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Article de méthode

Brûlures graves dans un modèle de porcs pour évaluation clinique vinaigrette

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DOI :

10.3791/57942

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6 novembre 2018

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Dans cet article

Résumé

À imiter étroitement le mode des brûlures requiert l’interaction entre l’observation clinique et d’études sur des modèles animaux. Dans cette étude, un modèle de porcs de brûlures graves a été créé pour évaluer un pansement expérimental dans les paramètres physiologiques et physiopathologiques.

Résumé

La cicatrisation est un processus de réparation dynamique et est le processus biologique plus complexe dans la vie humaine. En réponse à la brûlure, altérations de voies biologiques altérer la réponse de l’inflammation, ce qui entraîne une cicatrisation retardée. Troubles de la cicatrisation des plaies se produit fréquemment chez les patients diabétiques conduisant à des résultats défavorables comme l’amputation. Par conséquent, ayant un effet bénéfique dans la promotion de brûlure cicatrisation subi les apprêts sont nécessaires. Cependant, les études sur le traitement des plaies burn sont limitées en raison du manque de modèles animaux appropriés. Notre étude précédente a démontré performance de cicatrisation dans les modèles de rat et de porcs à l’aide d’une technique chirurgicale mini-invasive. Cette étude visait à démontrer un modèle porcine de graves brûlures qui élimine la contraction de la plaie et plus rapproche les processus humains de réépithélialisation et formation de nouveaux tissus. Ce protocole prévoit une procédure détaillée pour la création de graver compatible plaies et examinant les performances cicatrisant dans le traitement d’un pansement expérimental dans un modèle de la peste porcine. Six blessures de brûlure ont été créés symétriquement sur la face dorsale, qui étaient recouverts d’un pansement clinique composée de quatre couches : une couche de contact interne de matériel expérimental, une couche intermédiaire interne du film imperméable à l’eau, une couche intermédiaire externe de gaze, et une couche externe de sparadrap. À l’issue des expériences, fermeture de la plaie, région de la plaie et Vancouver cicatrice échelle score ont été examinés. Les échantillons de peau réséquée de chaque sacrifice de l’animal ont été préparées sur le plan histologique et colorées à l’aide de l’hématoxyline et éosine coloration. Activité antibactérienne de chaque pansement dans le contexte de la cicatrisation des plaies a également été examinée. L’application du pansement clinique sur les plaies en modèle porcine imite les processus biologiques de cicatrisation humaine en ce qui concerne les processus d’épithélialisation, prolifération cellulaire et l’angiogenèse. Par conséquent, ce modèle porcine fournit une méthode facile à apprendre, rentable et robuste pour évaluer l’effet des pansements cliniques des blessures graves brûlures.

Introduction

Une brûlure initie le processus inflammatoire et induit des effets pathologiques complexes, qui influencent les nombreuses fonctions du corps immédiatement après un accident, ce qui entraîne des répercussions négatives sur la qualité de vie des patients. Troubles de la cicatrisation provoque une cause de morbidité et de mortalité chez les patients avec diabète sucré1,2. La plupart des patients avec brûlures souffrent de douleurs lors de brûlures plaie débridement, qui est connu comme un processus douloureux malgré l’utilisation d’analgésiques opioïdes puissants3.

Contrairement aux autres mammifères, porcine partage plusieurs caractéristiques anatomiques et physiologiques avec les humains au sujet du processus d’épithélialisation, prolifération cellulaire et l’angiogenèse. Cela rend porcine un potentiellement meilleur modèle pour certaines procédures et les études, et ils sont souvent utilisés dans les études ultérieures qui ont démontré des résultats prometteurs chez les souris. Ces caractéristiques ont conduit à l’utilisation croissante de l’espèce porcine comme une espèce importante dans les essais précliniques. Récemment, une augmentation rapide de la recherche biomédicale avec respect à cardiovasculaire, urinaire, tégumentaire et système digestif a observé4,5,6. Cette étude vise à démontrer un modèle porcine de graves brûlures qui élimine la contraction de la plaie et fournit une approximation plus proche des plaie humaine des processus de guérison et la formation de nouveaux tissus. Six blessures de brûlure ont été créés symétriquement sur le dos, trois de chaque côté de la colonne vertébrale de la peste porcine. Ensuite, vinaigrette d’anexperimental a été étudiée dans un modèle de porcs de brûlure grave, qui peut être adaptée pour répliquer la cicatrisation humaine (Figure 1). Les blessures étaient recouverts d’un pansement clinique, qui se compose de quatre couches : une couche de contact interne de matériel expérimental, une couche intermédiaire interne du film imperméable à l’eau, une couche intermédiaire externe de gaze et une couche externe de sparadrap. Un film imperméable à l’eau maintient l’environnement humide tout en prévenant l’infection bactérienne et permettant au gaz de pénétrer le pansement. La couche intermédiaire de gaze a été appliquée sur les films imperméable à l’eau et garantie par une couche externe de sparadrap. À la fin des expériences, fermeture de la plaie, région de la plaie et échelle de cicatrice de Vancouver (VSS) score ont été examinés. Les échantillons de peau réséquée de chaque sacrifice de l’animal ont été préparées sur le plan histologique et colorées à l’aide de l’hématoxyline et éosine (HE) de coloration. Activité antibactérienne de chaque pansement dans le contexte de la cicatrisation des plaies a également été examinée dans ce modèle. Notre étude précédente a démontré des performances de cicatrisation en modèle de rat et de porcs à l’aide d’une technique chirurgicale mini-invasive7. Puisqu’il y avait que six graver des plaies sur le dos dans chaque porc, chaque pansement expérimentale a été testé et évalué dans toutes les positions afin de minimiser les biais liés à blesser le processus de guérison en différents endroits sur le dos de la peste porcine. Par conséquent, le modèle de porcine des brûlures sévères établies dans la présente étude propose une nouvelle approche pour l’évaluation des pansements cliniques et facilite le développement d’un nouveau traitement pour les brûlures. Cette étude fournit des outils essentiels pour découvrir la physiopathologie de la cicatrisation des brûlures.

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Protocole

Procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux au National Defense Medical Center, Taiwan (équipe R.O.C). Cette étude a été menée dans le centre d’Animal de laboratoire au centre médical de la défense nationale. Porcs d’un poids de 20 à 25 kg a été instrumenté avec succès à l’aide de ce protocole.

1. adaptation des animaux à la manipulation humaine

  1. Après l’arrivée dans l’établissement, abritent les animaux solitaires, mais laissez-les interagir entre eux.
  2. Fournir les animaux ad libitum accès à la nourriture et l’eau.
  3. Acclimater porcine à manipulation humaine et au transport de l’animalerie de laboratoire expérimental en gérant l’animal au moins une fois par jour pendant une semaine.
  4. Rapidement l’animal pendant au moins 12 heures avant la chirurgie pour prévenir les nausées, vomissements et aspiration des liquides de l’estomac.

2. sédation

  1. Avant la création de brûlures plaie, endormir animaux via une injection intraveineuse avec Zoletil 50 (25 mg/kg).

3. intubation et Ventilation

  1. Placez l’animal sur une table ou un chariot en position sternale.
  2. Ouvrir la bouche de l’animal avec un épandeur par voie orale.
  3. Dans le cas d’une relaxation insuffisante des mâchoires ou la présence de réflexes de déglutition, qui entravent l’intubation, masque pourceaux à l’isoflurane pour induire la sédation.
  4. Surveiller la tension artérielle, fréquence cardiaque et la température corporelle par l’analyseur de signal physiologique pendant la chirurgie pour prévenir les complications possibles.

4. anesthésie

  1. Induire et maintenir l’anesthésie ; préférence anesthésier l’animal par une injection intramusculaire de tiletamine et zolazepam (25 mg / kg + 25 mg / kg).
  2. Intuber l’animal avec la sonde endotrachéale lorsque la relaxation musculaire, caractérisée par la perte de tonus de la mâchoire et palpébrale réfléchies, a été observée.
  3. Maintenir tous les porcs dans un état d’anesthésie avec une valeur de vaporisateur de 0,5 à 2,5 % (v/v) isoflurane jusqu'à la fin de la chirurgie.
  4. Examiner la profondeur de l’anesthésie en testant les réflexes de douleur avec une pincée d’orteil postérieur avant la chirurgie. Lorsque cela est nécessaire, ajoutez anesthésie supplémentaire ou attendre quelques minutes. Vérifier les réflexes de douleur régulièrement tout au long de la chirurgie.

5. stérilisation du Site chirurgical

  1. Se raser et nettoyer la peau de l’animal sur une superficie d’environ 25 cm de largeur de la colonne vertébrale tout le chemin à l’aisselle des deux côtés.
  2. Frotter la peau hydratée avec gommage povidone-iode (75 mg/mL) pendant environ 5 min.
  3. Enlever le savon povidone-iode de la peau à l’aide de gaze stérile humide.
  4. Stériliser la peau avec la lotion de povidone-iode (100 mg/mL).
  5. Couvrir l’animal avec des draps chirurgicaux stériles pour réduire le transfert de bactéries et de contamination ultérieure du site chirurgical.

6. brûler la plaie création

  1. Utilisez un marqueur chirurgical pour marquer le Centre des six blessures brûlures symétriquement sur le dos du cochon. Veiller à ce que la distance entre chaque plaie brûlure est au moins supérieure au rayon de la plaie (Figure 1 a).
  2. Remplir une mis à jour le fer à souder avec 50 mL de glycérine et insérer un thermomètre électronique dedans pour surveiller la température. Le fer chaud possède une zone plate d’environ 9 cm2 (Figure 1 b).
  3. Chauffer le fer à 137 et 139 ° C avec une plaque chauffante (Figure 1).
  4. Créer six blessures brûlures uniforme de poser le fer sur la zone indiquée sans appliquer aucune force pendant 30 secondes (Figure 1).
  5. Laver les plaies de brûlure avec la solution saline à 0,9 % (Figure 1).
  6. Mesurer les dimensions de la plaie et d’enregistrer la plaie de la photomicrographie (Figure 1E).

7. préparation de vinaigrettes

  1. Couvrir chaque plaie avec la couche intérieure de contact d’un pansement clinique quatre couches par contact direct. Pour cette couche, utilisez la sauce contenant des CAPS ou des matériaux alternatifs (Figure 1F).
  2. Appliquer une couche imperméable à l’eau sur le pansement clinique pour servir comme une barrière contre la pénétration bactérienne (Figure 1F).
  3. Couvrir chaque plaie avec de la gaze (0,5 cm d’épaisseur) et fixer avec du ruban de papier pour servir de la couche intermédiaire du pansement (Figure 1).
  4. Fixer la gaze avec une couche externe de sparadrap. Étendre cette couche au torse pour éviter le déplacement du pansement (Figure 1 H-1J).

8. les soins aux brûlés et mesure

  1. Injecter le porc avec la buprénorphine (0,1 mg/kg, IM) pour la gestion de la douleur pour chaque 8-12 h, départ avant la récupération de l’anesthésie, pendant une semaine réduire la douleur potentielle.
  2. Permettre l’accès libre de cochon à nourrir et abreuver.
  3. Changer les pansements cliniques tous les 2 jours pour les 10 premiers jours et ensuite deux fois par semaine pendant la 6 semaines d’étude.
  4. Nettoyer et mesurer les plaies avant de rebrancher les pansements cliniques. Administrer les anesthésiques lors des changements de pansement.
  5. Enregistrer la plaie de la photomicrographie pour comparaison des taux de guérison de blessure, tous les 2 jours pour les 10 premiers jours et ensuite deux fois par semaine pendant la 6 semaines d’étude.
  6. Calculez votre plaie ré-épithélialisation ou contraction sous forme de pourcentage de la taille originale de la plaie selon une méthode décrite précédemment. L’analyse de la fermeture de la plaie a été menée d’une manière double aveugle.
  7. Mesurer la cicatrice de brûlure à l’aide de VSS, qui se compose de quatre variables : vascularité, hauteur (épaisseur), souplesse et la pigmentation post combustion les jours 0, 7, 21 et 42. Chaque variable possède quatre à six scores possibles. Total score va de 0 à 14, selon laquelle un score de 0 reflète la peau normale.

9. les bactéries expériences des tissus après brûlures

  1. Tamponner la plaie pour tester antibactérien à brûler après jours 0, 7, 21 et 42.
  2. Placer l’écouvillon dans 100 mL d’une solution saline 0,9 % stérile et doucement vortex pour obtenir une suspension homogène.
  3. En série, diluer (−1– 10 10−5) l’homogénat et plaque 100 μl de chaque dilution dans les milieux sélectifs et non sélectifs, respectivement.
  4. Incuber toutes les dilutions en aérobie à 37 ° C pendant 24 à 72 heures.
  5. Plaque triple aliquots de 10 μl de toutes les dilutions sur gélose au sang additionnée de sang de mouton de 5 % pour isoler des organismes aérobies Gram-positifs.
  6. Incuber l’échantillon par épandage ou verser l’échantillon uniformément sur la surface d’une gélose durant la nuit pour déterminer le nombre de formatrices unités (UFC).
  7. Lire les plaques après incubation pendant la nuit. Inverser la gélose au sang de mouton et diviser le fond du plat en quatre quadrants égales à l’aide d’un marqueur et une petite règle.
  8. Placez la plaque sur la scène d’un microscope à dissection et compter les colonies sur chaque plaque. Par définition, une colonie doit avoir un minimum de 300 UFC seront énumérés.
  9. Compter les colonies bactériennes dans chacune des trois répliques. Calculer que la valeur moyenne des trois réplicats. Déterminer l’UFC par plaque en multipliant la valeur moyenne par le facteur de dilution finale.

10. euthanasie et Fixation du tissu

  1. Par voie intraveineuse, injecter une dose excessive de solution de l’euthanasie de pentobarbital de sodium (80 à 120 mg/kg).
  2. Effectuer en bloc l’excision du tissu plaie brûlure d’inclure la musculature sous-jacente et non blessés de tissu environnant.
  3. Difficulté tissus avec 10 % de formol tamponné neutre.
    1. Mélanger 10 mL de formaldéhyde (37 %), 90 ml de la solution tamponnée au phosphate (PBS) et magasin à 4 ° C.
    2. Transfert des tissus de fixateur et agiter le récipient afin de s’assurer que tous les tissus sont complètement immergés dans le fixateur. Le volume du fixateur doit être 30 fois le volume de tissu.
    3. Fixer des tissus durant la nuit à 4 ° c.
  4. Déshydrater les tissus avec de l’éthanol et les intégrer dans des blocs de paraffine. Effectuez les opérations suivantes à 4 ° c dans un agitateur.
    1. Laver deux fois avec du PBS pendant 30 minutes.
    2. Déshydrater les tissus avec l’éthanol à 70 % pour 8 heures, éthanol à 80 % du jour au lendemain, l’éthanol à 95 % pendant 8 heures, puis dans l’éthanol à 100 % du jour au lendemain.
    3. Incuber les tissus en 100 % éthanol pendant encore 8 heures.
    4. Incuber les tissus en trois changements de xylène chaque 30 minutes.
    5. Remplacez le xylène avec de la cire fondue fraîchement (52 ° C) et laisser incuber à 52 ° C dans un four pendant 1 heure.
    6. Remplacer la cire à la cire douce et incuber à 52 ° C dans une étuve pendant 3 heures et puis remplacer une fois de plus et incuber à 52 ° C durant la nuit.
    7. Incuber les tissus avec deux modifications plus de cire chaque pendant 1 heure, puis incorporez le tissu et conserver à 4 ° C.
  5. Couper et colorer les sections de paraffine avec il visualiser via un microscope photonique avec 100× grossissement.
    1. Créer des sections de paraffine à l’aide d’un microtome rotatif.
    2. Déparaffinage sections avec trois changements de xylène chaque pendant 3 minutes.
    3. Réhydrater les tissus 100 %, 95 %, 80 % et 70 % éthanol chaque pendant 3 minutes et ensuite plonger dans l’eau distillée.
    4. Coloration à l’hématoxyline pendant 10 minutes et puis rincer à l’eau courante.
    5. Faire la différence avec de l’éthanol de l’acide chlorhydrique 0,1 % pendant 5 minutes et rincer à l’eau du robinet.
    6. Coloration à l’éosine 0,5 % pendant 1 minute.
    7. Déshydrater les tissus avec de l’éthanol 70 %, 80 %, 95 % et 100 % chaque pendant 2 minutes.
    8. Effacer la souillure avec xylène et sécher sous hotte.

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Résultats

Durée de combustion de 30 secondes par le fer chaud a entraîné des blessures qui ont été uniformément pâle avec une jante de l’érythème (Figure 1) et circulaire avec une marge bien définie. Au sein de chaque animal, il y avait six blessures brûlures sur le dos. L’arrangement des brûlures blessures était représenté à la Figure 1 K. Brûlures blessures étaient complètement recouverts de pansement contenant des casquettes et utilisés...

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Discussion

La présente étude établi un modèle de porcs de graves brûlures et a examiné le modèle à l’aide d’un pansement contenant des CAPS. Nos résultats indiquent que ce modèle de porc peut être utilisé pour surveiller la performance clinique des pansements expérimentaux, y compris la propriété antibactérienne. La cicatrisation des taux, la fermeture de la plaie et activité antibactérienne ont été analysée à l’aide de VSS, H & E test de coloration et antibactérien. L’utilisation de modèles animaux burn a été conçue comme un outil...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par une subvention de l’hôpital général de tri-service ; National Defense Medical Center, Taiwan (TSGH-C107-042) ; Ministère de la Science et de technologie, Taïwan (la plupart 106-2314-B-016-014) ; et le National Defense Medical Center (MAB-106-055 ; MAB-106-010 ; MAB-107-064).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sédation :
KétamineMerial2528 ESP 10mL flacon
AzaperoneChina chemical & pharmaceutical47W406100 mL flacon
Atropine  ;Oriental chemical worksIN120802 flacon de1 mL
Anesthésique :
Tiletamine+ZolazépamVirbacBC91Flacon de 5 mL
IsofluraneBaxterN002A225100 mL flacon
Chirurgie :
Tondeuse à cheveuxMoser--
Povidone solution de gommage iodéEver starHA161202baril de 4 L
Fer modifié---solution
saline à 0,9 %CHI SHENGKC130500 mL flacon de
gazeChine Pansements chirurgicaux Centre MO1590008010 x10 cm
CAPSCoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipei--
Papier rubanadhésif 3MNDC-8333-1530-012,5 cm x 9,1m
Film imperméable3MNDC-8333-1600-4010 cm x 10 m
Plâtre adhésifBH1426015chimique Young10 cm x 10 m
Dissection :
Paire de ciseaux droits standard tranchants/émoussés (14 cm)InstrumentsShinetec ST-S114-
Halstead-Mosquito (12,5 cm)Instruments ShinetecST-H012-Poignée
(# 4)InstrumentsShinetec ST-H004-Lame
chirurgicale(#21)Instruments ShinetecST-B021-
Post-Fixation & Stockage :
50 ml Tube à centrifuger en plastique  ;Falcon352070-10
 % neutre formalin tamponnéLeica3800604EG-
expériences de croissance bactérienne  ;
Plaque de gélose au sang (BAP) (TSA avec 5 % de sang de mouton)  ;CMP-90mm Mono

Références

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