Article de méthode

Une méthode Invasive pour l’Activation du Gyrus denté souris par Stimulation haute fréquence

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DOI :

10.3791/57857

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2 juin 2018

 , 
1Department of Neurobiology, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, 2Key Laboratory of Neuroregeneration, Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole indique comment mettre en place une méthode fiable de HFS chez la souris. Neurones dans l’hippocampe gyrus denté sont stimulés électriquement par HFS directement et indirectement in vivo. L’activité neuronale et la signalisation moléculaire sont examinés par c-fos et immunofluorescence Notch1, respectivement ; neurogenèse est quantifiée par la bromodéoxyuridine dosage d’étiquetage.

Résumé

Stimulation électrique de haute fréquence (HFS), utilisant des électrodes implantées, ciblant les différentes régions du cerveau, s’est avérée comme un traitement efficace pour divers troubles neurologiques et psychiatriques. HFS dans la région profonde du cerveau, également appelée stimulation profonde du cerveau (DBS), devient de plus en plus important dans les essais cliniques. Les progrès récents dans le domaine de la chirurgie de haute fréquence DBS (HF-DBS) a commencé à se répandre la possibilité d’utiliser cette technique invasive à d’autres situations, telles que le traitement pour la maladie de dépression majeure (MDD), les troubles obsessionnels compulsifs (TOC) et donc sur.

Malgré ces indications en expansion, les mécanismes sous-jacents des effets bénéfiques du HF-DBS restent énigmatiques. Pour répondre à cette question, une approche consiste à utiliser implanté des électrodes qui activent peu distribué des sous-populations de neurones par HFS. Il a été signalé que HFS dans le noyau antérieur du thalamus pourrait être utilisé pour le traitement de l’épilepsie réfractaire à la clinique. Les mécanismes sous-jacents pourraient être liées à la neurogenèse accrue et modifié l’activité neuronale. Par conséquent, nous sommes intéressés à explorer les altérations physiologiques de la détection de l’activité neuronale, mais aussi la neurogenèse dans le gyrus denté de souris (DG) avant et après traitement de HFS.

Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent les méthodologies pour HFS cibler l’activation de la DG chez la souris, directement ou indirectement et de façon aiguë ou chronique. En outre, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour la préparation des coupes de cerveau de c-fos et Notch1 immunofluorescence souillant pour surveiller l’activité neuronale et activation de la signalisation et de bromodéoxyuridine (BrdU) étiquetage afin de déterminer la neurogenèse après l’induction HF-DBS. L’activation de l’activité neuronale et la neurogenèse après le traitement HF-DBS fournit une preuve directe neurobiologique et bénéfices thérapeutiques potentiels. En particulier, cette méthodologie peut être modifiée et appliquée pour cibler d’autres régions du cerveau concernées telles que les noyaux gris centraux et subthalamique régions pour les troubles spécifiques du cerveau à la clinique.

Introduction

HF-DBS est une technologie de neurochirurgie pour la stimulation électrique dans le cerveau, qui s’est développée depuis les années 18701. Dans les années 1980, HFS servit tout d’abord une intervention thérapeutique potentielle pour la maladie de Parkinson et troubles de l’autre mouvement2. Dans les dernières décennies, HF-DBS a été plus largement utilisé dans le traitement des troubles du cerveau qui sont actuellement impossibles à traiter par une stratégie thérapeutique traditionnelle. En particulier, en raison de l’amélioration de la précision de l’électrode HFS, les résultats très efficaces et des effets secondaires minimes, le nombre de troubles du cerveau traitée par HF-DBS a considérablement augmenté au cours des dernières décennies3,4, 5. Par exemple, HF-DBS a été approuvé par la US Food and Drug Administration (FDA) pour le traitement de la maladie de Parkinson (MP), démence de type Alzheimer, tremblement essentiel et d’autres types de mouvement troubles2,6, 7. dans les patients Parkinsoniens, le médicament dopaminergique est réduit jusqu'à 50 % au cours de la HF-DBS8. En plus de la réussite du traitement des troubles du mouvement, HF-DBS a également démontré ses effets puissants dans le traitement des maladies psychiatriques dans la clinique et pour l’augmentation des cognitive comme bien2,9, 10 , 11. il convient de noter que la recherche de HFS pour le traitement d’autres troubles psychiatriques sont à divers stades, offrant très prometteur pour les patients de12.

Bien que plusieurs études ont démontré qu’une focale HFS a des effets les et distants dans tout le cerveau13, les mécanismes neurologiques et moléculaires des effets demeurent insaisissables2,14. Dans la clinique, thérapeutique HF-DBS est généralement appliquée de manière à long terme pour le traitement de la maladie de Parkinson et de douleurs chroniques, etc. que beaucoup d’opinions est déclenchés pour expliquer l’amélioration produite par un traitement HF-DBS, parmi laquelle une possibilité que le courant HFS module l’activité du réseau neuronal, probablement par une dépolarisation répétitive des axones dans le voisinage de l’électrode implantée de HFS. Ou, HF-DBS peuvent modifier le taux de décharge des neurones de sortie et les cibles projetées. Aussi, HF-DBS peut conduire à des changements de synaptiques à long terme, y compris la potentialisation à long terme (LTP) et dépression à long terme (DLT), qui peuvent contribuer à une amélioration symptomatique. Jusqu'à présent, on ignore encore si HFS influences principaux événements moléculaires qui régulent les cellulaires traite tel comme in vivode la neurogenèse adulte. Plusieurs lignes des études ont démontré que HFS chez les rongeurs pouvaient imiter des réponses neurones similaires de clinique appliquée DBS15,16. Pour comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents du HF-DBS, dans cette étude, nous tout d’abord mis en place un en vivo méthodologie HFS chez la souris dans un aigu (un jour) ou de manière chronique (cinq jours). Deuxièmement, nous avons mis en place une méthodologie d’analyse par activation pour déterminer la modification de l’activité neuronale et la neurogenèse après une livraison HF-DBS.

Étant donné que la production neuronale de cellules souches neuronales est abondante durant le développement embryonnaire mais continue tout au long de la vie d’adulte, la zone subgranulaire hippocampe est l’un des principaux domaines où la neurogenèse se produit. Le processus de neurogenèse est influencé par de nombreux facteurs physiologiques et pathologiques. Dans certains cas d’épilepsie, la neurogenèse hippocampique est considérablement diminuée de17,18. En outre, une thérapie par électrochocs unique pouvant accroître considérablement la production neuronale dans le gyrus denté19. Ces observations suggèrent que l’activité électrophysiologique joue un rôle essentiel dans la régulation de la neurogenèse adulte et la plasticité synaptique dans les neurones de l’hippocampe. Par conséquent, pour démontrer davantage les effets du HF-DBS sur l’activité neuronale et la neurogenèse, nous avons tout d’abord effectuer un dosage immuno-coloration de la gène (IEG) début immédiat c-fos qui est un marqueur connu de l’activité neuronale à court terme résultant de 20de l’expérience. Signalisation Notch1 est également détectée pour contrôler l’activation de signalisation après les HFS livraison21,22. En outre, nous détectons également la production neuronale par un BrdU étiquetage analyse après l’induction HF-DBS de diverses manières, mais BrdU coloration peut également être un marqueur pour gliogenesis.

Dans la présente étude, deux méthodes HFS sont adaptés pour cibler l’activation de l’hippocampe DG directement et indirectement. L’électrode est implantée directement dans le DG ou implanté dans la voie de perforante médial (PP) qui envoie des projections pour activer les neurones de la DG. Pour l’induction HF-DBS, un stimulateur programmable est présenté pour une stimulation continue par l’électrode fixe sur la tête de la souris. Pour déterminer les effets de HFS sur activation neuronale et la neurogenèse, nous détectons l’expression de c-fos et Notch1 par immunofluorescence et le nombre de neurones positifs BrdU-incorporé dans la région de l’hippocampe DG, respectivement, après le traitement de HFS. En particulier, les effets de l’HF-DBS sur la neurogenèse dans le DG sont comparés entre aiguë et un mode de stimulation chronique, ou entre un direct et un mode de stimulation indirecte, respectivement.

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Protocole

Les procédures expérimentales animales conformé aux directives institutionnelles de la Beijing Institute of Basic Medical Sciences (Beijing, Chine) et des règlements gouvernementaux chinois pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les souris (adulte masculin, 26 ~ 30 g) ont été logés et conservé à une température constante de 23 ° C, avec de l’eau et l’alimentation ad libitum, sous un cycle foncé de lumière/12 h 12 h (lampes allumées à 07:00). Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées durant le cycle de lumière.

1. préparation chirurgicale

Remarque : Une électrode de mesure a été faite maison à l’aide de la méthode modifiée de Halpern rapport23.

  1. Utiliser 2 micro-câbles en cuivre (avec un diamètre extérieur de 200 µm) comme électrode bipolaire parallèle. Envelopper les électrodes autour de l’autre pour former des électrodes cylindriques pour la stimulation.
    NOTE : Ici, la longueur de l’électrode au sein de la DG ou PP variait selon la profondeur anatomique du noyau.
  2. Stériliser les électrodes à l’aide d’une armoire de désinfection de l’oxyde d’éthylène. Manipuler et entreposer les maison 2 canaux micro-fils-électrodes sans n’importe quelle contamination. Les électrodes doivent être strictement stérilisés avant toute implantation chirurgicale.
  3. Stériliser les instruments chirurgicaux.
  4. Avant la chirurgie, injecter la souris au pentobarbital (20-50 mg/kg) par voie intrapéritonéale, pour réaliser un plan chirurgical de l’anesthésie.
  5. Injecter la souris avec une suspension de procaïne pénicilline stérile G (75 000 U, I.M.) et un agent analgésique (carprofen, 0.05 - 1 mg/kg, SC) pour diminuer les risques d’infection et de douleur, respectivement24.
  6. Après l’anesthésie de l’animal, appliquer un lubrifiant oculaire à deux yeux pour prévenir le dessèchement de le œil. S’assurer que l’induction de la sédation et la profondeur de l’anesthésie par des réflexes de l’animal en réponse à l’orteil de pincer et de procéder à l’opération uniquement lorsqu’aucune réponse ne survient.
    Remarque : L’onguent Vet est une autre option pour prévenir le dessèchement de le œil.
  7. La plupart de la fourrure sur le dessus de la tête de la souris vous raser avec des tondeuses électriques ou une lame de rasoir, stériliser la zone rasée avec trois gommages alternance de 70 % d’alcool et de la bétadine solution et poursuivre l’opération après que la bétadine a séché sur la peau.

2. la Stimulation haute fréquence chirurgie25,26

Remarque : Dans cette étape, une électrode est unilatéralement implantée dans la dorsale DG ou zone médiale de PP, une partie de l’hippocampe avec un rôle important dans l’apprentissage épisodique et la mémoire.

  1. Placez votre souris anesthésiée sur le cadre stéréotaxique. Pour conserver la tête de la souris immobile, alignez les barres d’oreilles correctement et les installer rapidement. Serrez doucement les barres d’oreilles afin qu’ils soutiennent la tête centrée et sécuriser la souris légèrement.
  2. Utiliser un tampon thermostatique pour maintenir la température du corps de l’animal à 37 ° c ± 0,5 ° C.
  3. Pince permet de saisir la peau devant les oreilles de souris et couper avec des ciseaux stérilisés à enlever sur 1 cm2 de surface de la peau sur le dessus du crâne de la souris.
    NOTE : Une petite quantité de sang pourrait être observée le long des bords de la peau coupée.
  4. Enlever le muscle et autre pièce jointe recouvrant le crâne avec un coton-tige pour exposer la surface du crâne. Utilisez un coton-tige et dissection ciseau pour nettoyer tous les périoste, les tendons et les tissus conjonctifs de surface complètement pour identifier la sagittale du crâne et les lignes de sutures lambda.
  5. Identifiez le bregma et point de lambda. L’intersection de la suture coronale et la suture sagittale sur la partie médiane supérieure de la calotte cranienne est où se trouve le bregma. L’intersection de la suture lambdoïde de la suture sagittale est où le lambda est visible. Utilisez le bregma comme point de départ pour définir l’autre position de noyau.
  6. Après l’identification de la position de bregma et lambda sur le crâne, régler ces deux points dans le plan horizontal. S’assurer que la hauteur de ces deux points est presque le même dans le sens de la dorsale-ventral (toute erreur doit être < 0,05 mm). En outre, assurez-vous que le crâne est de niveau en direction médiale-latérale dans la même voie26.
  7. Pour une opération unilatérale, monter une maison 2 canaux cuivre micro-fil-électrode dans le porte-électrode tournante sur le cadre de chirurgie stéréotaxique.
  8. Placer l’électrode verticalement au-dessus du point de bregma dans un premier temps et le définir comme site d’origine. Utilisation du numérique affiche cadre chirurgie stéréostatique pour indiquer l’antéro-postérieur (AP), medial-latérale (ML), et positionne dorso-ventral (DV).
    Remarque : Pour éviter que l’électrode se plier, ne pas toucher l’extrémité de l’électrode sur le crâne pendant l’opération.
  9. Déplacer l’électrode doucement dans la bonne position (Figure 1 a, AP-2.1/ML ± 1,0 pour DG et AP-3,8/ML ± 3.0 pour le PP, respectivement)27 au-dessus du crâne sans aucun contact. Lorsque le site désiré a été identifié pour l’insertion de l’électrode, utilisez aux adaptations stéréotaxiques dorsoventral supérieur le porte-électrodes et marquer la position avec un marqueur noir.
    Remarque : L’emplacement exact en ce qui concerne les coordonnées stéréotaxiques peut varier selon le sexe, poids et souche de souris. Des souris adultes de même sexe devraient servir à réduire au minimum toute variation dans l’emplacement. Si possible, analyses anatomiques pré-opérationnelle doivent être utilisés pour identifier l’emplacement sur un sujet individuel base27.
  10. Utiliser une perceuse à main micromanipulateur assistée (burr taille = 0,5 mm) pour faire des trous de bavures à l’emplacement marqué avec précision. Stériliser à la pointe de la meule avec l’éthanol à 70 % avant de percer. Vers le haut le foret mini à travers le crâne, le long de l’axe z 0,8 - 1,0 mm sans changer de position X-Y. Utiliser un coton stérile pour arrêter tout saignement pendant l’opération.
    Remarque : Pour éviter la génération de chaleur trop forage et excessive lors du forage, vérifiez la vitesse de perçage est de 15 000-18 000 tours par minute (tr/min) et fréquemment de retirer le foret du trou de trépan chaque s 8-10.
  11. Garder les forages jusqu'à ce que la dure-mère est exposée. Utiliser une aiguille tordue pour retirer des fragments de n’importe quel OS qui sont générés lors du forage et de faire un trou d’épingle sur la dure-mère sans endommager les tissus sous-jacents de cerveau mou.
    Remarque : Pour éviter d’endommager le tissu cérébral, l’aiguille émoussée tordue peut également être remplacée avec une fine pince émoussée.
  12. Pour confirmer que les trous de bavures ont été faites correctement sur la position désirée, réduire la hauteur de l’électrode par un ajustement de l’image de la chirurgie stéréotaxique et veiller à ce que l’électrode peut être inséré sans à-coup à travers le trou de trépan sans toucher les obstacles. Dans l’affirmative, introduire doucement les électrodes jusqu'à une profondeur de 1,8 mm pour la DG (ou 3,0 mm pour le PP) de la surface du crâne situé à la PP médial du DG (PP-DG).
    NOTE : Effacer tout le liquide céphalorachidien ou des sorties de sang par les trous de la ronce avec du coton stérile pendant le processus de l’implantation de l’électrode.
  13. Après avoir inséré la micro-fil-électrode dans le trou du crâne, maintenez-le en place avec du ciment dentaire adéquate, à l’aide d’une petite spatule. Comme le ciment s’épaissit, il moule autour de l’électrode insérée et vis pour former une belle casquette lisse. Débrider et désinfecter les bords de la plaie.
  14. Dégager l’électrode du porte-électrode. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et retourner à une cage chaude.
    Remarque : Après la chirurgie, attendre au retour les animaux à leurs cages jusqu'à ce qu’ils ont pleinement récupéré de l’anesthésie avec conscience suffisante.
  15. Laissez la souris se déplacer librement et lui permettre de récupérer pendant 2 jours dans la cage. Ensuite, connecter l’électrode implantée chez la souris le cerveau à un stimulateur programmable via conduit. Configurer l’interface de logiciel tel que présenté dans la Figure 2. Définissez les paramètres HFS comme 6 séries de 6 trains de 6 impulsions à 400 Hz (Figure 1B, 100 ms entre les trains, 20 s entre les séries)28. Régler l’intensité de la stimulation de 200 μA.
  16. Livrer un HFS pour la période souhaitée de temps dans le jeu. Le niveau de stimulation 2 x par jour à 08:00 et 20:00
  17. Pour le groupe témoin, implanter des électrodes dans les souris et n’effectuent pas une stimulation.
  18. Pour la coloration de c-fos , stimuler les souris expérimentales aiguë (2 x par jour). Pour l’étiquetage de BrdU, diviser les souris expérimentales en un groupe de stimulation aiguë (appliquer 2 x par jour) et un groupe de stimulation chronique (appliqué 10 x en 5 jours, 2 fois par jour). Au cours de la stimulation, assurez-vous que la souris est éveillée. N’oubliez pas de s’assurer que les fils ne soient pas vrillées.
    Remarque : À la clôture de la procédure, les souris dans le groupe stimulation aiguë ont été stimulés simultanément.
  19. Lorsque la stimulation est terminée, soigneusement débrancher la broche de l’électrode du porte-électrode et le connecteur du système d’enregistrement.

3. immunofluorescence souillant et bromodéoxyuridine étiquetage29

  1. Pour le c-fos et Notch1 coloration, environ 3 h après la dernière stimulation HF-DBS, anesthésier les souris en injectant du pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) pour réaliser un plan chirurgical de l’anesthésie.
  2. Pour l’étiquetage de BrdU, environ 12 h après la dernière stimulation HF-DBS, donner 6 injections de BrdU au contrôle et aux souris stimulées à intervalles de 2 h (50 mg/kg de sérum physiologique à 0,9 %, I.P.). 36 h après la dernière injection, anesthésier les souris en injectant du pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) pour réaliser un plan chirurgical.
  3. Faire des incisions en utilisant un scalpel à travers la cage thoracique pour exposer le cœur puis passez une aiguille de calibre 22 perfusion émoussé au ventricule gauche. Faites une petite incision à l’oreillette droite. Transcardially on perfuse avec 50 mL de froid tampon phosphate salin (PBS) suivie de 50 mL de paraformaldéhyde froide de 4 % (PFA) dans du PBS 1 x (pH 7,4).
    NOTE : Passer du PBS à la PFA quand la souris sang in vivo est remplacé et le liquide s’écoule soit propre. Une bonne perfusion peut être jugée par le franchissement du foie. La perfusion doit être arrêtée dès que les tremblements de fixation ont été observés à30.
  4. Décapiter la souris avec des ciseaux ophtalmique, faites une incision sur la peau et exposer le crâne. À l’aide de pinces, puce hors du crâne légèrement et soigneusement disséquer le cerveau de souris ensemble. Post-fixer le cerveau à la paraformaldéhyde à 4 % pour une période supplémentaire de 2 jours et le transférer dans une solution de saccharose 30 % à 4 ° C durant la nuit.
  5. À l’aide d’un cryostat, couper les cerveaux en sections coronale de 20 µm. Transfert et monter les sections à la lame de verre avec un pinceau et les stocker à-20 ° C.
    NOTE : Animaux avec l’oubli de l’électrode ou des dégâts mécaniques excessifs est exclus l’analyse ultérieure.
  6. Transférer les lames dans PBS normale (0,1 M, pH 7,4) ne contenant aucun fixateur. Laver les tranches avec du PBS pour 3-4 x de 5 min chacun pour enlever tout excès fixateur. Pour le groupe marqué BrdU, incuber les sections 2-N HCl pendant 30 min à 37 ° C et les rincer dans un tampon de borate 0,1 M (pH 8,4 ; 10 min). Puis laver les tranches de 2 x 5 min dans du PBS.
    NOTE : Immunomarquage est ensuite effectuée.
  7. Traiter les tranches en incubation en bloquant la solution (sérum de chèvre normal de 1 %, 3 % d’albumine sérique bovine < BSA >, 0,5 % Triton X-100 et 0,02 % d’azide de sodium dans du PBS 1 x) pendant 1 h à température ambiante (RT).
  8. Incuber les tranches avec anti -c-fos anticorps polyclonal (1/500, lapin), anticorps anti-Notch 1 (01:50, chèvre) ou anticorps anti-BrdU (1:800 ; rat) dans la solution de blocage à 4 ° C jusqu’au lendemain.
  9. Laver les tranches 3 x dans du PBS, puis les incuber avec Alexa Fluor 568 conjugué anti-rabbit (1/500), anti-chèvre conjugué Alexa Fluor 488 (1:1 000), ou de l’anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 488 anti-rat (1/500) pendant 1 h à température ambiante.
  10. Laver les échantillons 3 x dans du PBS (10 min chaque fois). Couvrir les sections immuno-étiqueté cerveau utilisant un milieu de montage anti-fondu réactif contenant DAPI. Laissez les tranches de sécher et les ranger à l’abri de la lumière à 4 ° C.
  11. Acquérir des images des zones hippocampiques des côtés du cerveau avec une haute résolution (séquentiel) microscope confocal à balayage multi-canaux stimulées et non stimulées. Définissez les paramètres d’imagerie constamment entre le contrôle et les groupes expérimentaux.
  12. Effectuer une imagerie de mosaïque en utilisant un objectif à fort grossissement (objectif 20 X air, NA 0,45) pour acquérir des images (XYZ) 3D continues des champs adjacents de vue en utilisant la platine motorisée et utiliser des logiciels appropriés pour piquer ensemble pour faire de grande composite images.
    Remarque : Le carrelage fonctions incluent le vrai couture et lissage des options pour des images améliorées sans soudure. Images composites sont rapidement et facilement préparés à l’aide de la fonction couture, pour former une image sur une large zone.
  13. Pour c-fos et Notch1 coloration, effectuer une analyse quantitative de noyaux positifs de la densité par immunofluorescence21 des images piquées. Au hasard, sélectionner 3 zones dans les sous-régions DG hippocampe rostrales, dorsales et ventrales et mesurer la densité par immunofluorescence de façon double insu en utilisant Image J logiciels (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
  14. Pour un BrdU étiquetage, analyser les tranches autour du point de forage par l’intermédiaire de l’hippocampe dorsal (-1,70 mm à-2,70 mm par rapport à la bregma) d’une manière double aveugle.
  15. Comptez seulement les neurones BrdU séropositifs à la DG. Inclure les cellules situées dans les diamètres 2-cellulaire de la cellule de granules dans le comptage.
    NOTE : Ici, comptage a effectué un un 40 X objectif de l’air. Au hasard, coupes de 3 à 5 par animal ont été comptés, et les chefs d’accusation ont été en moyenne et exprimées comme moyen par DG19.

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Résultats

Suite à la stimulation de HF-DBS à la sous-région DG hippocampe directement ou la sous-région PP pour activer le DG indirectement via inséré les électrodes à l’aide des réglages stéréotaxiques, les rongeurs ont été anesthésiés au pentobarbital et échantillonné 3 h après la dernière stimulation HF-DBS pour le c-fos et Notch1 immunostaining. Pour la coloration BrdU, 36 h après la dernière injection de BrdU après 1 jour ou 5 jours de stimulation HF-DBS, les rongeurs ont été...

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Discussion

La technique HF-DBS a été largement utilisée comme un outil puissant pour le traitement de nombreux troubles neurologiques depuis les années 1990. Jusqu’ici, les travaux de point de repère du HF-DBS sont pour le traitement de la maladie de Parkinson et tremblement essentiel, qui a attiré beaucoup d’attention et intérêt aussi bien dans la clinique et de la communauté scientifique. Il existe différents types d’études en cours de HF-DBS par de nombreux groupes pour application thérapeutique du HF-DBS dans certains troubles ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Remerciements

Soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine subventions 31522029, 31770929 et 31371149 (à Haitao Wu), programme 973 (2014CB542203) du programme de développement clés Etat pour la recherche fondamentale de la Chine (à Haitao Wu) et Grant Z161100000216154 de la Beijing Municipal Science et Technology Commission (Haitao Wu). Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Haitao Wu pour leur encouragement et discussions. Les auteurs sont extrêmement reconnaissants à Zhenwei Liu pour son aide avec le débogage de l’appareil.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Instrument stéréotaxique cérébralStoelting51730DImplantation intracrânienne stéréotaxique pour souris
StimulateurA-M systèmesModèle 3800MultiStim Stimulateur programmable à 8 canaux
Perceur dentaireSaeshin Precision Co., LtdSTRONG 90Pour le forage et la crainiotomie  ;
BurrMeisingerHM1 005#Pour le forage et la crainiotomie  ;
Digidata 1550 NumériseurDispositifs moléculairesAXON 1550Acquisition de données haute résolution
CryotomeThermo Fisher ScientificThermo Cryotome FSEDécoupe de coupes congelées d’échantillons Microscope
confocal OlympusFV-1200Japon, avec objectif 20x (NA 0.45)
Outils de chirurgie de la sourisF.S.T.14084-08,11254-20,16109-14Ciseaux, pinces, coupe-os, supports, etc.
Pentobarbital sodiumR& D systems457920-50mg/kg pour injection i.p.
Pénicilline G  ;Sigma-AldrichP303275 000 U pour injection i.m.
CarprofèneSigma-AldrichSML17135-10mg/kg, pour injection s.c.
4 % Paraformaldéhyde (PFA)Beijing Solarbio Sci-Tech Co.  ;P1110solution de stockage pour la fixation tissulaire
Tampon phosphate (PBS)Invitrogen10010023pH7.4, 500ml en stockage
Tissue-Tek O.C.T. compoundSakura4583Formulation de glycols et résines hydrosolubles
Anticorps anti-BrdUAbcamab6326Dilutions :1/800
anticorps anti-c-fosAbcamab209794Dilutions:1/500
IgG anti-lapin de chèvre (Alexa Fluor 568)Thermo Fisher ScientificA11036Dilutions :1/500
IgG anti-rat d’âne (Alexa Fluor 488)Jackson ImmunoResearch712-546-150Dilutions :
Milieu de montage anti-décolorationVector LaboratoriesH-1200Contre-coloration avec
anticorps anti-Notch1 DAPI (C-20)Santa Cruz Biotechsc-6014Dilutions :1/50
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488)Abcamab150073Dilutions :1/1000
1/500 avec DAPI

Références

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