Article de méthode

Essai de co-immunoprécipitation des protéines nucléaires endogènes de cellules cultivées dans des Conditions hypoxiques

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DOI :

10.3791/57836

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2 août 2018

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1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, 3The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 4Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, 5Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un protocole co-immunoprécipitation pour étudier les interactions protéine-protéine entre les protéines nucléaires endogènes dans des conditions hypoxiques. Cette méthode convient pour la démonstration des interactions entre les facteurs de transcription et les corégulateurs transcriptionnels à l’hypoxie.

Résumé

Faibles teneurs en oxygène (hypoxie) déclenchent une variété de réponses adaptatives avec le Hypoxia-inducible factor complexe agissant comme un maître régulateur 1 (HIF-1). HIF-1 se compose d’une sous-unité α oxygène régulée des hétérodimères (HIF-1 bis) et exprimé constitutivement sous-unité β (HIF-1β) également connu sous le nom aryl hydrocarbon receptor nucléaire translocator (ARNT), régulation des gènes impliqués dans divers processus, y compris l’angiogenèse , l’érythropoïèse et la glycolyse. L’identification des protéines qui interagissent HIF-1 est essentielle à la compréhension de la voie de signalisation de l’hypoxie. Sans compter que la régulation de la stabilité de l’HIF-1α, hypoxie déclenche également la translocation nucléaire de nombreux facteurs de transcription dont HIF-1α et ARNT. Notamment, la plupart des méthodes actuelles utilisées pour étudier ces interactions protéine-protéine (IPP) sont basés sur les systèmes où les taux de protéines sont artificiellement augmentés par la surexpression de la protéine. Surexpression de la protéine souvent conduit à des résultats non physiologiques dus aux artefacts temporelles et spatiales. Nous décrivons ici une co-immunoprécipitation mis à jour le protocole après le traitement de l’hypoxie en utilisant des protéines nucléaires endogènes et comme une preuve de concept, de montrer l’interaction entre HIF-1α et ARNT. Dans le présent protocole, les cellules hypoxiques ont été récoltés dans des conditions hypoxiques et tampon de lavage de la Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (SPD) a également été préalablement équilibré à des conditions hypoxiques avant son utilisation afin d’atténuer la dégradation des protéines ou complexes de protéines dissociation durant la réoxygénation. En outre, les fractions nucléaires ont été par la suite extraites de façon à se concentrer et de stabiliser les protéines nucléaires endogènes et d’éviter de possibles résultats fallacieux souvent vu au cours de la surexpression de la protéine. Ce protocole peut être utilisé pour démontrer endogènes et natives des interactions entre les facteurs de transcription et les corégulateurs transcriptionnels dans des conditions hypoxiques.

Introduction

L’hypoxie se produit lorsque l’oxygène insuffisant est fournie pour les cellules et les tissus du corps. Il joue un rôle critique dans divers processus physiologiques et pathologiques tels que la différenciation des cellules souches, l’inflammation et le cancer1,2. Facteurs inductibles par l’hypoxie (HIFs) fonctionnent comme des hétérodimères composé d’une sous-unité α réglementés d’oxygène et une sous-unité β constitutivement exprimé également connu sous le nom de ARNT3. Trois isoformes des sous-unités HIF-α (HIF-1α, HIF-2α et HIF-3α) et trois sous-unités β HIF (ARNT/HIF-1β, ARNT2 et ARNT3) ont été identifiées à ce jour. HIF-1α et ARNT sont exprimés ubiquitaire, alors que HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 et ARNT3 ont plus restreinte de modèles expression4. La complexe de la protéine HIF-1 est le régulateur essentiel de la réponse de l’hypoxie. Dans des conditions hypoxiques, HIF-1α devient stabilisé, puis translocation vers le noyau et se dimérise avec ARNT5. Par la suite, ce complexe se lie à des nucléotides spécifiques appelés éléments sensibles de l’hypoxie (HREs) et régule l’expression de gènes cibles impliqués dans divers processus, y compris de l’angiogenèse, l’érythropoïèse et la glycolyse6. En plus de cette réponse « canonique », la voie de signalisation de l’hypoxie est également connue pour la diaphonie avec plusieurs réponse cellulaire signalisation tels que Notch et nucléaire facteur-kappa B (NF-κB)7,8,,9.

L’identification des protéines qui interagissent roman HIF-1 est importante pour une meilleure compréhension de la voie de signalisation de l’hypoxie. Contrairement à l’ARNT, ce qui est insensible aux niveaux d’oxygène et constitutivement exprimé, des niveaux de protéine HIF-1α sont étroitement contrôlée par les niveaux d’oxygène cellulaire. À la normoxie (21 % d’oxygène), HIF-1α protéines sont rapidement dégradées10,11. La courte demi-vie de HIF-1α à normoxie présente des défis techniques spécifiques pour la détection de la protéine d’extraits cellulaires, ainsi que pour l’identification des protéines d’HIF-1α-interaction. En outre, plusieurs facteurs de transcription, dont celles du complexe HIF-1 translocation dans le noyau sous conditions hypoxiques12,13,14. La plupart des méthodes actuelles utilisées pour les études PPI est effectuée au moyen de la surexpression de protéines non physiologiques. La surexpression de cette protéine a été signalée pour causer des défauts cellulaires différents par le biais de plusieurs mécanismes, y compris la surcharge de ressource, déséquilibre stoechiométrique, interactions promiscuitées et voie modulation15,16. En ce qui concerne les études de l’IPP, la surexpression de protéines peut conduire à faux positif, ou même faussement négatif, des résultats selon les propriétés de la protéine et la fonction des protéines surexprimées. Par conséquent, les méthodes actuelles pour les études PPI devront être modifiées afin de révéler les IPP physiologiquement pertinents dans des conditions hypoxiques. Nous avons déjà démontré l’interaction entre HIF-1 et le facteur de transcription famille de Ets la protéine liant le GA (GABP) dans les cellules hypoxiques P19, qui contribue à la réponse du promoteur Hes1 à hypoxie17. Nous décrivons ici un protocole co-immunoprécipitation pour étudier les IPP entre protéines nucléaires endogènes dans des conditions hypoxiques. L’interaction entre HIF-1α et ARNT est présentée comme une preuve de concept. Ce protocole est conçu pour démontrer les interactions entre les facteurs de transcription et les corégulateurs transcriptionnels dans des conditions hypoxiques, incluant mais non limité à l’identification des protéines qui interagissent HIF-1.

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Protocole

Cette section de protocole, qui utilise des reins embryonnaires humaines 293 a cell (HEK293A), s conforme aux lignes directrices du Comité d’éthique de la recherche humaine à l’Université technologique de Nanyang, Singapour.

1. l’induction de l’hypoxie dans les cellules de HEK293A

  1. Préparer quatre plats de 10 cm et de semences de 3 – 5 x 106 HEK293A cellules par plat dans 10 mL Dulbecco aigle modifié (DMEM, 4,5 g/L de glucose) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 2 mM de L-glutamine, pyruvate de sodium 110 mg/L, 100 U/mL de pénicilline et 100 mg / mL de streptomycine. Culture de cellules dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.
    NOTE : Cellule ensemencement devrait se faire sous une hotte de sécurité biologique (BSC). Les surfaces de toutes les matières à placer dans la GCS doivent être essuyés avec l’éthanol à 70 %.
  2. 24h après le semis, lorsque les cellules ont atteint 80 à 90 % confluence, mettre deux plats dans la subchamber de l’hypoxie dans la boîte à gants de l’incubateur (voir Table des matières) avec 1 % d’O2 et de 5 % de CO2 à 37 ° C et de garder les deux autres plats à la normoxie (21 % O 2, 5 % de CO2 à 37 ° C) pendant 4 h. Utilisez un jeu de normoxique et hypoxiques cellules pour évaluer le traitement de l’hypoxie par western blot et utiliser l’autre jeu de cellules pour les expériences de co-immunoprécipitation.
    Remarque : Les niveaux d’oxygène peuvent être réglés à 0 – 5 % et la durée du traitement hypoxie peut varier selon le type de cellule et étudier l’objectif.

2. cellulaire et nucléaire Extraction

NOTE : Voir le tableau 1 pour plus d’informations sur les tampons utilisés dans le présent protocole.

  1. Récolter les cellules de contrôle normoxie.
    1. Retirez le support de culture par aspiration et rincer les cellules 10 ml SPD (PH 7.0 – 7.2) à l’aide d’une pipette 10 mL.
      Remarque : Ne pas toucher la monocouche de cellules à l’aide de la pipette. Pendant le lavage, Pipetez doucement le SPD tomber le mur de la plaque de culture cellulaire afin d’éviter la perte de cellules.
    2. Pipetter 5 mL glacee SPD dans la plaque et raclez les cellules sur la surface de la plaque dans du PBS glacée avec un grattoir de cellules.
    3. Transférer la suspension cellulaire dans les tubes coniques 15 mL et rester sur la glace.
  2. Récolter les cellules cultivées dans des conditions hypoxiques.
    1. Equilibrer avant le SPD à des conditions d’hypoxie en plaçant une découvert 1mL 00 expérience réactif bouteille en verre remplie de SPD dans la subchamber de l’hypoxie (1 % O2 et 5 % de CO2 à 37 ° C) pendant 24 h à l’avance.
    2. Environ 1 h avant la récolte des cellules de l’hypoxie traitée, placer une glacière contenant de la glace dans la chambre de traitement de la boîte à gants, qui a été équilibrée à 1 % O2 et de 5 % de CO2. Transférer le flacon contenant le SPD hypoxique préalablement équilibré de l’hypoxie subchamber à la chambre de traitement et placez-le sur la glace.
    3. 4 h après le traitement de l’hypoxie, transférer les cellules de l’hypoxie subchamber à la chambre de traitement qui a été préalablement équilibrée à 1 % O2 et de 5 % de CO2.
    4. Retirez le support de culture par aspiration et rincer les cellules une fois 10 ml pipette glacee SPD hypoxique préalablement équilibré avec un 10 mL.
    5. Ajouter 5 mL glacee SPD préalablement équilibré avec un 5 mL pipette et déloger les cellules en grattant avec un grattoir de cellules.
    6. Inclinaison de la plaque de culture cellulaire et de recueillir les cellules individuelles à l’aide d’une pipette 10 mL. Transférer la suspension cellulaire au SPD dans les tubes coniques 15 mL et rester sur la glace.
    7. Ouvrez la porte entre les chambres de traitement et de la mémoire tampon de la boîte à gants, qui ont été préalablement équilibrés à 1 % O2 et 5 % de CO2. Transférer les tubes coniques 15 mL sur glace contenant des cellules de la chambre de traitement hypoxie traité devant la chambre de la mémoire tampon. Ouvrir la porte de la chambre de la mémoire tampon et enlèvera les cellules complètement de la boîte à gants.
  3. Fois les cellules normoxiques de 2,1 et les cellules hypoxiques de 2,2 à pellets par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Préparer la cellule entière extraits.
    1. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 500 µL de radio glacee immunoprécipitation (RIPA) lyse tampon contenant 50 mM Trisaminomethane chlorhydrate (Tris-HCl) pH 8,0, 150 mM de chlorure de sodium (NaCl), 1 % tergitol-type NP-40 (NP-40), désoxycholate de sodium 0,5 %, et 0,1 % dodécylsulfate de sodium (SDS), additionné de 1 x cocktail inhibiteur de la protéase (voir Table des matières) en pipettant également, les granules cellulaires et descendre plusieurs fois.
    2. Transférer les lysats cellulaires dans des tubes de microcentrifuge 1,5 mL neufs et rester sur la glace pendant 30 min avec agitation occasionnelle.
    3. Centrifuger les lysats cellulaires à 13 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
    4. Recueillir le surnageant, aliquote 50 µL de surnageant dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et conserver à-80 ° C.
  5. Préparer les extraits nucléaires en utilisant une extraction nucléaire nécessaire (voir la Table des matières).
    1. Resuspendre doucement les boulettes de cellule dans 500 µL de NL de tampon de lyse additionné de 1 inhibiteur de la protéase cocktail et 0,1 M le dithiothréitol (DTT) en pipettant également, les granules cellulaires et descendre plusieurs fois.
    2. Ajouter 25 µL de solution détergente NP à la suspension cellulaire et vortexer pendant 10 s à vitesse maximale.
    3. Centrifuger à 10 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    4. Recueillir le liquide surnageant (extraits cytoplasmiques), aliquote 50µl de surnageant dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et stocker à-80 ° C.
    5. Resuspendre le culot contenant des noyaux des cellules en 500 µL de tampon de lyse NL additionné de 1 inhibiteur de la protéase cocktail et 0,1 M DTT au Vortex pendant 5 s à vitesse maximale.
    6. Centrifuger à 10 000 g pendant 5 min à 4 ° C et sauver le culot nucléaire.
    7. Resuspendre le culot nucléaire dans 50 µL de NX1 de tampon d’Extraction additionné de 1 x inhibiteur de la protéase cocktail en pipettant également, le culot de monter et descendre plusieurs fois.
    8. Incuber pendant 30 min sur glace, vortex pour 10 s toutes les 5 min à vitesse maximale.
    9. Centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
  6. Dessalement des extraits nucléaires.
    1. Recueillir le surnageant à l’étape 2.5.9 et transfert dans les appareils de dialyse mini avec un volume maximum de 100 µL par unité.
    2. Boucher les appareils de dialyse mini et placez-les dans un dispositif de flottaison.
    3. Mettre le dispositif de flottaison dans un bécher de 500 mL de tampon de dialyse préalablement réfrigérées (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 20 % de glycérol, le chlorure de potassium (KCl) 100 mM, 0,2 mM l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,2 le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) mM et 0,5 mM TNT) et laisser incuber 30 min à 4 ° C sous agitation douce.
      ATTENTION : Le PMSF est dangereux. Évitez tout contact direct avec la peau ou par inhalation.
    4. Recueillir les échantillons du coin de l’appareils de dialyse mini et transférer dans nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
    5. Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C, aliquote 25 µL de chaque surnageant dans un tube de microtubes de 1,5 mL et conserver à-80 ° C.

3. evaluation du traitement de l’hypoxie par détection de l’Expression de la protéine et la localisation subcellulaire de HIF-1α

  1. Déterminer la concentration de protéine des cellules entières ou des extraits nucléaires/cytoplasmiques utilisant l’analyse de la microplaque de bicinchoninic acide (BCA) protéine test kit selon les instructions de fabricant18.
  2. Diluer les lysats cellulaires dans 1 x Laemmli solution tampon contenant 5 % de 2-mercaptoéthanol et faites bouillir à 95 ° C pendant 5 min.
    ATTENTION : Ne pas toucher la surface du bloc chauffant, car il peut causer des brûlures.
  3. Séparer les protéines par électrophorèse en gel de polyacrylamide sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE).
    1. Charger des quantités égales de protéines (25 µg) dans chaque puits d’un SDS-PAGE préfabriqué gradient gels (4 – 20 %), ainsi que 3 µL du marqueur de poids moléculaire.
    2. Exécutez le gel en tampon contenant 2,5 mM Tris, glycine 19,2 mM, SDS de 0,01 %, PH8.3 pendant 30 min à 200 volts.
  4. Transfert des protéines à partir du gel à la membrane de nitrocellulose.
    1. Monter le sandwich de transfert (papier filtre-gel-membrane-filtre papier) avec le gel sur le côté de l’anode et la membrane du côté de la cathode de la cassette.
    2. Placez la cassette dans le réservoir de transfert rempli avec tampon de transfert contenant 2,5 mM trisaminomethane (Tris), glycine 19,2 mM et 20 % de méthanol.
      ATTENTION : Méthanol est inflammable et doit être conservé à l’intérieur de l’armoire de stockage liquide inflammable.
    3. Effectuer le virement pendant 1 h à 100 V dans la chambre froide.
  5. Bloquer la tache au tampon de blocage de 10 mL contenant 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), NaCl 150 mM, 0.1 Tween 20 et 5 % de lait écrémé pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur.
  6. Incuber la tache avec de l’anticorps anti-HIF-1α (dilution 1/500) dans un tampon bloquant la même nuit à 4 ° C.
  7. Lavez la tache 3 fois pendant 5 min à chaque fois avec 50 mL de SCT-T.
  8. Incuber la tache avec la peroxydase de raifort (HRP)-anticorps secondaire conjugué (dilution 1/1 000) dans 10 mL SCT-T contenant 5 % dégraissé de lait sec pendant 1 h à température ambiante.
  9. Lavez la tache 3 fois pendant 5 min à chaque fois avec 50 mL de SCT-T.
  10. Mix 500 µL chacun de chemilumescent amélioré (ECL) réactif A et B dans un tube de microtubes de 1,5 mL et vortex brièvement.
  11. Appliquer le substrat de l’ECL à la tache et laisser incuber pendant 1 min à température ambiante.
  12. Capter les signaux de chimiluminescence en utilisant une charge - coupled device (CCD) système d’imagerie par caméra.
    1. Égoutter l’excès substrat ECL en touchant le bord de la membrane avec un papier de soie et placer la membrane dans un protecteur de la feuille.
    2. Placer la membrane sur le plateau de l’échantillon du CCD caméra basée sur système d’imagerie.
    3. Lancer le logiciel de traitement d’image (voir la Table des matières) et capturer les images avec les paramètres suivants : fichier → nouveau protocole → monocanal → configuration protocole → Gel imagerie (Application : Chemi ; Domaine de l’imagerie : Gel prêt Bio-Rad ; Exposition d’imagerie : Le logiciel optimisera automatiquement le temps d’exposition pour les bandes intenses) protocole Run →
      Remarque : La durée d’exposition peut être réglée manuellement pour obtenir des images optimales.

4. immunoprécipitation et détection des protéines immunoprécipitée

  1. Lavez 50µl de billes de protéine A/G Sépharose dans 500 µL de tampon TBS dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et les perles de granule par centrifugation à 3 000 x g pendant 2 min à 4 ° C.
  2. Jeter le surnageant et remettre en suspension les perles dans 100 µL de tampon de TBS.
  3. Ajouter 2 µL de l’anticorps monoclonal anti-ARNT de souris (1,4 mg/mL) ou de la souris l’immunoglobuline G (IgG) (1,4 mg/mL) qui a été préparé en reconstituant la souris IgG de 0,7 mg dans 500 µL de tampon de TBS.
  4. Placer les tubes de microcentrifuge de 1,5 mL contenant les perles dans une coiffe de tube et incuber pendant 2 h à 10 tr/min dans la chambre froide.
    NOTE : Gérez les tubes doucement et garder la suspension contenant les billes au fond du tube.
  5. Les perles de granule par centrifugation à 3 000 x g pendant 2 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
  6. Diluer 200 µg de la protéine nucléaire lysate obtenue en étape 2.6.5 dans 800 µL de tampon IP 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), consistant en 180 mM NaCl, 20 % de glycérol, inhibiteur de protéase de NP-40 et 1 x 0,2 % cocktail. Incuber le lysat avec les perles couplée à l’anticorps obtenus à l’étape 4.5 durant la nuit à 4 ° C.
  7. Les perles de granule par centrifugation à 3 000 x g pendant 2 min à 4 ° C, jeter le surnageant et laver les perles 3 fois avec 1 mL SCT glacée contenant 0,2 % NP-40.
  8. Faire bouillir les perles dans 50 µL de tampon d’échantillon Laemmli à 95 ° C pendant 5 min.
  9. Centrifuger les perles à 10 000 x g pendant 5 min à 4 ° C, recueillir le liquide surnageant et jeter les perles.
    Remarque : Le liquide surnageant peut être stocké à 4 ° C pour le court terme ou à-20 ° C pour le long terme.
  10. Détecter la présence de HIF-1α depuis les complexes de protéine immunoprécipitée par western blot, comme décrit dans l’étape 3.3 partir.
    NOTE : Quantification des protéines n’est pas nécessaire pour cette étape. Charger le volume complet (50 µL) de surnageant de chaque échantillon dans chaque cupule d’un SDS-PAGE préfabriqué gradient gels (4 – 20 %)

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Résultats

Pour évaluer la réponse cellulaire à l’hypoxie, l’expression de niveaux et localisation subcellulaire des composants du traitement hypoxie ci-après HIF1 complex ont été examinés. HEK293A cellules ont été cultivées dans des conditions hypoxiques pendant 4 h ou maintenu à la normoxie comme témoins. Les taux de protéine HIF-1α et ARNT sont examinés à germes entiers ou des extraits nucléaires/cytoplasmique par western blot. Comme prévus, totales HIF-1α niveaux étaient surexprimés par l’hypoxi...

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Discussion

Le complexe de HIF-1 est un maître régulateur de l’homéostasie cellulaire de l’oxygène et réglemente une pléthore de gènes impliqués dans les différentes réponses adaptatives cellulaires à l’hypoxie. Identification de nouvelles protéines qui interagissent de HIF-1 est importante pour la compréhension de la transduction du signal hypoxique. Co-Immunoprécipitation expériences sont couramment utilisés pour les études de l’IPP pour délimiter les voies de transduction de signal cellulaire. Cependant, la surexpression de la pr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Remerciements

Nous remercions Assoc. Prof. Sin Tiong Ong pour l’utilisation de la plateforme de l’hypoxie. Ce travail a été soutenu par ce qui suit : Singapour Ministry of Education, MOE 1 t 1-02/04 et MOE2015-T2-2-087 (à Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, subvention de démarrage de Nanyang Technological University M4230003 (à P.O.B.), le Conseil de recherche suédois, le Erling Persson Fondation de la famille, le Novo Nordisk Foundation, la Stichting af Jochnick Fondation, l’Association suédoise du diabète, la compagnie d’assurance de Scandia, la recherche sur le diabète et Wellness, Fondation de couchette von Kantzow, le Programme de recherche stratégique dans le diabète au Karolinska Institutet, l’ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage et Knut et Alice Wallenberg Foundation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
<>
1,0 m, pH 7,41ère BASE1415
Protéine A/G Perles de sépharoseAbcamab193262
Protéine IgG de souris naturelleAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli Tampon d’échantillonBio-Rad1610737
2-MercaptoethanolBio-Rad1610710
Nitrocellulose Membrane   ;   ;Bio-Rad1620112
bloqueur de buvardsBio-Rad1706404Lait écrémé en poudre pour les applications de transfert western
10x Tris Buffered Saline (TBS)Bio-Rad1706435
10 % Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad1610732
10x Tris/Glycine Buffer  ;Bio-Rad1610771
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610374
IgG anti-lapin, Signalisation cellulaire d’anticorps liée à la HRP7074
IgG anti-souris, Anticorps liés à la HRP  ;Signalisation cellulaire7076
Réactif SignalFire ECLSignalisation cellulaire6883
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SalineCorning21-030-CV
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)Merck Millipore52332
ARNT/HIF-1 bêta Anticorps  ;Novus BiologicalsNB100-124Concentration : 1,4 mg/mL
HIF-1 alphaAnticorps Novus BiologicalsNB100-479Concentration : 1,0 mg/mL
YY1 AnticorpsNovus BiologicalsNBP1-46218Concentration : 0,2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein KitQiagen37582Le tampon de lyse NL et le tampon d’extraction NX1 sont fournis dans le kit
GAPDH AnticorpsSanta Cruzsc-47724Concentration : 0,2 mg/mL
Glycérol (&ge ; 99 %)SigmaG5516
Chlorure de potassiumSigmaP9541
Tampon RIPASigmaR0278
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco' Eagle modifié' s milieu (DMEM, 4,5 g/L de glucose)Thermo Fisher Scientific11995065
Dithiothréitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Sérum fœtal bovinThermo Fisher Scientific10270106
HEK293A lignée cellulaireThermo Fisher ScientificR70507
Méthanol  ;Thermo Fisher Scientific67-56-1
Pénicilline-StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122
Pierce Inhibiteur de protéase Comprimés  ;Thermo Fisher Scientific88660
Pierce BCA Kit de dosage des protéinesThermo Fisher Scientific23225
QSP pointe de chargement de gel  ;Thermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 uL
Equipment/Instrument
Papier filtre à tache épaisse, prédécoupé, 7,5 x 10 cmBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN  ; Cellule d’électrophorèse verticale Tetra pour mini-gels préfabriqués, avec Mini Trans-Blot  ; Module et alimentation de base PowerPacBio-Rad1658034
4&ndash ; 15 % Mini-PROTEAN TGX Gels protéinés préfabriquésBio-Rad4561083
Système ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
I-GloveBioSpherixI-Glove
Synergy HTX Lecteur de microplaques multimode  ;PipettesBTS1LFTA
Costar 5mL StripetteCorning4487
Costar 10mL StripetteCorning4488
Costar 25mL Stripette Pipettes sérologiquesCorning4251
Corning 96-Well Clear Bottom Black PolystyrèneMicroplaques Corning3631
15mL High Clarity PP Tubes à centrifuger coniquesCorning352095
Grattoir à petites cellulesCorning3010
Gilson  ; Pipetman L Kit 4 pipettes  ;GilsonF167370P2, P20, P200, P1000 et accessoires
1.5mL Polypropylène Microcentrifuge TubesGreiner Bio-One  ;
616201 PIPETBOY acu 2 PipettorINTEGRA Biosciences155 000  ;
Armoires de stockage de liquides inflammables JustriteJustrite Manufacturing Co.896000
Mélangeur vortexLabnetS0200
Incubateur CO2NuAireNU-5820
Agitateurs orbitauxStuartSSL1
Rotateur de tubes SB3StuartSB3
MicroCL 21R MicrocentrifugeuseThermo Fisher Scientific75002470
Sorvall ST 16 CentrifugeuseThermo Fisher Scientific75004240
Boîtes de culture tissulaire (100 mm)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer MINI Appareil de dialyseThermo Fisher Scientific6958010K MWCO, 0,1 mL
Bouées flottantes pour 0,1 ml Slide-A-Lyzer MINI Appareils de dialyseThermo Fisher Scientific69588
LSE Radiateurs numériques à bain secThermo Fisher Scientifique1168H25
Thermo Scientific  ; Enceintes de sécurité biologique série A2 série 1300 Classe II, type A2Thermo Fisher Scientific13-261-308
Software
Image Lab SoftwareBio-Rad1709691
Tampon Tris-HCl sérologiques BioTek

Références

  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
  6. Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
  7. Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
  8. Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
  9. D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
  10. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
  11. Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
  12. Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
  13. Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
  14. Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
  15. Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
  16. Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
  17. Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
  18. Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819(2016).
  19. Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
  20. Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
  21. Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
  22. Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
  23. Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
  24. Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
  25. Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).

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