Article de méthode

Définition d’activité réglementée Redox chaperon de Hsp33 et de cartographie des changements conformationnels sur Hsp33 à l’aide de la spectrométrie de masse d’hydrogène deutérium Exchange

DOI :

10.3791/57806

⸱

7 juin 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram, The Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une des conditions de stress plus difficiles que les organismes se rencontrent au cours de leur vie implique l’accumulation d’oxydants. Au cours du stress oxydatif, cellules s’appuient fortement sur chaperons moléculaires. Nous présentons ici les méthodes utilisées pour enquêter sur l’oxydo-réduction-anti-agrégation activité réglementée, aussi bien quant à surveiller les changements structurels régissant la fonction d’accompagnateur à l’aide de HDX-MS.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les organismes vivants doivent régulièrement faire face aux environnements fluctuantes au cours de leur cycle de vie, y compris les changements dans la température, le pH, l’accumulation des espèces réactives de l’oxygène et plus. Ces fluctuations peuvent conduire à une protéine généralisée qui se déroulent, agrégation et la mort des cellules. Par conséquent, les cellules ont évolué un réseau dynamique et contraintes spécifiques des chaperons moléculaires, qui maintiennent un proteome « sain » dans des conditions de stress. ATP-indépendante accompagnateurs constituent une classe importante de chaperons moléculaires, qui servent de molécules de défense de première ligne, protégeant contre l’agrégation des protéines en fonction de la contrainte. Une caractéristique de que ces chaperons ont en commun est leur capacité à utiliser la plasticité structurelle pour leur activation des contraintes spécifiques, la reconnaissance et la version du client mal repliée.

Dans cet article, nous nous concentrons sur l’analyse fonctionnelle et structurelle d’une telle escorte intrinsèquement désordonné, la Hsp33 bactérienne réglementées par oxydo-réduction, qui protège les protéines contre l’agrégation pendant le stress oxydatif. Nous présentons ici une panoplie de diverses techniques pour étudier l’activité chaperon redox réglementés, ainsi que pour la cartographie des changements de conformation de l’escorte, qui sous-tendent son activité. Plus précisément, les auteurs décrivent un flux de travail qui comprend la préparation des protéines entièrement réduites et entièrement oxydés, suivie d’une analyse du Chaperon anti-agrégation activité in vitro à l’aide de la dispersion de la lumière, en se concentrant sur le degré de la l’activité anti-agrégation et sa cinétique. Pour surmonter les fréquentes observations aberrantes accumulés au cours des épreuves de l’agrégation, les auteurs décrivent l’utilisation de Kfits, un nouvel outil graphique qui permet de traiter facilement des mesures cinétiques. Cet outil peut être facilement appliqué à d’autres types de mesures cinétiques pour enlever les valeurs aberrantes et des paramètres cinétiques d’ajustement. Pour établir une corrélation entre la fonction avec la structure de la protéine, nous décrivons l’installation et le flux de travail d’une technique de spectrométrie de masse structurelle, spectrométrie de masse échange hydrogène-deutérium, qui permet la cartographie des changements conformationnels sur l’escorte et substrat au cours des différentes étapes de l’activité Hsp33. La même méthode peut être appliquée aux autres interactions protéine-protéine et protéine-ligand.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellules rencontrent fréquemment une accumulation des espèces réactives de l’oxygène (ROS) produites comme sous-produits de la respiration1,2, protéine et lipide oxydation3,4et processus supplémentaires5, 6,7. Malgré le rôle bénéfique de ROS' dans divers processus biologiques comme la8,9 et réponse immunitaire10de signalisation cellulaire, un déséquilibre entre la production de ROS et sa désintoxication peut survenir, entraînant oxydatif insister sur7. Les cibles biologiques de ROS sont des protéines, des lipides et des acides nucléiques, l’oxydation qui influent sur leur structure et leur fonction. Par conséquent, l’accumulation d’oxydants cellulaires est fortement liée à un large éventail de pathologies dont le cancer9,11, inflammation12,13et vieillissement14, 15et ont été trouvés à être impliqués dans l’apparition et la progression des maladies neurodégénératives telles que de Alzheimer, Parkinson et ALS maladie16,17,18.

Protéines nouvellement synthétisées et matures sont très sensibles à l’oxydation en raison des modifications potentiellement nocifs de leurs chaînes latérales, qui façonnent la protéine structure et la fonction19,20. Par conséquent, le stress oxydatif conduit généralement à une inactivation de la protéine généralisée, le mauvais repliement et l’agrégation, aboutissant à la mort cellulaire. Une des stratégies pour faire face aux dommages potentiels d’oxydation des protéines cellulaires élégantes consiste à utiliser des chaperons redox-dépendante, qui inhibent l’agrégation des protéines généralisée, au lieu de former des complexes stables avec des protéines mal repliées client21 ,22,23. Ces chaperons de défense de première ligne sont rapidement activés par une oxydation in site (habituellement sur les résidus de cystéine) qui les convertit en des molécules anti-agrégation puissant24. Étant donné que le stress oxydatif se traduit par l’inhibition de la respiration et en baisse dans les cellulaires ATP niveaux25, canoniques chaperons dépendant de l’ATP sont moins efficaces pendant le stress oxydatif des conditions25,26 ,27. Par conséquent, activés par oxydo-réduction des chaperons ATP-indépendante jouent un rôle vital dans le maintien de l’homéostasie de protéine sur l’accumulation d’oxydants dans des bactéries et des eucaryotes (par exemple, Hsp3328 et RidA29 chez les bactéries, Get330 chez la levure, peroxiredoxins31 chez les eucaryotes). L’activité de ces chaperons dépend fortement des changements conformationnels structurelles réversibles induites par une oxydation in site qui dévoile les régions hydrophobes impliqués dans la reconnaissance des protéines mal repliées client.

Recherche du mécanisme anti-agrégation et les principes régissant la reconnaissance des protéines client par des accompagnateurs n’est pas facile en raison de la nature dynamique et hétérogènes de chaperon-substrat interactions32,33, 34,35,36,37. Cependant, chaperons stress réglementés ont la possibilité de faire progresser notre compréhension de la fonction anti-d’agrégation en raison de leur capacité à : 1) obtenir deux formes différentes de l’escorte, active (p. ex., oxydé) et inactifs (par exemple, réduite), avec l’introduction ou la suppression d’une condition de stress facilement basculer entre eux (par exemple, oxydant et réducteur), 2) ont un large éventail de substrats, 3) forment des complexes extrêmement stables avec les protéines de client qui peuvent être évaluées par différentes méthodes structurelles et 4) se concentrent uniquement sur la reconnaissance du substrat et de la libération, médiée par les changements conformationnels rédox dépendants, comme la majorité de ces chaperons n’a pas la capacité de pliage.

Ici, nous analysons l’activité bactérienne réglementés redox chaperon de Hsp33 anti-agrégation, une composante essentielle du système de défense bactérienne contre l’oxydation induite par la protéine agrégation28. Lorsque réduit, Hsp33 est une protéine liant le zinc étroitement pliée sans activité chaperon ; Toutefois, lorsqu’il est exposé au stress oxydatif, Hsp33 subit des changements de conformation qui exposent son substrat liaison régions38,39. Lors de l’oxydation, l’ion de zinc qui est fortement liée aux quatre résidus cystéine hautement conservée du domaine C-terminal est libéré40. Cela se traduit par la formation de deux ponts disulfures, un déroulement du domaine C-terminal et une déstabilisation de la région de linker adjacentes41. Les régions C-terminale et linker sont très flexibles et sont définies comme étant intrinsèquement ou partiellement désordonné. Retour aux conditions de non stress, les cystéines étant réduits et l’escorte revient à son état natif plié sans activité anti-agrégation. Le repliement de l’escorte mène à un déroulement plus loin et de déstabilisation de la protéine client lié, ce qui déclenche son transfert vers le système canonique chaperon, DnaK/J, pour le repliement38. Analyse des sites d’interaction de Hsp33 suggère que Hsp33 utilise les deux que sa charge désordonné régions ainsi que les régions hydrophobes sur l’éditeur de liens et le domaine N-terminal pour capturer pliée protéines client et empêche leur agrégation38, 42. dans l’État replié, ces régions sont masquées par le linker plié et un domaine C-terminal. Fait intéressant, la région sert comme un gardien d’état inactif et plissé de Hsp33, « sentir » le statut pliant de son côté du domaine C-terminal34. Une fois déstabilisés par mutagenèse (que ce soit par une mutation ponctuelle ou une perturbation de la séquence complète), Hsp33 est converti en un chaperon constitutivement actif quelle que soit l’état redox de ses cystéines d’oxydo-réduction sensible43.

Les protocoles présentés ici permettent de suivi d’activité Chaperon d’oxydo-réduction dépendant de Hsp33, ainsi que des changements conformationnels cartographie lors de l’activation et la liaison de protéines de client. Cette méthodologie peut être adaptée à la recherche d’autres modèles de reconnaissance d’escorte-client ainsi que les interactions protéine-protéine non-chaperon. Par ailleurs, nous présentons des protocoles pour l’établissement des chaperons entièrement réduits et oxydés qui peut être utilisé dans les études d’autres protéines redox-interrupteur, pour révéler le rôle potentiel de l’oxydation des protéines sur l’activité de la protéine.

Plus précisément, nous décrivons une procédure pour surveiller chaperon activité in vitro et définir sa spécificité de substrat sous différents types d’agrégation de protéines (chimiquement ou thermiquement induite) à l’aide de la diffraction de la lumière (LS) mesurée par un fluorospectromètre44. Au cours de l’agrégation, la lumière diffusion à 360 nm augmente rapidement en raison de la turbidité croissante. Ainsi, l’agrégation peut être surveillée de façon dépendante du temps à cette longueur d’onde. LS est une méthode rapide et sensible pour les tests d’agrégation des protéines et donc l’activité anti-agrégation d’une protéine d’intérêt en utilisant des concentrations nanomolaires, permettant la caractérisation des protéines liées à l’agrégation paramètres cinétiques sous différents conditions. En outre, le protocole de LS décrit ici ne nécessite pas d’instrumentation coûteuse et peut être facilement établi dans n’importe quel laboratoire.

Néanmoins, il est assez difficile d’obtenir des courbes cinétique « propre » et de dériver les paramètres cinétiques de la protéine de ce expériences, en raison de bruit et le grand nombre de valeurs extrêmes générées par les bulles d’air et les grands agrégats de diffusion de la lumière. Pour surmonter cet obstacle, nous présentons un nouvel outil graphique, Kfits45, utilisé pour réduire les niveaux de bruit dans les mesures cinétiques différentes, spécialement équipés pour les données cinétiques d’agrégation de protéines. Ce logiciel fournit des paramètres cinétiques préliminaires pour une évaluation rapide des résultats et permet à l’utilisateur de « nettoyer » de grandes quantités de données rapidement sans affecter ses propriétés cinétiques. Kfits est mis en œuvre en Python et disponible en open source à 45.

Une des questions difficiles sur le terrain se rapporte à la cartographie des sites d’interaction entre les chaperons et les protéines de leur client et de comprendre comment les chaperons reconnaissent un large éventail de substrats mal repliées. Cette question est encore compliquée lorsque l’étude des complexes de protéine très dynamique qui comportent intrinsèquement désordonnés chaperons et substrats sujettes à l’agrégation. Heureusement, la spectrométrie de masse structurelle a considérablement progressé ces dix dernières années et a fourni avec succès des approches utiles et des outils pour analyser la plasticité structurelle et cartographier les résidus impliqués dans la reconnaissance de protéines46, 47 , 48 , 49. nous présentons ici un tel échange hydrogène-deutérium en technique de spectrométrie de masse (HDX-MS)-qui permet la cartographie des modifications au niveau des résidus dans une conformation structurale à la modification de la protéine ou protéine/Ligand binding35, 50,51,52,53,,du5455. HDX-MS utilise l’échange continu d’hydrogènes de l’épine dorsale de deutérium, dont le taux est affecté par l’environnement chimique, accessibilité, et covalentes et non covalentes56. HDX-MS suit ces processus exchange à l’aide d’un solvant deutéré, généralement de l’eau lourde (D2O) et permet une mesure basée sur le changement de poids moléculaire après l’hydrogène à échange de deutérium. Un taux plus lent de l’échange hydrogène-deutérium peut résulter d’hydrogènes participent aux liaisons hydrogènes ou, simplement, à partir d’encombrement stérique, ce qui indique les variations locales de la structure,57. Modifications sur une liaison de ligand ou modifications post-traductionnelles peuvent aussi conduire à des différences dans l’environnement de l’hydrogène, avec une liaison résultant des différences quant à l’hydrogène-deutérium échange (HDX) Tarifs46,53.

Nous avons appliqué cette technique aux régions 1) carte Hsp33 qui rapidement se déroulent lors de l’oxydation, conduisant à l’activation de Hsp33 et 2) définissent l’interface de liaison potentielle de Hsp33 avec son substrat mal repliée pleine longueur, la citrate synthase (CS)38.

Les méthodes décrites dans ce manuscrit peuvent être appliquées à l’étude des fonctions spécifiques à une oxydo-réduction des protéines in vitro, définissant l’activité anti-agrégation et le rôle des changements structurels (le cas échéant) en fonction de la protéine. Ces méthodes peuvent être facilement adaptés aux divers systèmes biologiques et appliqués en laboratoire.

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Protocole

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1. préparation des protéines entièrement réduites et entièrement oxydés

  1. Préparation d’une protéine complètement réduite
    Remarque : Nous décrivons ici la réduction d’une protéine contenant du zinc et utiliser un ZnCl2 solution pour restaurer l’état de protéine constituée de Zn, réduite. La solution de ZnCl2 peut être remplacée ou mis au rebut. Notez que l’heure et la température du processus de réduction dépend de la stabilité des protéines et la fonction et n’est donc spécifiques par protéine.
    1. Décongeler l’échantillon de protéine sur la glace et le tourner vers le bas pour enlever agrégats. Incuber l’échantillon au moins 1,5 h à 37 ° C avec 5 mM TNT et 20 µM ZnCl2 (jusqu'à 70 % de la concentration de protéines).
      Remarque : La température à cette étape est dépendant de la protéine et doit être ajustée à la stabilité des protéines.
    2. Retirez la TNT à l’aide de colonnes de dessalement.
      Remarque : Il existe différents dessalage des colonnes disponibles. Le protocole ci-dessous décrit la procédure à l’aide de colonnes spécifiques de dessalement (voir Table des matières). Avant d’utiliser d’autres colonnes de dessalement, nous vous recommandons d’examiner leur efficacité de récupération enlèvement et protéine de TNT, puisque certaines colonnes dessalement peuvent absorber partiellement de la protéine d’intérêt.
      1. Equilibrer la colonne avec un tampon de phosphate (KPi) de potassium (40 mM, pH 7,5) en remplissant la colonne complètement de la mémoire tampon et en laissant le tampon s’écouler dehors. Répétez cette opération 2 x.
      2. Retirez le filtre de disque blanc dans la colonne en poussant vers le bas avec des pincettes doucement et de l’enlever ; Il est plus facile d’enlever pendant que la colonne est remplie avec le tampon de l’indicateur de performance clé. Remplir la colonne avec le tampon de l’indicateur de performance clé et il centrifuger à 1 000 x g pendant 3 min.
      3. Transférer la colonne dans un tube propre, ajouter l’échantillon de protéine lentement au milieu de la colonne et il centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min. La protéine exempt de DTT est maintenant dans le cheminement.
    3. Vérifier ses concentrations (par exemple, utiliser un spectromètre UV/Vis) et mesurer l’absorbance à 280 nm. Calculer la concentration de la protéine à l’aide de la Loi de Beer.
    4. Distribuer la moitié des échantillons de protéines en aliquotes. Incuber les aliquotes dans des conditions anaérobies (par exemple, en utilisant une chambre anaérobie) pendant 20 min pour une élimination complète de l’oxygène. Sceller les tubes avec un film plastique et stocker les échantillons à-20 ° C ou à-80 ° C, en fonction de la protéine.
      Remarque : Au lieu d’utiliser la chambre anaérobie, les tubes peuvent également être flashées avec le gaz argon pour éliminer l’oxygène.
  2. Préparation d’une protéine complètement oxydée
    Remarque : Il est recommandé de préparer des échantillons de protéines oxydées de protéines entièrement réduites (décrits précédemment). Cela permettra de réduire l’hétérogénéité dans les États d’oxydation des cystéines. Il est possible d’utiliser différents réactifs oxydants ; ici, nous nous concentrons sur le peroxyde d’hydrogène (H2O2).
    ATTENTION : Éviter une oxydation excessive car elle peut conduire à ponts disulfures intramoléculaires indésirables et oxydation irréversible des différents acides aminés, y compris la cystéine, méthionine, tyrosine et autres.
    1. À l’échantillon de protéines restantes, ajoutez 5 mM H2O2 (fraîchement diluée) et il incuber pendant 3 h à 40 ° C en agitant.
      Remarque : La température à cette étape est dépendant de la protéine et doit être ajustée à la stabilité des protéines.
    2. Equilibrer la colonne avec le tampon de l’indicateur de performance clé (40 mM, pH 7,5) en remplissant la colonne complètement de la mémoire tampon et en laissant le tampon s’écouler dehors. Répétez cette opération 2 x.
    3. Retirez le filtre de disque blanc dans la colonne en poussant vers le bas avec des pincettes doucement et de l’enlever ; Il est plus facile d’enlever pendant que la colonne est remplie avec le tampon de l’indicateur de performance clé.
    4. Remplir la colonne avec le tampon de l’indicateur de performance clé et il centrifuger à 1 000 x g pendant 3 min.
    5. Transférer la colonne dans un tube propre, ajouter l’échantillon de protéines oxydées lentement au milieu de la colonne et il centrifuger à 1 000 x g pendant 2 min ; la protéine oxydée est maintenant dans le cheminement.
    6. Vérifier les concentrations de protéine comme au point 1.2.5, diviser les protéines oxydées en aliquotes et stockez-les à-20 ° C ou -80 ° C, dépendant de la protéine.

2. dosage de l’agrégation de diffusion de la lumière

Remarque : Toutes les concentrations dans cet essai sont spécifiques à chaperon et substrat et doivent être étalonnées. Tous les tampons doivent être 0,22 µm-filtré, car il est extrêmement important que les tampons sont exempts de toute particule ou bulles d’air et les cuvettes sont propres et sans poussière. Il est très important d’utiliser un agitateur placé dans la cuve de quartz. Vérifier l’agitateur de différentes tailles et formes afin de garantir un mélange efficace de l’ensemble de la solution sans produire de bulles d’air indésirables. En outre, flouorospectrometers différents sont disponibles dans les laboratoires et les installations. Ici, un fluorospectromètre spécifique (voir le Tableau des matériaux) a été utilisé. Différents instruments ont une sensibilité diverse, vitesse de mesure et les paramètres de l’échantillonneur. Par conséquent, les paramètres de mesure exacte (par exemple, largeur de bande d’émission et d’excitation, sensibilité et autres) doivent être optimisées en utilisant une protéine connue sujettes à l’agrégation et ses conditions correspondantes. L’utilisation de la citrate synthase (CS) et/ou de la luciférase comme substrat initial à des concentrations nanomolaires est recommandée.

  1. Analyse chimique de l’agrégation
    1. Préparer le substrat dénaturé par incubation 12 µM CS nuit à 40 mM HEPES (pH 7.5) et 4,5 M GdnCl. Afin de préserver le pH, dissoudre le GdnCl dans le 40 mM HEPES (pH 7.5).
    2. Ouvrez le logiciel fluorospectromètre et aller à la mesure du temps de parcours. Définir les paramètres : température : 25 ° C ; Λem : 360 ; Bande passante em : 5 nm ; Λex: 360 ; Ex bande passante : 2,5 nm ; et données intervalle : 0,5 s.
    3. Préparation des échantillons en ajoutant 1 600 µL de 40 mM HEPES à une cuvette de quartz. Introduisez la cuve dans le porte-échantillon et laisser l’échantillon à la température désirée.
    4. Définissez le brassage à 600 tr/min et commencer la mesure jusqu'à ce qu’une ligne de base est établie. Garder l’agitation sur la mesure entière.
    5. Pour mesurer l’agrégation CS en l’absence d’un chaperon, 120 s, dans la mesure, ajouter (doucement mais rapidement) 10 µL de CS dénaturé (concentration finale de 75 nM). Continuer la mesure pour 1 200 s.
    6. Pour mesurer l’agrégation CS en présence de Hsp33, à 60 s dans la mesure, ajouter Hsp33 (concentration finale de 300 nM). Après un supplémentaire de 60 s, ajouter 10 µL de CS dénaturé (concentration finale de 75 nM). Continuer la mesure pour 1 200 s.
      Remarque : Lorsque vous ajoutez le substrat ou le chaperon, afin d’éviter l’insertion de bulles, utiliser une pipette de 10 µL.
  2. Dosage thermique agrégation
    Remarque : La température pour le dosage d’agrégation thermique dépend de la stabilité des protéines et devrait être ajustée indépendamment à chaque protéine.
    1. Ouvrez le logiciel fluorospectromètre et aller à la mesure du temps de parcours. Réglez les paramètres comme suit : température : 43 ° C ; Λem : 360 ; Largeur de bande d’émission : 5 nm ; Λex: 360 ; Bande passante excitation : 2,5 nm ; et données intervalle : 0,5 s.
    2. Préparation des échantillons en ajoutant 1 600 µL de préchauffé 40 mM HEPES à une cuvette de quartz. Introduisez la cuve dans le porte-échantillon et laisser l’échantillon atteindre 43 ° C.
    3. Définissez le brassage à 600 tr/min et commencer la mesure jusqu'à ce qu’une ligne de base est établie. Garder l’agitation sur la mesure entière.
    4. Pour mesurer l’agrégation CS en l’absence d’un chaperon, 120 s, dans la mesure, ajouter doucement CS (concentration finale de 125 nM) et continuer à mesurer pour 1 200 s.
    5. Pour mesurer l’agrégation CS en présence de Hsp33, à 60 s dans la mesure, ajouter Hsp33 (concentration finale de 600 nM). Après un supplémentaire de 60 s, ajouter CS (concentration finale de 125 nM). Continuer la mesure pour 1 200 s.
      Remarque : Lorsque vous ajoutez le substrat ou le chaperon, éviter l’insertion de bulles.
  3. Suppression de bruit et d’analyse de données par Kfits
    Remarque : Kfits est disponible à l’utilisation de Kfits a été décrit antérieurement à Rimon et al. 45
    1. Télécharger le fichier de données.
      NOTE : L’entrée est les résultats bruts des mesures de diffusion de la lumière dans un format textuel de séparées par des virgules ou des tabulations.
    2. Pour supprimer n’importe quel bruit, choisissez Paramètres d’analyse. Utilisation automatique meilleur modèle (recommandé), marquent l’indicateur de bruit est toujours au-dessus de signal .
    3. Supprimez manuellement les évidentes aberrantes en utilisant les lignes vertes et rouges et réglables ; Cette étape va filtrer le bruit au-dessus de la ligne verte et au-dessous de la ligne rouge.
    4. Définir la planification initiale et la courbe ajustée. Après avoir appliqué le seuil de bruit, télécharger les données traitées.

3. hydrogène-deutérium échange spectrométrie de masse

  1. Préparation des tampons et des échantillons de protéine (complexe de Hsp33 et Hsp33-CS)
    1. Diluer les échantillons de protéine à une concentration finale de 1 mg/mL dans un tampon 25 mM Tris-HCl pH 7.5 et transférez-les à 1,5 mL flacons.
    2. Préparer le substrat protéique des échantillons complexes en incubant Hsp33 avec CS à un ratio de 1 : 1.5 à 43 ° C.
      1. Ajouter la CS de manière progressive pour éviter toute agrégation rapide et assurer une liaison fructueuse entre le Hsp33 et le CS thermiquement déplié.
      2. Utilisez au moins quatre étapes (c'est-à-dire, à chaque fois ajouter un quart du volume final) et incuber les échantillons pendant 15 min après chaque addition pour protéger le CS par Hsp33.
    3. Supprimer n’importe quel agrégat par une centrifugation de 30 min à 16 000 x g à 4 ° C.
      NOTE : Nouveaux complexes de protéine substrat doivent être préparées fraîche. Ajout du substrat convient peu à peu ; dans le cas contraire, l’agrégation se produit. Les concentrations de substrat, température et substrat sont protéines spécifiques.
    4. Préparer un buffer de H (25 mM Tris-HCl, pH 7,5), qui sert de deutération contrôle, et un D (25 mM Tris-DCl, pH 7.09), qui est la mémoire tampon de deutération. Également préparer un tampon trempe fraîche (150 mM 0,1 % TCEP, 3 M GdnCl, l’acide formique).
      Remarque : Le tampon trempe doit être optimisé pour la protéine d’intérêt afin d’obtenir la couverture de sa séquence maximale après la digestion pepsique.
    5. Transférer tous les tampons et les échantillons dans des flacons et placez-les dans des bacs appropriés. Maintenez les tampons H et D à 25 ° C (bac à 25 ° C) ; d’autre part, tenir les échantillons et le tampon trempe à 0 - 2 ° C (plateau de 0 ° C). Placer les échantillons dans des insertions de verre 150 µL (voir la Table des matières) tout d’abord, puis les transférer dans des flacons.
  2. Préparation de l’instrument
    Remarque : Le spectromètre de masse est livré avec deux logiciels d’accompagnement : l’un commande les pompes, et l’autre contrôle le spectromètre de masse (voir la Table des matières). Les prochaines étapes seront décrites à l’aide de ces deux logiciels.
    1. Allumez manuellement toutes les unités de refroidissement. Une fois que tous les systèmes de refroidissement atteignent leur température de cible, basculer manuellement sur la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) et pompes de chargement.
      Remarque : Dans notre cas, il s’agit de deux bains de refroidissement et une glacière thermo-électrique (qui contient les colonnes analytiques et piège). Un climatiseur refroidit le plateau à 0 ° C, tandis que l’autre garde le plateau à 25 ° C ; la température de la glacière thermo-électrique est 1-2 ° C.
    2. Ouvrez le logiciel qui contrôle les deux pompes, ainsi que le logiciel qui contrôle le spectromètre de masse ; Assurez-vous que la SP est en veille.
    3. Débrancher la vanne HPLC de la source de MS et laver le système tout d’abord avec une solution de « nettoyant triple » (1 % d’acide formique, 33 % d’acétonitrile, isopropanol de 33 %, 33 % de méthanol), puis avec un tampon B (80 % d’acétonitrile, 0,1 % d’acide formique) et enfin avec tampon A (0,1 % l’acide formique, pH 2.25), puis insérer la colonne de la pepsine dans le système. Si vous modifiez des tampons, veillez à purger les deux pompes avant de procéder.
    4. S’assurer que le débit pour les deux pompes est de 0,1 mL/min et la pression est stable.
    5. Après avoir lavé le système avec une fluidité et une pression constante, insérez la prise HPLC dans la source de MS et allumez la MS.
  3. Paramètres du spectromètre de masse
    1. La valeur de l’ionisation de peptide à ionisation par électrospray (ESI) à 175 ° C, le débit de gaz de gaine à 17 ans, la lueur de gaz à 2 et la tension de pulvérisation à 4,5 kV (supplémentaire Figure 1).
    2. Configurez les paramètres comme suit pour les échantillons non deutéré.
      1. Réglez les paramètres : plage de balayage m/z pour 300-1500 ; Résolution à 70 000 ; Cible de contrôle automatique de gain (AGC) à 106; et le temps d’injection de Maximum (IT) à 100 ms.
        Remarque : Les 5 ions plus intenses avec les États de frais entre + 2 et + 6 (leur intensité supérieure à 1,3 x 104) et une fenêtre dynamique de 30 en seront isolée.
      2. Effectuer la fragmentation de l’ion en énergie plus élevée la dissociation par collision (HCD) dans la cellule de collision multiple avec l’énergie de collision normalisée (RCE) égal à 28. Détecter des ions fragments par tandem MS avec une résolution de 35 000, cible AGC de 105, maximale à 60 ms et une fenêtre d’isolement de 2,0 m/z.
    3. Pour les échantillons deutérés, employer MS1 seulement avec une résolution supérieure de 140 000 et avec des paramètres semblables par ailleurs.
  4. L’expérience en cours d’exécution
    1. Définissez les plateaux de la manière suivante.
      1. Placer un tampon H et D en bac à 25 ° C, puis placez les échantillons et le tampon trempe dans le bac de 0 ° C.
      2. L’endroit X vider flacons, alignés dans les deux plateaux, où X = le nombre d’échantillons x le nombre de points dans le temps.
        Remarque : Dans la barre des 25 ° C, les flacons vides servent de flacons à réaction, et dans le bac de 0 ° C, ils servent de trempe des flacons.
      3. Chacun des flacons vides contient un insert en verre vide ; jeter et remplacer ladite insertion entre les expériences.
        Remarque : Afin de lancer l’expérience HDX la manière la plus efficace et moins fastidieux, un logiciel qui permet aux échantillons d’être exécutés simultanément (complémentaire Figure 2) a été utilisé. Les prochaines étapes seront décrites à l’aide de ce logiciel.
    2. Ouvrez le logiciel. Définir les paramètres du programme à exécuter ce qui suit.
      1. Incuber chaque échantillon (5 µL) avec 45 µL de tampon D pendant plusieurs minutes, selon les points de temps choisis (par exemple, 1, 3, 18, 40 et 100 min) à 25 ° C. Incuber l’échantillon non deutéré 45 µL de tampon H au lieu de cela.
      2. Immédiatement après l’incubation, mélanger 50 µL de protéine deutéré dans 50 µL de tampon trempe glacée et les injecter dans une colonne de pepsine immobilisé (20 mm de longueur, 2,0 mm de diamètre).
      3. Éluer des peptides de la colonne de la pepsine dans la colonne avant de laver avec tampons A pendant 6 min à raison de 50 µL/min. Gardez tampons A dans la glacière thermo-électrique à 0 ° C.
      4. Éluer les peptides de la colonne avant dans la colonne analytique C18 (colonne C18, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, maintenu à 0 ° C) et séparez-les en appliquant un dégradé linéaire d’acétonitrile à 100 µL/min. exécuter le gradient d’acétonitrile utilisant l’acétonitrile 100 % tampon B : min 7 à 2 %, 7 min à 10-30 %, 2,5 min à 30-90 %, 1,5 min à 90 %, pente rapide pendant 1 min à 90 à 8 % et enfin équilibrer la colonne pendant 4 min à 2 %.
    3. Construire une séquence en cours d’exécution (voir supplémentaires Figure 2) : entrer tous les points dans le temps, noms de l’échantillon et emplacements dans les plateaux, ainsi que les noms de tampon et emplacements.
      Remarque : Le logiciel permet l’alignement de tous les temps en cours d’exécution différents dans un programme qui exécute plusieurs échantillons à la fois, efficacement diminué une fois en cours d’exécution.
  5. Analyse des données
    NOTE : Nous travaillons avec plusieurs logiciels dans le processus d’analyse des données, y compris Proteome découvreur et MaxQuant (logiciel libre) pour l’identification de peptide et d’analyse de couverture de la séquence, mais aussi workbench HDX, un logiciel gratuit qui permet l’analyse de l’incorporation de deutérium dans les protéines et une comparaison des taux de HDX entre différentes séries d’expériences. Les prochaines étapes seront décrites à l’aide de ces logiciels.
    1. Analyser la couverture de peptide de l’échantillon en exécutant les échantillons de contrôle non deutéré via le logiciel (supplémentaire Figure 3). Configurer le logiciel en utilisant les paramètres suivants.
      1. Utilisez la méthode Sequest HT avec un No-enzyme (non spécifique) se fendent. Recherche de peptides d’acides aminés 4-144 avec une tolérance de masse de 7 ppm et 0,5 Da pour du précurseur l’ion et fragment. Permettant une oxydation de méthionine dynamique.
      2. Créer une base de données pour la protéine, à travers lequel le logiciel peut déterminer la couverture de peptide. Exporter les peptides identifiés en format textuel.
    2. Analyser les résultats deutérées utilisant le HDX workbench logiciel libre58.
      1. Ouvrez l’éditeur de protéine et définir la protéine en insérant le fichier protéine séquence et peptide couverture.
      2. Ensuite, ouvrez l’éditeur de configuration expérimenter Assistant et entrez toutes les entrées ont demandé.
        NOTE : Le programme nécessite le nombre d’échantillons, le nombre de points dans le temps, le nombre de répétitions, la valeur du pH des tampons et la température.
      3. Enfin, les paramètres concernant le spectromètre de masse utilisé, après quoi le programme génère une liste de peptides détectés d’entrée.
        Remarque : Le logiciel détecte les peptides « HDX », inspecte les grappes de l’isotope et montre une visualisation claire de deutération dans les échantillons.
  6. Présentation des données
    1. Les régions avec une absorption de deutération retenue sur la structure en utilisant le logiciel PyMol ou tout autre logiciel de visualisation de l’étiquette.
    2. Introduire les niveaux d’absorption de deutérium au lieu des valeurs de B-facteur.
      Remarque : Un didacticiel de base peut être trouvé à https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les deux méthodes présentées permettent de suivre l’activité cinétique et la dynamique des interactions entre un chaperon et son substrat. En outre, le protocole de réduction-oxydation permet la préparation d’un chaperon entièrement réduite et entièrement oxydé, ce qui donne une compréhension plus approfondie du mécanisme d’activation de chaperons désordonnées rédox dépendants.

Tout d’abord, nous avons utilisé la diffusion de la...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cet article, nous avons fourni des protocoles pour l’analyse de l’activité Chaperon d’oxydo-réduction-dépendante et la caractérisation des changements structurels sur la liaison d’une protéine de client. Ce sont des méthodes complémentaires pour définir les potentiels complexes chaperon-substrat et analyser des sites potentiels d’interaction.

Ici, nous avons appliqué ces protocoles pour la caractérisation d’un complexe entre l’escorte d’oxydo-réduction réglementées Hsp33 avec un substrat ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs sont reconnaissants au Meytal Radzinski pour ses discussions utiles et critique de lecture de l’article et à Patrick Griffin et les membres de son laboratoire pour leur assistance illimitée tout en établissant la plateforme d’analyse HDX. Les auteurs sont reconnaissants à la Fondation allemande-Israël (I-2332-1149.9/2012), la Fondation binationale de la Science (2015056), la subvention d’intégration Marie-Curie (618806), la Fondation des sciences Israël (1765/13 et 2629/16) et le Human Frontier Science Programme (CDA00064/2014) pour leur soutien financier.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chemicals, Réactifs
Acetonitrile HPLC plusSigma Aldrich34998-2.5Lsolvant
Acide formique Optima LC/MSFisher ChemicalsA117-50Supplément de solvant
Alcool isopropylique, grade HPLCFisher ChemicalsP750717solvant
MéthanolFisher ChemicalsA456-212solvant
Tris(hydroxyméthyl)aminométhaneSigma Aldrich252859tampon
Acide trifluoroacétiqueSigma Aldrich76-05-1solvant
Eau pour HPLCSigma Aldrich270733-2.5L-Msolvant
ZnCl2, Chlorure de zincMerckB0755416 308réactif
DTTgoldbio27565-41-9agent réducteur
mini piège G-25 colonnes GE healthcareGE healthcare29-9180-07colonne de dessalage
Potassium PhosphateÉtats-Unis Biochemical Corporation20274
tampon Peroxyde d’hydrogène 30 % MerckK46809910526 agent oxydant
citrate synthasesigma aldrichC3260substrat
HEPES sans acidesigma aldrich7365-45-9tampon
Gndclsigma aldrichG3272-500Gdénaturant
chlorure de deutériumsigma aldrich543047-10Gtampon
oxyde de deutérium 99 %sigma aldrich151882-100Gsolvant
TCEPbioworld42000058-2agent
réducteurMicro-insert de 150 uL avec intérieur de mandrin et Pieds en polymère, 29*5mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Flacon transparent à filetage court Filetage de 9mm, 11.6*32mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
cuvette à quartzHellma 101-QS
strong>Instruments
Jasco FP-8500 FluorospectromètreJasco
Thermomixeur ComfortEppendorf13058/0
Heraeus Megafuge 16R, pH-mètre de paillasseCentrifugeuseThermo Scientific
, PB-11 sartoriusSartorius13119/0
AffiPro Colonne de Pepsine immobilisée (20 mm de longueur, 2,0 mm de diamètre).AffiPro
Waters (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å ;, 1.7um, 2.1mmx5mm)
C18 (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å ;, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Chambre anaérobie vinyle avec porte de sasCOY
Q-exactive-orbitrap spectromètre de masseThermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - système robotique pour la manipulation d’échantillons HDXSystème PALhttps://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, pompe XRSThermo Scientific
Dionex AXP-MS pompe auxiliaireThermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits : Données d’agrégation d’ajustementhttp://kfits.reichmannlab.com/fitter/
logiciel Thermo Scientific Xcaliburhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
interface de réglage Q Exactive MS Series (Tune)https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Logiciel Chronos (Axel Semrau http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
logiciel Proteome Discoverer V1.4https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
logiciel HDX workbenchhttp://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
Solution de <Pré-colonne Colonne analytique Waters

Références

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Activit chaperonne de Hsp33essai de diffusion de la lumi reanalyse Kfitsagr gation de la citrate synthaseconditions de stress oxydatifchangements conformationnels des prot inesconfiguration de la spectrom trie de masseactivit anti agr gation

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