Détermination de la Membrane plasmique partitionnement pour les protéines associées à la périphérie

Résumé

Nous présentons ici un protocole afin d’effectuer une analyse quantitative du niveau de l’association de la membrane plasmique fluorescent-étiquetées de protéine associée à la périphérie. La méthode est basée sur la décomposition computationnelle de membrane et composants cytoplasmiques du signal observé dans les cellules marquées avec la membrane plasmique marqueur fluorescent.

Résumé

Cette méthode fournit une approche rapide pour la détermination de la membrane plasmique partitionnement de toute protéine associée à la périphérie fluorescent-étiquetées en utilisant les profils d’intensité de fluorescence à travers la membrane de plasma. Profilés de fluorescence mesuré sont fixés par un modèle pour la membrane et le cytoplasme distribution de fluorescence le long d’une ligne appliquée perpendiculairement à la périphérie de la cellule. Ce modèle est construit à partir des valeurs d’intensité de fluorescence en exprimant un marqueur fluorescent-étiquetées de cytoplasme et avec FM 4-64-étiqueté la membrane plasmique des cellules de référence. La méthode peut être appliquée à différents types de cellules et des organismes ; Cependant, seulement les membranes plasmiques des cellules non-voisins peuvent être évaluées. Cette méthode rapide axée sur la microscopie est appropriée pour les expériences, où sont attendus des changements subtils et dynamiques des marqueurs associés à la membrane plasmique et il fallait être quantifiée, par exemple, dans l’analyse des versions mutantes de protéines, traitements de l’inhibiteur, et observations de la transduction du signal. La méthode est implémentée dans un ensemble de R multi-plateforme qui est couplé avec une macro ImageJ qui sert d’une interface conviviale.

Introduction

Protéines de la voie périphérique associée à la membrane plasmique sont les éléments clés des voies de signalisation cellulaire. Un des rôles fondamentaux est leur transitoires plasma membrane association et dissociation, qui est importante pour la transduction du signal entre la membrane plasmique et le cytoplasme. Protéines de la voie périphérique associée à la membrane plasmique peuvent être fixés sur la membrane plasmique par ancres lipidiques (N-myristoylation, S-acylation ou prénylation) ou par domaines de liaison des lipides (interaction avec les phosphates du phosphatidylinositol, l’acide phosphatidique, etc.).

Liaison la ....

Protocole

1. préparation du matériel biologique

1. Préparer le matériel biologique exprimant la protéine fluorescent étiquetée d’intérêt, mais aussi un marqueur cytoplasmique. Suivez les procédures mentionnées dans l’Introduction.

2. confocal Laser Scanning Microscopy

1. Détachant le matériel préparé à l’article 1 avec FM 4-64 colorant⁷.
   1. Appliquer un protocole de coloration qui est approprié pour la matière étudiée. Pour les cellules de tabac BY-2, détachant 200 μl de suspension cellulaire avec 0,2 μL de 10 mM FM 4-64 solution dans le diméthylsulfoxyde.
      Remarque : La concentration de c....

Résultats

DREPP¹⁰ est une protéine spécifiques aux plantes associées en périphérie-membrane plasmique qui est associée à la membrane plasmique via un N-myristoylation et une interaction électrostatique avec phosphatidylinositol phosphates^{11, 12}. DREPP a été décrit comme un composant du mécanisme de signalisation calcique dans la cellule végétale et aussi interagit avec le cytosquelette^13.......

Discussion

La méthode décrite ici génère une estimation plus précise de la membrane plasmique partitionnement pour les protéines associées en périphérie par rapport aux autres approches basées sur la mesure des intensités de fluorescence⁵. L’amélioration majeure de cette méthode est qu’elle prend en compte la diffraction de la lumière et la superposition de la membrane plasmique et les signaux cytoplasmiques. Bien que ces résultats de la méthode sont en corrélation avec les résultats d’une méthode simple bas.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
FM 4-64	ThermoFisher Scientific	T13320	Colorant pour membrane plasmique
Diméthylsulfoxyde	Sigma-Aldrich	D4540 Sigma	Dye solvent
Équipement ordinaire (lames microscopiques, pipettes, pointes, tubes)			Équipement pour l’étiquetage cellulaire et la microscopie
			confocal à balayage laser
Ordinateur ordinaire