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Article de méthode

Imagerie cellulaire de la TGF-β/Smad3 signalisation Pathway In Vitro et In Vivo à l’aide d’un adénovirus journaliste système en direct

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DOI :

10.3791/57926

⸱

30 juillet 2018

 ,  ,  , 
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes d’activité signalisation TGF-β/Smad3 utilisant un système de reporter des adénovirus. Ce système suit l’activité transcriptionnelle en temps réel et peut être appliqué à ces deux cellules isolées in vitro et dans l’animal vivantmodèles.

Résumé

Transforming Growth Factor β (TGF-β) signalisation réglemente plusieurs fonctions importantes requises pour l’homéostasie cellulaire et se trouve souvent surexprimé dans de nombreuses maladies, y compris le cancer. TGF-β est fortement impliqué dans les métastases au cours de la progression tardive stade du cancer, activant un sous-ensemble de cellules tumorales migrateurs et envahissantes. Les méthodes actuelles d’analyse de la voie de signalisation se concentrent sur des modèles de point de terminaison, qui souvent tentent de mesurer la signalisation post-hoc de l’événement biologique et ne reflètent pas la nature progressive de la maladie. Ici, nous démontrons un adénovirus roman journaliste système spécifique pour la voie de signalisation TGF-β/Smad3 pouvant détecter l’activation de la transcription dans des cellules vivantes. Utilisant un journaliste Ad-CAGA12-Td-Tom , nous pouvons atteindre un taux de 100 % d’infection des cellules MDA-MB-231 dans 24h in vitro. L’utilisation d’un reporter fluorescent permet pour l’imagerie de cellules vivantes d’unique en temps réel avec une identification directe des cellules transcriptionnellement actives. La stimulation des cellules infectées avec le TGF-β affiche uniquement un sous-ensemble de cellules qui sont transcriptionnellement actif et impliqué dans des fonctions biologiques spécifiques. Cette approche permet de grande spécificité et sensibilité à un niveau de cellule unique pour favoriser la compréhension des fonctions biologiques associés à TGF-β signalisation in vitro. Smad3 activité transcriptionnelle peut également être signalés en vivo en temps réel par le biais de l’application d’une Ad-CAGA12- Luc journaliste. Ad-CAGA12- Luc peut être mesurée de la même manière que les lignées traditionnelles luciférase stablement transfectées. Smad3 activité transcriptionnelle de cellules implantées dans vivo peut être analysée par le biais de l’imagerie conventionnelle IVIS et suivie direct au cours de la progression tumorale, donnant un aperçu unique sur la dynamique de la voie de signalisation TGF-β. Notre protocole décrit un système de livraison de journaliste avantageuse permettant l’imagerie haut débit rapide des voies de signalisation de cellules vivantes in vitro et in vivo. Cette méthode peut être étendue à un éventail de tests image basée et présente une approche sensible et reproductible pour biologie fondamentale et développement thérapeutique.

Introduction

Facteur de croissance transformant β (TGF-β) est une cytokine essentiel impliqué dans le développement humain qui signale par un hétérodimère complexe composé de type II et récepteurs1de type I. Liaison au récepteur II de type résultats dans le recrutement et la phosphorylation de type I du récepteur, qui phosphoryle à son tour en aval Smad2/3 protéines2,3. Ces activé Smad2/3 protéines lié à Smad4, formant un complexe translocation dans le noyau, qui régule la transcription de gène4. Dans des conditions homéostatiques TGF-β/Smad signalisation est étroitement contrôlée ; Toutefois, dans de nombreuses maladies, la voie de signalisation est déréglementée et souvent surexprimé conduisant à la progression de la maladie5,6,7. Des études récentes ont démontré que la réponse cellulaire au TGF-β est hétérogène et sous-populations de cellules actives de TGF-β/Smad sont responsables de la fonction biologique dans une fonction du temps8,9. Commune analyse cellulaire de la signalisation TGF-β/Smad implique l’utilisation de tests de point de terminaison fixe qui fournissent seulement un instantané de l’activité cellulaire et souvent de doser la moyenne TGF-β/Smad effet10. Cependant, ces méthodes, ne représentent pas exactement les comportements moléculaires du TGF-β/Smad signalisation dans l’état physiologique au cours de la progression de la maladie. Analyse de cellules vivantes sur image capture la dynamique des processus biologiques et cellulaires, avec une compréhension à la fois spatiale et temporelle.

Notre objectif était de développer une méthode sensible de haut débit pour l’imagerie de cellules vivantes du TGF-β/Smad de signalisation à l’aide de réactifs à base d’adénovirus. Ici, nous avons infecté la lignée de cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231 avec un adénovirus qui exprime l’ordre de liaison Smad3 CAGA motif et une luciférase (Luc) ou le gène rapporteur Td-tomate (Td-Tom). Systèmes de journaliste adénoviraux fournissent une méthode rapide et bon marchée pour l’introduction de plasmide qui peut entraîner un taux de 100 % d’infection en lignées de cellules cancéreuses. Systèmes viraux journaliste ont également été appliquées avec succès aux lignées de cellules qui sont difficiles à transfecter avec plasmide classique11. Dans ce protocole, nous allons décrire un processus reproductible et non invasif pour parvenir à l’imagerie de cellules vivantes de la voie de signalisation de TGFβ/Smad fois in vivo et in vitro.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvés par l’Université de Melbourne Animal Ethics Committee.

Remarque : Le protocole de séquence, de construction et de production pour l’adénovirus vecteurs pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP et pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom ont été décrites précédemment11,12, 13. Tous les vecteurs sont disponibles dans le commerce.

1. virus titre détermination à l’aide de 50 % la Dose infectieuse culture tissulaire (TCID50)

  1. Préparer 1 x 106 cellules HEK293A dans 10 mL de DMEM + 10 % FBS media.
  2. Les semences 100 µL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture de cellules de 96 puits à fond plat.
  3. Préparer 1 mL d’une dilution au 1/100 des stocks de virus au milieu complet. Ajouter 11 µL de virus dilué dans chaque puits de la colonne 1.
  4. Effectuer des dilutions successives 10 fois directement dans la plaque 96 puits en mélangeant 11 µL du virus dilué à 100 µL de suspension cellulaire jusqu'à une dilution finale de 1 x1012 est atteinte. Bien que les cellules sont non adhérents à ce stade, le nombre de cellules transférés entre puits reste constant.
  5. Distribuer 11 µL de chaque dilution dans chaque colonne commençant par la plus forte dilution de 104. Remplacer les pointes de pipette avec chaque dilution pour limiter reglable de particules virales.
  6. Ajouter 11 µL des médias sans virus complet dans la colonne 12 comme témoin négatif.
  7. Incuber les plaques pendant 7 à 10 jours à 37 ° C, avec 10 % de CO2.
  8. À l’aide d’un microscope, marquer le nombre de puits dans chaque colonne présentant des signes d’effets cytopathogènes ou cytotoxiques. Considérer un bien positif si aucun signe d’infection est présente.
  9. Calculer la fraction de puits positifs pour chaque dilution à l’aide de la méthode statistique (1938) de Reed et Muench14.
  10. Calculer la distance proportionnelle (DP) à l’aide : (A-50)/(A-B), où A est la réponse de pourcentage supérieur ou égale à 50 % et B est la réponse de pourcentage inférieure à 50 %.
  11. Calculate TCID50 using: 10X-PD, where X is the dilution giving a response greater than 50%.
  12. Calculer le titre viral en faisant ce qui suit : 0,69 / (0,011 x TCID50) UFP/mL

2. adénovirus MOI détermination

  1. Semences 1,0-1,5 x 10 cellules MDA-MB-231 du5 avec 500 μl de milieux de culture DMEM contenant 5 % FBS dans chaque puits d’un 12 plaque bien (confluence de la cellule de 35 %, 6 puits au total).
  2. Calculer les volumes de stock Ad-CMV-Td-Tom requis pour 0, 250, 500, 2500 et 5000 MOI en utilisant la suite formule : MOI = (volume [μL] x PFU/μL) / nombre de cellules. Pour Ad-CMV-Td-Tom avec un titre de 1 x 1010 (UFP/mL), les volumes de viroses MOIs requis sont respectivement de 0, 3.75, 7.5, 37,5 et 75 μL.
  3. Infectent les cellules avec les volumes calculés de Ad-CMV-Td-Tom à la Section 2.2 de pipetage directement stock virale dans les puits avec mélange intime.
  4. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  5. Retirez le support des puits et fixer immédiatement les cellules avec 500 μL de formol 10 % pendant 5 min.
  6. Aspirer le formol des puits et laver une fois les puits avec 500 μl de PBS.
  7. Détachant le noyau de la cellule avec 500 μl de solution de Hoechst pendant 5 min.
  8. Enlever la solution de Hoechst et laver les puits avec 500 μl de PBS 3 fois.
  9. Image la protéine Td-tomate et noyau cellulaire signal en utilisant un grossissement de 200 X sur un microscope à fluorescence. Exciter la protéine Td-tomate à 554 nm et la teinture de Hoechst à 352 nm.
  10. Analyser les images à l’aide de ImageJ pour déterminer le travail que moi requis pour 100 % d’infection de Td-tomate15.

3. double-adénovirus Transduction dans des cellules vivantes unique

  1. Semences 1,0-1,5 x 10 cellules MDA-MB-231 du5 avec 500 μl de milieux de culture DMEM contenant 5 % FBS dans chaque puits d’un 12 plaque bien (confluence de la cellule de 35 %, 2 puits au total).
  2. Infecter les cellules avec 75 μl de Ad-CMV-GFP (titre = 5 x 109 UFP/mL) et 7,5 μL de Ad-CAGA12-Td-Tom (titre = 5 x 1010 UFP/mL) afin d’obtenir un MOI 2 500, qui peut atteindre 100 % positivité de l’infection.
  3. Traiter les cellules avec ou sans 0,25 μL de TGF-β par puits (10 mg/mL en stock, 5 ng/μL comme la concentration finale) immédiatement après l’infection à adénovirus.
  4. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  5. Image des cellules vivantes présentant microscope à fluorescence contraste de phase. Exciter la GFP à 470 nm et protéine de Td-tomate à 554 nm.
  6. Difficulté des cellules et tacher le noyau de la cellule comme décrit dans les étapes 1,6 - 1,9.
  7. Image la protéine Td-tomate et Hoechst tachent à l’aide d’un microscope à fluorescence. Exciter le colorant Hoechst à 352 nm.
  8. À l’aide de ImageJ, calculer que le pourcentage de GFP et Td-tomate positif cellules15.

4. vivre seule cellule signalisation en cicatrisation Assay

  1. Semences de 4-5 x 10 cellules MDA-MB-231 du5 avec 1 mL de milieux de culture DMEM contenant 5 % FBS dans chaque puits d’un 6 bien sur plaque (confluence cellulaire de 50 %, 2 puits au total).
  2. Infectent les cellules avec 22,5 μL de Ad-CAGA12-Td-Tom (titre = 5 x 1010 UFP/mL, MOI = 2 500).
  3. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  4. Scratch deux lignes croisées sur la couche de cellules de chaque puits à l’aide d’une pointe de pipette P200.
  5. Supprimer les anciens médias de puits et remplacez par 2 mL de frais 5 % médias FBS avec ou sans 0,5 μL de TGF-β par puits (10 mg/mL en stock, 5 ng/μL comme concentration finale).
  6. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 5 min et prendre des photos des zones sélectionnées plaie grossissement 100 X sur un microscope à contraste de phase.
  7. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  8. Prendre des photos de la fermeture de la plaie dans les mêmes secteurs qu’avant.
  9. Fixer les cellules, tacher le noyau de la cellule comme décrit dans les étapes 1,6 - 1,9 et visualiser les signaux Td-tomate dans la région de la plaie et la zone non enroulés en utilisant un grossissement de 200 X sur un microscope à fluorescence.
  10. Quantifier le pourcentage de cellules positives Td-tomate dans la plaie et la zone non-plaie à l’aide de logiciels ImageJ15.

5. in Vitro de luciferase

  1. Préparer une suspension de cellules de 3-5 x 10 cellules MDA-MB-231 du4 dans 1 mL de milieu DMEM contenant du 5 % FBS.
  2. Infecter de suspension cellulaire avec 2,5 μl de Ad-CAGA12- Luc (titre = 5 x 1010 UFP/mL, MOI = 2 500).
  3. Graines les cellules infectées dans un 96 plaque bien à 3 000 cellules/100 µL/puits.
  4. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  5. Supprimez les anciens médias provenant de puits et remplacez-les par 100 µL de supports FBS 5 % neufs avec ou sans 0,1 μL de TGF-β par puits (1 mg/mL en stock, 1 ng/μL comme la concentration finale) et en présence ou en absence de 0,17 μL d’inhibiteur de TGF-β par puits (7 mg/mL en stock 12 ng/μL comme concentration finale) (une protéine nouvelle de piège ligand de TGF-β, Chen et al., œuvre inédite).
  6. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  7. Dégeler le substrat de système de dosage de luciférase et préparer le 1 x cell culture lyse réactif à l’eau bidistillée (DDW).
  8. Retirez le support des 96 puits et lyse puits avec 50 μL 1 x cell culture de tampon de lyse sur glace à l’aide d’un agitateur orbital avec une agitation modérée pendant 30 min.
  9. Transférer 30 μL de lysat de chaque puits dans une plaque opaque luciférase et laissez la plaque à température ambiante.
  10. Sur le logiciel luminomètre, créez un nouveau protocole. Sélectionnez pour 1 injecteur avec les mesures avant et après l’injection. Fixer des mesures avant l’injection à 1 s pour retard dans la mesure et Temps d’intégration. Pour après la mesure de l’injection, réglez le Volume d’Injection à 40 µL avec un retard dans la mesure de 1 s après injection et 5 s Temps d’intégration. Confirmez les paramètres en sélectionnant OK.
  11. Placer le tube d’injecteur dans DDW, puis cliquez sur le bouton 1 injecteur sous les paramètres du premier pour nettoyer le tube injecteur avant utilisation. Ensuite, retirez le tube injecteur de la DDW et le déposer dans l’air, suivi par deux autres nombres premiers d’injecteur 1 afin d’éliminer toute la solution du tube. Placer le tube d’injecteur dans le substrat de Firefly et de nouveau premier deux fois pour préparer le substrat.
  12. Placer la plaque de la luciférase opaque avec les échantillons dans le luminomètre et sélectionnez Options du logiciel. Sélectionnez les puits d’intérêt, puis cliquez sur appliquer. Appuyez sur Start pour mesurer le signal de la luciférase.
  13. Une fois que les mesures sont terminées, retirer et rincer la plaque avec de l’eau. Récupérer n’importe quel substrat restant dans le tube injecteur en plaçant le tube dans l’air et premier injecteur 1 dans tube de substrat de firefly. Placer le tube d’injecteur dans DDW et effectuer deux autres nombres premiers pour nettoyer le tube injecteur de n’importe quel substrat restant.

6. cellule préparation pour Live signalisation imagerie In Vivo

  1. 48 h avant l’implantation de la tumeur, graines 2-3 x 106 MDA-MB-231 cellules dans des fioles de2 175 cm (10 flacons au total). La culture de cellules dans 20 mL de milieu DMEM contenant du 5 % FBS à 37 ° C, 10 % CO2.
  2. 24 h plus tard, ajouter 300 μL de Ad-CAGA12- Luc (titre = 5 x 1010 UFP/mL, MOI = 2 500) dans chaque fiole. Maintenir les cellules en culture pendant un autre 24 h.
  3. Le jour suivant l’implantation, supprimer les anciens médias et laver les cellules adénovirus infecté une fois avec 20 mL de PBS, pH 7,4. Ajouter 2 mL de 0.05 % trypsine-EDTA dans la fiole et agiter le flacon légèrement pour permettre à la trypsine couvrir toute la surface du ballon. Placer la fiole dans l’incubateur à 37 ° C, 10 % CO2 pendant 3 min.
  4. Étancher la trypsine en ajoutant 8 mL de médias DMEM contenant du FBS dans les fioles. Transférer toutes les cellules en suspension dans un flacon de verre doseur.
  5. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et transfert de 4,8 x 107 cellules dans deux tubes à centrifuger 50 ml.
  6. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 5 min à RT pour enlever la trypsine et remettre en suspension les cellules en 720 mL de supports FBS-DMEM neufs.
  7. Transférer les suspensions de cellules dans un tube stérile 5 mL et ajouter 160 μL Matrigel (suspension à 10 % total matrigel).
  8. Conservez les cellules sur la glace jusqu'à l’implantation.

7. l’Implantation orthotopique

  1. Pèse 12 souris SCID et allouer au hasard des souris en groupes de contrôle et de traitement (6 souris/groupe).
  2. Effectuer l’implantation dans une bio-armoire stérile pour maintenir un environnement stérile. Anesthésier la souris l’isoflurane de 2,5 à 4,5 % avec un débit d’oxygène de 1 L/min. Placer la souris sur une bouillote et déposer une goutte de lubrification onguent sur les deux yeux pour éviter des lésions cornéennes. Difficulté la souris à la bouillote en position couchée, tandis que le maintien d’anesthésie en plaçant le museau dans un cône de nez connecté à l’isoflurane.
  3. Confirmer le succès de l’anesthésie par l’absence de réaction à l’orteil pincée. Réduire l’isoflurane à une dose d’entretien de 1,5 à 2,5 % avec 1 L/min d’oxygène pour le rappel de l’implantation.
  4. Nettoyez la peau de la quatrième d’échappement des deux côtés de la ligne médiane avec le tampon de coton trempé dans de l’éthanol à 80 %.
  5. Trouver les 4 coussinets adipeux mammaireth par palpation et presser la grosse garniture pour exposer davantage les tissus.
  6. La composition de la suspension cellulaire bien de pipetage de haut en bas. Doucement aspirer 50 µL du mélange de cellule dans une seringue à insuline 27G et injecter dans les coussinets adipeux mammaire sur les deux côtés de la souris.
  7. Confirmer une injection réussie par la sensation de gonflement de la garniture. Débloquez les coussinets adipeux doucement et mettez la souris revenir dans la cage.
  8. Laissez les cages sur le coussin chauffant pendant au moins 30 minutes permettre aux souris prendre conscience et puis replacez les cages dans la salle de détention pendant 3 jours.

8. IVIS imagerie

  1. Ouvrez le logiciel Living Image .
  2. Initialiser le système IVIS en cliquant sur le bouton Initialiser IVIS système du panneau de commande. Attendez que le signe de température s’allume en vert.
  3. Sélectionnez le Mode d’imagerie Luminescent sur le panneau de configuration.
  4. Allumez anesthésie isoflurane à la chambre et le système IVIS.
  5. Anesthésier les souris à l’aide de 2,5 à 4,5 % isoflurane avec 1 L/min d’oxygène. Une fois anesthésié, fixé isoflurane à 1,5 à 2,5 % pour l’entretien. Injecter 150 mg/kg de poids corporel de D-luciférine souris par injection intrapéritonéale (i.p.).
  6. Transférer immédiatement la souris dans le système IVIS, placez-les sur la plate-forme d’imagerie à température contrôlée et mettre leur nez dans le cône de nez.
  7. Cliquez sur le bouton de la Séquence d’installation sur le panneau de configuration, puis sélectionnez Moyen Binning.
  8. Mettre en place le temps d’exposition d’imagerie comme suit : 10 s, 20 s, 30 s, 60 s et 120 s. début d’imagerie environ 3 min après l’injection de la luciférine et continuent de l’image jusqu'à ce que le signal commence à baisser (normalement, cela prendra environ 20 min).
  9. Retirer les souris de IVIS tout en conservant l’anesthésie isoflurane grâce à un cône de nez et de traiter les souris avec 50 µL PBS ou 50µl inhibiteur signalisation de TGF-β (50 μg/tumeur) par injection intra-tumeur.
  10. Remettre les souris dans la cage et les laisser sur la bouillote pendant au moins 30 min. Puis placez la cage dans la salle de détention.
  11. Répétez IVIS imagerie procédure comme décrit plus haut le jour qui suit le traitement.

9. analyse des données

  1. Ouvrir les fichiers enregistré dans le logiciel Living Image .
  2. Retrouvez les informations de l’image à l’aide de vue | Informations d’image.
  3. Sélectionnez les photos prises à un moment similaire avec le même temps d’exposition. Charger des photos en tant que groupe.
  4. Décochez la case individuelle dans l' Ajustement d’Image pour normaliser l’intensité.
  5. Sélectionnez le mode Photon pour analyser l’intensité. Quantifier l’intensité du signal en sélectionnant le bouton de la Région d’intérêt (ROI) dans les Outils de ROI.
  6. Faites glisser le cercle ROI pour la région contenant le signal de bioluminescent et cliquez sur le bouton de mesure pour acquérir l’intensité du signal.

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Résultats

Vivre seule cellule imagerie in vitro

Pour évaluer avec précision l’activation de la signalisation TGF-β/Smad dans des cellules individuelles à l’aide de réactifs d’adénovirus basé, il est important de déterminer d’abord la multiplicité d’Infection (MOI) optimale pour chaque lignée cellulaire. Ministère de l’intérieur optimale est déterminée lorsque 100 % des cellules sont positifs pour l’infection adénovirale sans effets ...

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Discussion

Nous avons développé une technique permettant l’imagerie en temps réel de la signalisation TGF-β/Smad3 dans des cellules vivantes unique. En utilisant cette nouvelle méthode, nous avons déjà identifié une sous-population de cellules avec la dynamique activité transcriptionnelle de TGF-β/Smad3 associée à l’invasion améliorée et migration8. Cette méthode améliore sur les dosages traditionnels pour la signalisation TGF-β, tels que les transferts de western de la phosphorylation Smad3 et TGF-β a ciblé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêt.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Health and Medical Research Council (NHMRC) à H-JZ. TMBW est récipiendaire de la bourse postdoctorale Australie le gouvernement australien et la bourse de recharge Ann Henderson de Australian Health Rotary en partenaire avec le Rotary de Templestowe et Dine d’un remède.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMThermoFisher1881024Warm en 37 ° ; C Bain d’eau avant utilisation
Sérum fœtal bovinScientifix LifeFBS500-SChaleur inactivée avant utilisation
Recombinant Humain TGF-&beta ; 1PEPROTECH100-21Aliquote dans DDW pour obtenir une concentration finale à 10 mg/mL
Hoechst-33258Tocris Bioscience5117Diluer dans du PBS pour obtenir une concentration finale à 1 &mu ; L/mL
Luciferase Reporter Kit de dosagePromega197897Diluer 5x dans du PBS avant utilisation
LuminomètrePromega9100-002
Microscopie à fluorescence à contraste de phaseOLYMPUSIX50
Centrifugeuseeppendorf5810 R
VivoGl LuciferinPromegaP1041
IVIS Lumina III In Vivo Système d’imageriePerkinElmerCLS136334
0,5 % Trypsine-EDTA (10x)ThermoFisher15400-054Diltue à 0,05 % (1x) dans PBS
Culture cellulaire Lyse 5x RéactifPromegaE153ADilué à 1x dans DDW
10 % FormalinSigma-AldrichF5554-4L
HEK 293AThermoFisherR70507
MDA-MB-231ATCCCRM-HTB-26
PRKDC-SCIDCentre de ressources animalesSCIDF6
MatrigelCorning354234
IsofluraneZoetis26675-46-7
EthanolChem-supplyEA043-10L-P
Refresh Night TimeAllergan1750DPommade oculaire lubrifiante
SolutionComposition
Saline tamponnée au phosphate (PBS)NaH2PO4.2H2O (4 mM) ; NaHPO4 (16 mM) ; NaCl (0,12 M)
FBS-DMEM  ;5 % de chaleur inactivée FBS ; 10 &mu ; g/mL de pénicilline ; 100 &mu ; g/mL de streptomycine

Références

  1. Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
  2. Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
  3. Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
  4. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
  5. Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
  6. Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
  7. Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
  8. Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50(2015).
  9. Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
  10. Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
  11. Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
  12. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
  13. Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
  14. Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  16. Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
  17. Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
  18. Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
  19. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  20. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
  21. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
  22. Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
  23. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
  24. Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
  25. Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
  26. MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
  27. Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
  28. Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
  29. de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
  30. Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
  31. Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
  32. Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
  33. Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388(2014).

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