	p>Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrylamide	BIO-RAD	1610146	solution mère à 40 %
Sulfate d’ammonium	> BIO-RAD	1610700
TEMED <	p>BIO-RAD <	p>1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glycine	BIO-RAD	1610718
Sodium Dodecal Sulfate <	p>Sigma-Aldrich	L3771 <
p>EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bleu de bromophénol	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Methanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anticorps anti-AKT	Cell Signaling Technology	2920S	Souris monoclonale
Anticorps anti-pAKT	Technologie de signalisation cellulaire	9271S	Rabbit polyclonal
anticorps anti-UCP1	Abcam	p>ab10983	Rabbit polyclonal
anticorps anti-IgG de souris	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anticorps IgG anti-lapin	LI-COR	926-32211	<>p Polyclonal de chèvre, IRDye 800CW
Anticorps IgG anti-lapin	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Goat Polyclonal, TRITC
Tampon phosphate salin	Thermo-Fisher Scientific	10010049 <
>37 % Solution de formaldéhyde	Electron Microscopy Sciences	15686	4 % solution pour la fixation cellulaire
Sérum de chèvre normal	Vector Laboratories	S-1000	10 % solution bloquante
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.0.Solution de perméabilisation à 1 %
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Visualisation fluorescente cellulaire
Matrigel Membrane Matrix <	p>Corning Life Sciences	356231	Facteur de croissance réduit
DiI marqué acétylé LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484