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Génération et sur demande d’Initiation dactivité Ictal aiguë de rongeurs et de tissus humains

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DOI :

10.3791/57952

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19 janvier 2019

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1Division of Fundamental Neurobiology, Krembil Research Institute, 2Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Division of Neurosurgery, Department of Surgery, University of Toronto, 5Division of Neurology, Department of Medicine, University of Toronto, 6Department of Physiology, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

Modèles de crise aiguë sont importantes pour étudier les mécanismes qui sous-tendent les manifestations épileptiformes. En outre, la capacité de générer des événements épileptiforme sur demande fournit une méthode très efficace pour étudier le déroulement exact des événements qui sous-tendent leur initiation. Nous décrivons ici les modèles de saisie corticale aiguë 4-aminopyridine établies dans la souris et de tissus humains.

Résumé

Contrôler les convulsions reste un problème épineux pour la communauté médicale. Pour progresser, les chercheurs doivent un moyen largement étudier la saisie dynamique et étudier ses mécanismes sous-jacents. Modèles de crise aiguë sont confortables et offrent la possibilité d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques peuvent générer une grande quantité d’électrographiques saisie-comme des événements (ictales). Les résultats prometteurs des modèles de crise aiguë peuvent ensuite être avancés aux modèles de l’épilepsie chronique et essais cliniques. Ainsi, étudier les saisies dans les modèles aiguës qui reproduisent fidèlement les signatures électrographiques et dynamiques d’une saisie clinique sera essentielle pour tirer des conclusions pertinentes sur le plan clinique. Études individualisées d’événements dans la crise aiguë de modèles préparés à partir de tissus humains est aussi important pour tirer des conclusions qui sont cliniquement pertinentes. Le principal but de cet article est sur le modèle 4-AP cortical en raison de sa polyvalence dans la génération d’événements ictales études tant in vivo et in vitro , ainsi que dans les souris et les tissus humains. Les méthodes dans cet article également décrira une méthode alternative d’induction de saisie en utilisant le modèle2 + zéro-Mg et fournir un aperçu détaillé des avantages et les limites de l’activité épileptiforme générée dans les différents aiguë modèles de saisie. En outre, en tirant parti des optogenetic disponible dans le commerce des souches de souris, une impulsion de lumière en bref (30 ms) peut servir à déclencher un événement ictal identique à celles qui se produisent spontanément. De même, bouffées de 30 à 100 ms de neurotransmetteurs (acide Gamma-Amino butyrique ou glutamate) peuvent être appliquées au tissu humain pour déclencher des événements individualisées qui sont identiques à celles qui se produisent spontanément. La possibilité de déclencher des événements individualisées à la demande dans des modèles de crise aiguë offre la possibilité retrouvée pour observer le déroulement exact des événements qui sous-tendent la dynamique de saisie initiation et évaluer efficacement des thérapies potentielles anti-crise.

Introduction

Modèles de crise aiguë peuvent reproduire avec succès électrographiques signatures qui rappelle des événements ictales observés à l’électroencéphalographie (EEG) des individus touchés par une crise d’épilepsie. Chercheurs utilisent ces événements de type ictal (ci-après dénommés « événements ictales ») comme substituts pour la saisie d’événement1. Cliniquement, les événements ictales font comme une approximation fiable des événements saisie puisque les saisies sont un trouble neurologique qui provient du cerveau. Dans l’unité de surveillance de l’épilepsie, neurologues s’appuient sur la détection d’événements individualisées pour confirmer la zone épileptogène du cerveau et l’isoler pour résection2. Dans l’unité de soins intensifs, médecins de surveillent l’activité ictale afin d’évaluer si toute activité de crise persiste dans la sédation des patients3. Contrôle des saisies n’est toujours pas un problème épineux pour la communauté médicale, que 30 % des patients épileptiques sont multirésistante aux médicaments disponibles4,5, et 10 % sont des cas médicaux impliquant des saisies de drogue-induite ne répond pas au traitement standard3. Cela représente une préoccupation majeure pour la société, que 10 % de la population américaine est prospecté pour vivre un événement de saisie au cours de leur vie, et 3 % sont censés développer l’épilepsie6.

Étudier les saisies dans les modèles d’épilepsie chronique est coûteux, laborieux et souvent prendre des mois pour préparer7. Il est également difficile d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques en se déplaçant librement les animaux. Des essais cliniques humains font face à des questions similaires, ainsi que les complexités supplémentaires liées au consentement du patient, la variabilité des arrière-plans des participants et les considérations morales et éthiques impliqués8. Modèles de crise aiguë, en revanche, sont favorables car ils sont relativement facile à préparer, rentable et capable de produire de grandes quantités d’activités individualisées pour étude9. En outre, le tissu est fixé dans une position stable, donc les conditions sont idéales pour effectuer les enregistrements électrophysiologiques nécessaires d’étudier la dynamique de saisie et de la physiopathologie sous-jacente connexe. Modèles de crise aiguë restent favorables par rapport aux modèles in silico (ordinateur) car ils sont basés sur du matériel biologique composée constituant réseau neuronal du cerveau avec tous ses facteurs inhérents et la connectivité synaptique, qui ne peut pas être capturée par ordinateur les plus détaillée des modèles10. Ces caractéristiques font des modèles de crise aiguë s’apprête à être efficace au préalable pour des thérapies potentielles anti-crise et tirer des conclusions préliminaires avant de les passer pour complément d’enquête dans les modèles de l’épilepsie chronique et essais cliniques.

En général, des modèles de crise aiguë sont tirées le tissu cérébral normal qui a été soumis à des conditions hyper excitables. Pour déclencher des événements ictales cliniquement pertinents dans le tissu cérébral sain, il est important de comprendre que le cerveau fonctionne de façon optimale dans un état critique11 où l’excitation (E) et inhibition (I) sont équilibrés12. Une perturbation de la E-je balance peut conduire à l’état de la saisie hyper excitables dans lequel les événements ictales précipitent. Par conséquent, dans ce cadre conceptuel, il y a deux grandes stratégies pour générer les événements individualisées dans des tranches de cerveau (in vitro) ou en préparation de l’ensemble du cerveau (in vivo) : soit une diminution de l’inhibition (« désinhibition ») soit augmenté excitation (« non-désinhibition »). Cependant, événements ictales sont classés hautement et synchronisé des événements nécessitant l’influence des interneurones GABAergiques d’orchestrer le réseau neuronal activité13,14. Pour cette raison, les modèles non-désinhibition sont les plus efficaces pour générer les événements individualisées dans les réseaux de neurones isolés, comme dans in vitro cerveau tranche15, alors que des modèles in vitro désinhibition souvent conduisent à activité de fortification réminiscent d’interictal comme dopante. En outre, dans ce cadre conceptuel, un événement de synchronisation momentané peut déclencher aussi sûrement un événement ictal16. En fait, un événement ictal peut être déclenché par toute perturbation mineure appliquée au système neuronal17 lorsqu’il est dans un état critique de point de transition (« bifurcation »)18. Traditionnellement, ces perturbations ont été induites par la stimulation électrique. Le développement récent d’optogenetics en neurosciences, cependant, offre maintenant une stratégie plus élégante pour provoquer l’état critique de transitions16.

Les méthodes décrites dans cet article montrent comment générer des événements individualisées à la demande dans des modèles de crise aiguë pour in vitro (étape 1 du protocole) et des études in vivo (étape 2 du protocole). Elles impliquent le choix de la région du cerveau, méthode de saisie induction, type d’étude et des espèces ; Toutefois, l’accent sera mis sur le choix recommandé d’un modèle aiguë 4-AP corticale saisie en raison de sa polyvalence dans une grande variété de types d’étude. Le modèle de saisie 4-AP aiguë in vitro est basé sur le protocole standard utilisé pour préparer des coupes de cerveau de haute qualité pour des enregistrements électrophysiologiques et imagerie études19. Ces protocoles ont déjà été utilisés pour faire in vitro coronale tranches de cerveau du cortex somato-motrice des souris16,20 et les humains21. Modifications pour générer les événements individualisées dans ces types de tranches de cerveau ont été démontrées précédemment16 et tous les détails sont décrits dans le protocole ci-dessous. Le modèle de saisie corticale 4-AP aiguë in vivo est basé sur le protocole standard utilisé pour préparer une craniotomie pour imagerie études22. La modification est que sans fenêtre (lame de verre) est installé après la craniotomie. Au lieu de cela, proconvulsantes agents (4-AP) sont par voie topique appliqués au cortex exposé pour induire des événements ictales tandis que l’animal est sous anesthésie générale. À notre connaissance, notre groupe a été le premier à développer ce modèle de saisie corticale aiguë in vivo dans la souris16,23. Le modèle 4-AP saisie corticale aiguë in vivo préparé à partir de souris adultes a été développé pour compléter le modèle de tranches in vitro de tissus juvéniles. La réplication des résultats dans le modèle de saisie adultes in vivo permet de généraliser les résultats de modèles tranches en abordant les préoccupations inhérentes au sujet des conditions non physiologiques d’une tranche de cerveau 2D (par rapport à un 3-d ensemble-cerveau structure) et les différences physiologiques entre les tissus adultes et juvéniles.

La méthode d’ouverture de l’événement individualisées à la demande est démontrée à l’aide de deux bouffées de neurotransmetteurs avec une stratégies de picospritzer ou optogenetic. Au meilleur de nos connaissances, notre groupe est le premier à déclencher des événements individualisées dans les tissus humains, à l’aide de neurotransmetteurs via un picospritzer16. Stratégies d’optogenetic, la souche de souris C57BL/6 est la souche classique utilisée pour exprimer des transgènes. L’expression de channelrhodopsin-2 (ChR2) en interneurones GABAergiques ou cellules pyramidales glutamatergique fournira la possibilité en option pour générer des événements individualisées à la demande avec des impulsions de lumière brèves. Les souches de souris optogenetic appropriés sont la variante C57BL/6 disponible dans le commerce qui exprime le ChR2 en soit interneurones, à l’aide de la souris vésiculaire GABA transporter entre promoteurs (VGAT)24, ou cellules pyramidales, à l’aide de l’antigène des cellules du thymus souris 1 promoteur (Thy1)25. Ces souris VGAT-ChR2 et Thy1-ChR2 commercialement disponibles offrent la possibilité d’activer les neurones GABAergiques ou les neurones glutamatergiques, respectivement, dans le néocortex et le fil bleu (470 nm) lumière. La capacité de générer des événements individualisées à la demande dans des modèles de crise aiguë peut offrir de nouvelles possibilités pour étudier la dynamique de saisie initiation et évaluer efficacement des thérapies potentielles anti-crise.

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Protocole

Toute recherche sur des patients a été réalisée en vertu d’un protocole approuvé par l’University Health Network Research Ethics Board conformément à la déclaration d’Helsinki. Procédures impliquant des animaux étaient conformes aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et approuvé par le Comité de protection des animaux Krembil recherche Institut.

1. le protocole I: aigu In vitro le modèle de saisie

  1. Préparation de solutions de dissection et le liquide céphalorachidien artificiel
    1. Carbogenate eau ultrapure (ce qui est de l’eau filtrée avec une résistivité de 18,2 MΩ·cm) avec carbogen (95 % O25 % CO2) pendant 5 min à l’aide d’air diffuseurs de bulles Pierre (aérateurs pour les aquariums).
      Remarque : Pierres à Air peuvent être connectés à la carbogen du réservoir régulateur via standard tube en silicone. Si n’existent pas de pierres à air, joint ferme l’extrémité du tuyau silicone et pousser des petits trous dans le joint pour permettre au gaz carbogen bulles dehors et carbogenate la solution.
    2. Préparer une solution de dissection en dissolvant les solutés du tableau 1 dans l’eau ultrapure. Ajouter CaCl2 à une solution qui a été carbogenated pendant au moins 5 min pour l’aider à se dissoudre.
      Note : Ajouter alternativement, CaCl2 tout d’abord, afin qu’il peut se dissoudre facilement dans une solution non saturée. La solution, sous forme liquide, devrait être 300-320 mOsm/L et avoir un pH de 7.4 après étant saturé avec carbogen.
      1. Refroidir la solution de dissection à 0 - 4 ° C. Laisser la solution dans le réfrigérateur pendant la nuit ou placer la solution dans le congélateur pendant 1 h et surveiller en permanence la température.
        Remarque : La solution de dissection peut être conservée pendant jusqu'à 3 nuits ; jeter par la suite.
      2. Carbogenate la solution de dissection pendant 5-10 min avant utilisation.
        Note : Idéalement, la solution doit apparaître soit sur neige fondante ou être en transition pour la neige fondue avant utilisation.
    3. Préparer rongeur liquide céphalo-rachidien artificiel (FSCA) en dissolvant les solutés du tableau 2 (ou 3 Table pour FSCA humaine) dans de l’eau ultrapure. Carbogenate la solution FSCA alors qu’il est dans un bain d’eau chauffé à 35 ° C jusqu'à l’utilisation. Ajouter CaCl2 à une solution qui a été carbogenated pendant au moins 5 min pour l’aider à se dissoudre.
      Note : Ajouter alternativement, CaCl2 tout d’abord afin qu’il peut se dissoudre plus facilement dans une solution non saturée. La solution, sous forme liquide, doit être 290-320 mOsm/L et ont un pH de 7.4 après étant saturé avec carbogen. Il faudrait des solutions dans les volumes 1, 2 ou 4 L en fonction de la durée des expériences. Faire 4 L pour une journée (8 h), d’expériences. L’ACSF convient frais chaque jour ; ne pas stocker plus de 1D.
  2. Dissection de la souris pour collecter des tissus cérébraux
    Remarque : Pour les tissus humains, passez à l’étape suivante (étape 1.3) pour faire des tranches de cerveau avec le vibratome. Les blocs cubiques (1 cm3) du tissu cérébral doivent provenir le neurochirurgien à l’aide des procédures décrites précédemment26,27.
    1. Recueillir tous les outils et matériaux nécessaires pour les dissections animales. Mettre en place l’espace de travail pour préparer les dissections animales.
      1. Vérifier le réservoir de carbogen (95 %O2/5%CO2) pour s’assurer que ce n’est pas vide. Remplacer la bouteille de gaz avant expériences s’il y a moins de 500 lb/po2 de pression résiduelle.
      2. Calibrer le vibratome (vibrant trancheuse de tissu lame) selon le manuel d’instructions du fabricant. Ajuster le vibratome affectant à avoir une amplitude de coupe de 1 mm et une vitesse de coupe de 0,12 mm/s.
        Remarque : Les paramètres optimaux peuvent être différent pour chaque chaque couteau à lames vibrantes tissus ; Cependant, en général, l’amplitude doit être élevée et la vitesse de coupe doit être faible.
      3. Remplir la chambre d’incubation de la tranche cerveau (c.-à-d., le gardien de tranches de cerveau) avec FSCA et il bulle avec carbogen. Placez ensuite la chambre d’incubation dans un bain d’eau à 35 ° C.
        Remarque : Utilisez le rongeur FSCA pour coupes de cerveau de rongeurs et les humain FSCA pour des tranches de cerveau humain.
    2. Obtenir une souris pour mineurs des deux sexes, âgés de 13 d (p13) à 21 jours (p21, où p0 est la date de naissance).
    3. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital de sodium (55 mg/kg de poids corporel). Une fois que la souris est profondément anesthésiée, comme en témoigne l’absence du réflexe orteil pincée, rapidement utiliser un instrument de guillotine vétérinaire agréé pour décapiter la souris dans un mouvement rapide.
      Remarque : Préparer l’injection de pentobarbital de sodium selon les procédures recommandées par les directives institutionnelles.
    4. Maintenir le nez de la souris pour stabiliser la tête décapitée et doucement faire une incision médiane de départ entre les yeux de la souris et sur toute la longueur du cuir chevelu pour exposer le crâne. S’assurer que le crâne n’est pas écrasé par la pression exercée par le rasoir. Le coin du fil du rasoir permet d’augmenter la précision de coupe.
    5. Écarter les lambeaux de cuir chevelu de la souris, en utilisant les doigts pour exposer le crâne. Ensuite, utilisez le coin frais d’un fil du rasoir pour pratiquer une incision le long de la ligne médiane du crâne ; être très attentif pour éviter tout contact avec le cortex cérébral.
    6. Forceps splinter insert dans les orbites de la souris pour stabiliser la tête décapitée et placez-le dans une boîte de pétri remplie de froid (0 - 4 ° C) solution de dissection. Veiller à ce que la tête est entièrement immergée dans la solution de dissection.
    7. Utilisez un deuxième ensemble de pinces de splinter doucement décollez le cuir chevelu de la souris, retirer l’os du nez de peeling il et enlevez le dos (côté caudal) du crâne.
      Remarque : L’os du nez de souris juvéniles est très souple et facilement cassables.
    8. Utilisez une spatule micro pour couper les nerfs optiques, trijumeau nerfs et la moelle épinière. Ensuite, utilisez la spatule micro doucement séparer le cerveau et le crâne. Laisser le cerveau complètement submergé dans la boîte de pétri remplie de solution de dissection.
  3. Préparation de tranches de cortex du cortex somatosensoriel-motor
    1. Remplir le bac tampon du vibratome ~ 150 ml de froid (0 - 4° C) solution de dissection.
      Note : Gardez éventuellement le bac tampon dans le congélateur jusqu'à ce que nécessaire pour maintenir une température basse pendant la procédure de tranchage.
    2. Coller le tissu de cerveau de souris ou l’homme sur la scène de vibratome (spécimen porte/tiroir) à l’aide de colle instantanée. Pour les souris, coupez une petite portion caudale du cerveau (c.-à-d., le cervelet) afin qu’il peut être facilement collée à plat sur le porte-échantillon (permettant la partie rostrale du cerveau pour faire face au plafond).
      Remarque : Vous pouvez également coupes de cerveau de souris horizontal peuvent être préparés par collage de la face dorsale du cerveau sur le porte-échantillon (la face ventrale du cerveau doit faire face au plafond)28.
    3. Placez doucement le porte-échantillon (avec le tissu de cerveau) dans le bac tampon. Veiller à ce que la partie dorsale du cerveau fait face à lame du vibratome.
      Remarque : Il est essentiel de réduire la quantité de temps, que le cerveau est exposé à l’air.
  4. Sectionnement de tissus du cerveau et de la collection
    1. Tranchez le cerveau en tranches épaisses de 450 μm utilisant le vibratome dans la partie dorsale de direction ventrale. Veiller à ce que le cerveau reste complètement ancré dans le plateau de spécimen tout en découpage il.
      1. Faire la première coupe dans le cerveau de souris pour enlever le bulbe olfactif. Ensuite, faire des coupes successives jusqu'à ce que la zone de somato-motrice est observée (situé approximativement à mi-chemin entre le bulbe olfactif et le bregma).
        Remarque : En option, tranche le cerveau en minces tranches (200 μm) jusqu'à ce que le corps calleux apparaît dans la vue coronale du cerveau, ce qui indique que la zone de somato-motrice est étroite.
    2. Utiliser une pipette de transfert large calibre pour collecter les tranches coronales (450 μm) qui contiennent l’aire somato-motrice et les immerger dans une boîte de pétri contenant froid (0 - 4 ° C) solution de dissection.
    3. Utiliser une lame de rasoir neuve et couper n’importe quel excès de tissu de tranches. Pour les tranches coronales de souris, effectuer une transversale coupée juste en dessous de la commissure néocorticale (c.-à-d., corps calleux). Ne pas couper dans un mouvement de sciage ; simplement appliquer une pression sur la lame dans le tissu et utilisez une brosse détaillant pour séparer délicatement le tissu. Veillez à réduire au minimum le mouvement de la tranche de dentine.
    4. Utiliser une pipette de transfert de l’échelle-alésage de transférer la partie dorsale des tranches coronales qui contiennent le néocortex (couche 1-6) pour une deuxième boîte de pétri remplie de chaud (35 ° C) FSCA pour un moment (~ 1 s). Puis, rapidement transférer les tranches à une chambre d’incubation contenant tiède (35 ° C) carbogenated FSCA.
      Remarque : Le but du transfert dans la boîte de pétri avec l’ACSF est pour réduire au minimum le transfert de solution de dissection à la chambre d’incubation pendant le transfert des tranches de cerveau avec la pipette de l’échelle. Utiliser la chambre d’incubation plusieurs puits de garder des tranches de cerveau différents organisés.
    5. Jeter le reste du cerveau et de carcasse d’animal conformément aux directives institutionnelles.
  5. Incubation et entretien
    1. Laissez les tranches de cerveau légèrement immergées dans la chambre d’incubation à 35 ° C pendant 30 min. Ensuite, retirer la chambre d’incubation du bain-marie et laisser revenir à température ambiante (20-25 ° C). Attendre 1 h pour les tranches de cerveau de récupérer avant d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques.
      Remarque : n’Assurez-vous qu’aucune bulle d’air qui recueillent sous les tranches de cerveau dans la chambre d’incubation. Bulles d’air sont des interfaces d’air qui provoquent des lésions tissulaires. Les coupes de cerveau de souris peuvent être maintenus pendant 6 à 8 heures, alors que le tissu de cerveau humain peut être stocké pendant 24 h dans une chambre d’incubation bien-carbogenated avec le FSCA approprié.
  6. Enregistrements électrophysiologiques de la couche corticale superficielle
    Remarque : Ictal événements sont observés dans les enregistrements de (LFP) potentiels de champ local extracellulaire des tranches de cerveau. La LFP de la tranche de cerveau peut être observée et enregistrée avec une interface type chambre29 ou un système de submergé plusieurs électrodes (MEA)16. La procédure a été décrit précédemment16 et des détails supplémentaires sont décrits ci-dessous.
    1. Utiliser une pipette de transfert large-alésage ou une brosse détaillant pour déplacer une tranche de cerveau sur du papier légèrement plus grand objectif prédécoupé qui se tient en place à l’aide d’une pince dentaire. Transférer le papier de la lentille (qui est incombant à la tranche de cerveau) à la chambre d’enregistrement et le bloquer en position avec un écran de harpe.
    2. Exécution de chaud (35 ° C), perfusat FSCA carbogenated dans la chambre d’enregistrement sur la tranche de cerveau à raison de 3 mL/min (~ 1 goutte à goutte/s). Utilisez un thermomètre numérique pour que la chambre d’enregistrement soit 33-36° C.
    3. Retirer les électrodes de verre avec une impédance de 1-3 MΩ partir de tubes en verre borosilicaté (avec un diamètre extérieur de 1,5 mm) à l’aide d’un extracteur. Remblayer les électrodes de verre avec ACSF (~ 10 µL) à l’aide d’une seringue de Hamilton. Jeter immédiatement l’électrode si la pointe est endommagée.
      Remarque : Le fil d’argent (5 min) d’eau de Javel et ne permettre qu’une partie minime (par exemple, la pointe) du fil d’argent à être submergés dans les électrodes de verre remplaçant ou une remplaçante FSCA pour minimiser le bruit et la dérive durant les enregistrements. Retirez tout excès FSCA de l’électrode de verre avec une seringue de Hamilton si nécessaire.
    4. Utiliser un microscope stéréo de 20 X guide avec précision de l’électrode de verre enregistrement dans le superficiel corticale couche (2/3) à l’aide des manipulateurs manuels. Enregistrement/afficher l’activité électrique de la tranche de cerveau sur un ordinateur avec le logiciel standard.
      Remarque : Tranches de Viable (haute qualité) cerveau exposera un solide potentiel évoqué en réponse à le stimuli électriques appliquées (100 µs, 30-300 μA) ou des impulsions de lumière (30 ms, 10 mW/mm2) pour optogenetic des tissus.
  7. Induction de saisie comme les activités
    1. Perfuse FSCA contenant 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) au-dessus de la tranche de cerveau. Dissoudre 80 mg de 4-AP en 8,5 mL d’eau pour faire une solution stock de 100 mM 4-AP. ajouter 100 µL de solution étalon de 100 mM 4-AP dans 100 mL de FSCA pour atteindre un perfusat FSCA avec 100 µM 4-AP.
      Remarque : Utiliser alternativement, zéro-Mg2 + ACSF (tableau 4), une solution de FSCA modifiée contenant aucune addition Mg2 +, à perfuse la tranche de cerveau. Pour les tissus humains, utiliser une combinaison de 100 µM 4-AP en zéro-Mg2 + FSCA humaine (tableau 5) pour atteindre des résultats optimaux. Le temps moyen que les événements ictales apparaissent est 15 min ; Toutefois, il peut prendre jusqu'à 40 min pour quelques tranches de cerveau.
  8. Génération de saisie à la demande : une stratégie d’optogenetic pour optogenetic souris
    1. Appliquer une impulsion brève (30 ms) de bleu (470 nm) light (avec une intensité de sortie minimale 1 mW/mm2 ) pour initier un événement ictal. Utilisez un manipulateur manuel pour positionner une fibre optique à diamètre 1 000 µm core (0,39 NA) directement au-dessus de la région de l’enregistrement.
      Remarque : Fixer le taux de la photo-stimulation pour faire correspondre le taux souhaité de l’occurrence de l’événement ictal (c.-à-d., 1 impulsion toutes les 50 s). Toutefois, le taux ne peut pas être trop exagéré du taux intrinsèque à laquelle ictales événements se produisent.
  9. Génération de saisie à la demande : une stratégie de non-optogenetic de tissus humains
    1. Placer la tranche de cerveau afin que les couches superficielles sont en amont, et les couches profondes sont en aval de l’écoulement du perfusat dans la chambre d’enregistrement.
    2. Tirez une électrode de verre (le même type que celui utilisé pour les enregistrements de la LFP) et touchez légèrement avec un chiffon de la délicate tâche de créer une petite ouverture à son extrémité. Remblayez l’électrode avec ~ 25 µL de 100 mM GABA (dissous dans l’eau) et l’attacher à la picospritzer. Alternativement, remblayer l’électrode à 200 µM de glutamate (dissous dans l’eau).
      Remarque : Pour estimer le volume étant soufflé de la picospritzer (~ 50 µL), appliquer une bouffée de test sur une plaque de plastique (de préférence maillée). Ensuite, appliquez une goutte de volumes connus (p. ex., 10 µL, 20 µL, 50 µL ou 100 µL) avec une pipette pour une comparaison avec la bouffée de test.
    3. Appliquer bouffées du neurotransmetteur (GABA ou glutamate) au tissu humain avec un picospritzer (10-20 lb/po2 pour 30 à 100 ms) pour initialiser un événement ictal. Appliquer une seule bouffée de 100 mM GABA sur la couche profonde (5) du tissu cérébral pour générer des événements individualisées dans la couche superficielle (2/3). Vous pouvez également appliquer une seule bouffée de 200 µM glutamate directement sur la couche superficielle pour générer des événements individualisées dans la couche superficielle.
      Remarque : Fixer le taux de la picospritzer feuilletée pour faire correspondre le taux souhaité de l’occurrence de l’événement ictal (c.-à-d., 1 impulsion toutes les 50 s). Toutefois, le taux ne peut pas être trop exagéré du taux intrinsèque à laquelle ictales événements se produisent.

2. le protocole II : Aiguë In vivo modèle de saisie

  1. Chirurgie et préparation chirurgicale
    1. Obtenir une souris adulte (p35 - p60) des deux sexes.
    2. Profondément anesthésier la souris avec la kétamine (95 mg/kg) et de Xylazine (5 mg/kg). Effectuer le test du réflexe orteil-pincement afin de s’assurer que la souris est sous sédation. Sinon, utiliser l’isoflurane (4 % pour l’induction, 1,5 à 2 % pour la chirurgie) pour anesthésier la souris.
      Remarque : Le choix des anesthésiques peut avoir un impact la saisie activité30,31.
    3. Montez la souris dans un cadre stéréotaxique en obtenant sa tête avec barres d’oreilles. Placez un coussin chauffant sous la souris pour la durée de l’intervention.
    4. Raser le dessus de la tête de la souris à l’aide d’un découpage de rongeur pour exposer le cuir chevelu. Injecter 0,3 mL de lidocaïne avec un 25 5/8 po l’aiguille dans le périoste pour éviter la douleur ou saignement excessif. Pommade oculaire aux yeux de la souris pour les empêcher de se dessécher pendant l’expérience.
    5. Pincer et soulevez le centre du cuir chevelu de la souris afin d’évaluer si ses réflexes ont disparu. Par la suite, effectuer horizontalement d’un coupé pour exposer le bregma à région lambda du crâne. Grattez légèrement toute la zone exposée du crâne avec un coton tige pour créer une surface sèche.
    6. Effectuer une craniotomie de 4 mm de diamètre à coordonnées 2,0 mm lateromedial et mm-2,00 Rostro pour exposer le cortex somatosensoriel. Marquez l’emplacement avec un cercle (4 mm de diamètre) à l’aide d’un marqueur permanent. Perceuse autour du cercle avec une fraise dentaire pneumatique jusqu'à la couche restante de l’os de craniotomie facilement cède lorsqu’il est poussé vers le bas. Appliquer une solution saline sur la couche d’OS avant d’enlever la craniotomie avec une pince de splinter. Par la suite, appliquer une solution saline tiède à la région exposée.
  2. Méthodes d’enregistrement et induction chimique des saisies
    1. Retirer les électrodes de verre avec une impédance de 1-3 MΩ partir de tubes en verre borosilicaté (avec un diamètre extérieur de 1,5 mm) à l’aide d’un extracteur. Remblayer les électrodes de verre ~ 10 µl de FSCA ou de sérum physiologique à l’aide d’un Hamilton seringue. Jeter immédiatement l’électrode si la pointe est endommagée.
      Remarque : Le fil d’argent (5 min) d’eau de Javel et ne permettre qu’une partie minime (par exemple, la pointe) du fil d’argent à être submergés dans les électrodes de verre remplaçant ou une remplaçante FSCA pour minimiser le bruit et la dérive durant les enregistrements. Retirez tout excès FSCA de l’électrode de verre avec une seringue de Hamilton si nécessaire.
    2. Utilisez un manipulateur manuel pour guider l’électrode de verre dans le superficiel corticale couche (2/3) dans la région de somato-motrice. Enregistrement/afficher l’activité électrique de la tranche de cerveau sur un ordinateur avec le logiciel standard.
      Remarque : Couche 2/3 est environ 0,3 mm de profondeur de la surface32.
    3. Par voie topique appliquer ~0.5 mL 1,5 mM 4-AP de solution saline sur le cortex exposée de la souris avec une seringue jusqu'à ce qu’il recouvre complètement la craniotomie. Dissoudre 14 mg de 4-AP dans 100 mL d’une solution saline isotonique pour faire une solution de sérum physiologique 4-AP de 1,5 mM.
      Remarque : Préparer la solution saline 4-AP avant le début de l’expérience. En moyenne, les événements ictales apparaissent 15-30 min après l’application topique.
  3. Génération à la demande des convulsions chez les souris optogenetic
    1. Appliquer une impulsion brève (30 ms) de bleu (470 nm) light (avec une intensité de sortie minimale de 10 mW/mm2 ) pour initier un événement ictal. Utilisez un manipulateur manuel pour positionner une fibre optique à diamètre 1 000 µm core (0,39 NA) directement au-dessus de la région de l’enregistrement.
      Remarque : Fixer le taux de la photo-stimulation pour faire correspondre le taux souhaité de l’occurrence de l’événement ictal (c.-à-d., 1 impulsion chaque 300 s). Toutefois, le taux ne peut pas être trop exagéré du taux intrinsèque à laquelle ictales événements se produisent.

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Résultats

L’application de 100 µM 4-AP bonne qualité (bon état) 450 µm taille de cerveau cortical des tranches d’un juvénile VGAT-ChR2 souris fiable induite ictal événements récurrents (> 5 s) moins de 15 min (Figure 1Ai). L’application de 100 µM 4-AP des tranches de mauvaise qualité a entraîné événements de rupture ou de dopage activité (Figure 1Aii). En moyenne, 40 % des tranches de chaque cerveau de souris disséquée généré avec succè...

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Discussion

Les tranches de cerveau sont traités avec un médicament proconvulsant ou une altération perfusat FSCA pour augmenter l’excitabilité du réseau neuronal et promouvoir une précipitation des événements ictales (événements de type saisie électrographiques). Pour les souris, les tranches coronales préférés de l’aire somato-motrice doivent contenir le cortex cingulaire, zone 2 (CG), mais pas la région retrosplenial (RS) ; ces marqueurs anatomiques aident à identifier la gamme de tranches coronales qui conviennent le mieux pour ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les instituts de recherche en santé du Canada (MOP 119603 Peter L. Carlen et Taufik A. Valiante), l’Institut ontarien de cerveau (à Taufik A. Valiante) et la subvention de recherche étudiant Mightex (de Michael Chang). Nous tenons à remercier Liam Long pour son aide dans le manuscrit de vidéo de tournage. Nous aimerions reconnaître Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran et Shadini Dematagoda pour leur aide dans la compilation des figures et des tableaux dans ce manuscrit. Figures 1 a, 3 a, 4 aet 6 a sont tous les chiffres originaux fabriqués à partir des données publiées dans Chang et al. 16.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pentobarbital sodiqueN/AN/AAcheté auprès des fournisseurs de l’Hôpital Toronto Western Seringue
1 mmN/AN/AAcheté via UT Med Store
Aiguille stérile 25G 5/8"N/AN/AAcheté via UT Med Store
Lame de rasoir à un seul tranchant (2x)N/AN/AAcheté via UT Med Store
Colle adhésive instantanéeN/AN/AAcheté chez UT Med Store
Papier pour lentillesN/AN/AAcheté chez UT Med Store
Boîte de Pétri en verre (2x)N/AN/AAcheté chez UT Med Store
Pince à échardes (2x)N/AN/A Achetéchez UT Med Store
Micro spatule en PVCN/AN/AAcheté chez UT Med Med
Store Micro cuillère à bout platN/AN/AAcheté via UT Med Store
Pinceau d’esthétique 5/0N/AN/AAcheté dans une boutique d’art
Pipette de transfert à large diamètreN/AN/AAcheté via UT Med Store
Pince à épilerN/AN/AAcheté via UT Med
Store Thermomètre (numérique)N/AN/AAcheté chez Amazon.ca
Check réservoir de carbogen (95 %O2/5 %CO2)  ;N/AN/AAcheté par l’intermédiaire des fournisseurs de l’Hôpital Toronto Western
Vibratome LeicaN/AAcheté par l’intermédiaire de la chambre d’incubation par tranches de cerveau des fournisseurs de l’Hôpital Toronto Western
(alias gardien de tranches de cerveau)  ;Scientific Systems Design IncN/A
Chlorure de sodium (NaCl)N/AN/AAcheté par l’intermédiaire de UT Med Store
Bicarbonate de sodiumN/AN/AAcheté par l’intermédiaire de UT Med Store
DextroseN/AN/AAcheté par l’intermédiaire d’UT Med Store
Chlorure de potassium (KCl)N/AN/AAcheté par l’intermédiaire de UT Med Store
Sulfate de magnésium (MgSO4 H2O)N/AN/AAcheté par l’intermédiaire d’UT Med Store
Phosphate de sodium monobasique monohydraté (HNaPO4· ; H2O)N/AAcheté par l’intermédiaire de UT Med Store
Chlorure de calcium (CaCl2· ; 2H2O)N/AAcheté via UT Med Store
SucroseN/AN/AAcheté via UT Med Store
de dentaire

Références

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Mots-clés

Mod les de crises d pilepsie aigu spr paration de coupes corticalesinduction par le 4 APstimulation optog n tiqueenregistrements lectrophysiologiquesd tection d v nements ictauxr cup ration de coupes c r bralesLCR artificiel carbog ntude des m canismes des crisescriblage de th rapies anti pileptiques

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