Un dosage de Gradient de température pour déterminer les préférences thermiques de larves de drosophile

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour déterminer la température environnementale préférée des larves de drosophile à l’aide d’un gradient thermique continu.

Résumé

Beaucoup d’animaux, y compris la drosophile, Drosophila melanogaster, est capables de discriminant les plus infimes différences dans la température ambiante, ce qui leur permet de tenter de découvrir leur paysage thermique préféré. Pour définir les préférences de température des larves sur une plage linéaire définie, nous avons développé une méthode utilisant un gradient de température. Pour établir un gradient directionnel unique, deux blocs d’aluminium sont connectés à des bains d’eau indépendants, dont chacun contrôle la température des blocs individuels. Les deux blocs défini les limites inférieures et supérieures du dégradé. Le gradient de température est établi en plaçant une plaque en aluminium enduit de gel d’agarose sur les deux blocs d’eau contrôlé afin que la plaque couvre la distance entre eux. Les extrémités de la plaque d’aluminium qui est définie sur le dessus des blocs d’eau définit les températures minimales et maximales, et les régions entre les deux blocs forment un dégradé linéaire de la température. Le test de gradient peut être appliqué à des larves de différents âges et peut être utilisé pour identifier des mutants qui présentent des phénotypes, comme ceux présentant des mutations affectant les gènes codant pour des canaux TRP et opsines, qui sont nécessaires pour la discrimination de température.

Introduction

Thermotactisme est employé par des animaux mobiles pour sélectionner un environnement le plus favorable des conditions^1,2,3. Si le climat est trop chaud ou froid, ce comportement est vital pour la survie. En outre, beaucoup d’animaux est sensibles aux très petites différences de température dans la gamme confortable et cherche un cadre avec une température idéale. Ceci est particulièrement important pour les organismes poïkilothermes tels que les mouches des fruits, qui équilibrer la température de leur corps avec l’environnement. Dosages pour surveiller les larve thermotactisme ont contribué à identifier et à clarifier les rôles de capteurs moléculaires comme Drosophila transitoire récepteurs potentiels (TRP) canaux^4,5,6, rhodopsines^7,8et ionotropiques récepteurs récepteurs (IRs)⁹, qui empreignent ces animaux avec des sensibilités de température sur différentes plages de températures.

Un test bilatéral choix fournit une approche pour étudier les préférences thermiques en larves^6,7. Le test implique l’établissement de deux zones de températures distinctes et permet les animaux sélectionner un côté sur l’autre. Les résultats de tests à choix bidirectionnelle peuvent être robustes, surtout si les différences de température entre les deux options sont grandes. En outre, puisque chaque essai implique tabulating seulement deux groupes, les données peuvent être exprimées comme un indice simple de préférence. La facilité et la simplicité des tests de choix bidirectionnelle se prêtent également aux écrans de génétiques. Toutefois, une limitation majeure est que beaucoup d’expériences est tenus d’établir la température préférée des animaux sauvage ou mutants.

Un test de gradient offre la possibilité d’établir la température préférée en un seul essai⁸. De plus, contrairement à l’épreuve de choix bidirectionnelle, il permet l’évaluation de la distribution d’un groupe d’animaux, lorsqu’ils sont confrontés avec une gamme continue de températures. Un dosage dégradé utilise une boîte de Pétri et animaux et est bien adapté pour caractériser le comportement détaillé de chaque animal¹⁰. Toutefois, étant donné que les boîtes de Pétri sont ronds, les tailles des zones thermiques varient et sont progressivement plus petites selon la distance du centre. Par conséquent, cette configuration n’est pas idéale pour surveiller les sélections de température des populations d’animaux.

Un appareil de gradient thermique continu bien adaptée pour évaluer les préférences de température des groupes de larves emploie une arène rectangulaire et est décrite ici. L’appareil est simple à construire et à assembler. En outre, le gradient est linéaire et est flexible, car il peut être utilisé pour évaluer la thermotactisme plus grande température varie de 10 ° C à 42 ° C. Le test est rapide et simple à réaliser et donne des données reproductibles. En plus de signaler la température favorable des larves, il révèle les préférences de la population d’animaux sur un ensemble linéaire dans une expérience simple. En raison de ces avantages, c’est un excellent choix pour l’identification des gènes nécessaires à thermotactisme.

Protocole

1. le matériel Fabrication et assemblage appareils pour essais de Gradient

1. Fabriquer les plaques aluminium de dosage pour le dosage de gradient directionnel unique.
   1. Couper et broyer chaque plaque de dosage de l’aluminium (Figure 1 a) sur une seule pièce d’aluminium à l’aide d’une scie à ruban et sharp moulin vertical avec les dimensions suivantes : la taille extérieure est 140 x 100 x 9 mm et la taille intérieure est 130 x 90 x 8 mm (Figure 1 b). Anodisé à l’intérieur de chaque plaque de test avec une peinture noire pour le rendre plus facile à visualiser les larves et prévenir la rouille.
      NOTE : La Fabrication des plaques aluminium Dosage pour le gradient directionnel unique est faite par un atelier d’usinage. L’anodisation est effectuée par un fournisseur commercial.
   2. Marquer les jantes supérieures et inférieures de chaque plaque de test avec 13 démarcations, séparées de 10 mm à l’aide d’un marqueur permanent. Placez les premiers et le derniers démarcations 5 mm du bord intérieur des plaques assay (Figure 1 a, B).
2. Pour fabriquer la plaque en aluminium de dosage pour le gradient bidirectionnel, découper une plaque en aluminium avec les dimensions suivantes à l’aide de cisailles à tôle : 250 x 220 x 2 mm. Anodize les plaques de dosage avec une peinture noire.
   NOTE : Fabrication des plaques d’aluminium Dosage pour les gradients bidirectionnelle est réalisée par un atelier d’usinage. L’anodisation est effectuée par un fournisseur commercial.
3. Fabriquer les blocs d’aluminium.
   Remarque : Deux blocs sont nécessaires pour le gradient directionnel unique et trois blocs sont nécessaires pour le gradient bidirectionnel.
   1. Couper les blocs en aluminium (Figure 1) d’une seule pièce d’aluminium à l’aide d’une scie à ruban (dimensions de 50 x 255 x 14 mm) (Figure 1, D).
   2. Percer le canal d’eau à l’intérieur du bloc (7 mm de diamètre) à l’aide d’un broyeur vertical et rainures de fil dans les extrémités ouvertes sur un côté (Figure 1). Fermer les trous rainurés avec boulons et joint un ruban pour former un canal d’eau en forme de U (Figure 1, D).
      NOTE : La fabrication des blocs en aluminium de dosage est effectuée par un atelier d’usinage.
   3. Fixez le connecteur du bloc d’aluminium (Figure 1) avec filetages et thread seal tape à une extrémité. Insérer l’autre extrémité avec ardillons multiples (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" mur) de tuyau silicone.
4. Obtenir deux bains circulants réfrigérés/chauffants.
5. Assembler les blocs sous température contrôlée pour le système de dosage dégradé.
   1. Le gradient directionnel unique, chacun des deux blocs aluminium connectez à un bain d’eau distinctes afin que la température de chaque bloc est contrôlée par une circulation système (Figure 2 a) d’eau indépendant. Tube en silicone (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" mur) permet de raccorder la sortie de l’eau du bain le connecteur sur le côté intérieur du bloc en aluminium (Figure 2 a). En outre, utiliser de tubes à raccorder le connecteur côté extérieur sur le bloc en aluminium à l’entrée de l’eau du bain.
   2. Le gradient bidirectionnel, placer deux des trois blocs sous la gauche et la droite de la plaque et liez-les à la baignoire d’eau même avec le tube (Figure 2 b). Connecter le troisième bloc en aluminium à un second bain d’eau et place sous le centre de la plaque (Figure 2 b).
      Remarque : Cet appareil et le dosage sont nécessaire uniquement si les larves s’accumulent dans la zone à un bord ou l’autre du gradient directionnel unique. Dans l’affirmative, il est important d’évaluer si oui ou non il y a un effet de bord. Pour vérifier cette possibilité, établir un gradient bidirectionnelle dans laquelle la température de la zone de bord préférée par les larves à l’aide du gradient directionnel unique (par exemple 18 ° C) est la température au milieu de la plaque du gradient bidirectionnel (Figure 3E , F).

2. larve synchronisation

1. Nourrir les mouches à utiliser pour la ponte.
   1. Les granules de levure Mix et eau distillée avec un pilon pour faire levure pâte. Soigneusement broyé et remuer jusqu'à ce que la consistance de la pâte est similaire au beurre d’arachide. Éviter la pâte trop sèche, qui peut s’écailler lorsque vous transférez des mouches à flacons fraîches, ou mouiller la pâte, qui peut piéger les mouches.
   2. À l’aide d’un pilon, ajouter la pâte de levure près des murs intérieurs de flacons de Drosophila standards, juste au-dessus de la surface de l’aliment.
   3. Les femelles comte 12-35 et jusqu'à la moitié des mâles autant (mais pas plus de 10) sur un bloc de₂ CO et ajouter les femelles et les mâles dans chaque flacon de pâte contenant des levures.
   4. Pour garder la mouche alimentaire avec de la levure-pâte humide, tandis que les mouches se nourrissent, combiner ces flacons dans un plateau qui contient jusqu'à 100 flacons avec 20 flacons ouverts contenant distillée seulement. Placez le plateau dans un sac en plastique transparent et sceller.
   5. Incuber le plateau dans une étuve à 25 ° C pendant 48 h afin que les femelles sont nourrissent convenablement, permettant ainsi à poser un grand nombre de œufs.
2. Mettre en place les flacons pour la ponte.
   1. Transférer les mouches nourries dans nouveaux flacons de nourriture pour la collecte des œufs en tapant dessus au-dessus. Ne pas utiliser de CO_2, qui peuvent causer les mouches à pondent moins d’oeufs sur la fenêtre suivante de peu de temps.
      Remarque : Flacons alimentaires Standard Drosophila sont utilisés sans pâte de levure pour la collecte des œufs.
   2. Laissez les mouches à pondre des œufs pendant 3 h à 25 ° C pour que tous les oeufs sont prélevés sur une fenêtre de temps relativement étroite.
      Remarque : Ceci permettra les larves à synchroniser au même stade du développement.
   3. Placer les flacons contenant les oeufs dans le bac contenant les flacons de l’eau et serrer le sac. Incuber à 25 ° C sous 12 h lumière : 12 h cycles sombres.
   4. Laissez reposer les larves pendant un nombre donné d’heures après que la ponte (AEL) selon le stade larvaire désirée.
      Remarque : Le tableau 1 donne une estimation de la relation entre les heures AEL et le stade larvaire, qui variera selon le stock de mouche, aliments utilisés, etc. la relation exacte entre AEL et stade de développement doit être la température d’élevage vérifié par chaque chercheur à l’aide de critères physiques, tels que la morphologie de la bouche de crochets et stigmates¹¹.

3. installation de Gradient de température

1. Préparer le gradient directionnel unique
   1. Pour créer un environnement ambiant humide pendant les essais, placez les deux blocs d’aluminium reliés à deux bains d’eau sur des essuie-tout humide, séparés par 10 cm (Figure 2 a).
   2. Allumez les deux bains d’eau ~ 2 h avant de commencer le test afin de permettre suffisamment de temps pour que la température des blocs d’aluminium s’équilibrer.
      Remarque : Il est recommandé de réaliser une expérience de simulation pour déterminer la température de chaque bain d’eau qui est nécessaire pour obtenir le gradient de température linéaire souhaité. Quelques paires de température typique pour définir les bains-marie sont répertoriés dans le tableau 2. Toutefois, Notez que les températures de surface sont affectées par la température ambiante. La longueur de tube aussi affecte les températures étant donné qu’il est le refroidissement dans les tubes. La longueur de la tubulure dans notre programme d’installation est de 1,5 m.
   3. 100 mL d’agarose à 1 % lors du réglage de forte puissance dans un rond large-bouche bouteille de 500 mL de micro-ondes et verser 25 mL/plaque sur une table de travail niveau de dosage. Préparer deux plaques d’essai, qui peuvent être placés sur des blocs d’aluminium en même temps (Figure 2 a).
   4. Après que l’agarose a solidifié (10-20 min), frottez doucement chaque surface d’agarose avec une éponge de cuisine standard ou une éponge de mélamine pour rendre la surface d’agarose légèrement grossier, afin qu’en pulvérisant l’eau sur le gel d’agarose, créera une membrane mince lisse de l’eau, et aucun des gouttelettes d’eau ne seront forme.
   5. Complètement immerger les plaques dans un récipient avec de l’eau distillée jusqu'à ce que le test est prêt à être exécuté pour empêcher que les plaques se desséchée.
2. Préparer un dégradé bidirectionnel (facultatif)
   1. Pour créer un environnement ambiant humide pendant les essais, placer des blocs d’aluminium trois espacées de 8 cm (Figure 2 b) sur un essuie-tout humide.
   2. Allumez les deux bains d’eau ~ 2 h avant de commencer le test afin de permettre suffisamment de temps pour que la température des blocs d’aluminium s’équilibrer.
      Remarque : Il est recommandé de réaliser une expérience de simulation pour déterminer la température de chaque bain d’eau pour le gradient bidirectionnel. Quelques paires de température typique pour définir les bains-marie sont répertoriés dans le tableau 3. Toutefois, Notez que les températures de surface sont affectées par la température ambiante. La longueur de tube aussi affecte les températures étant donné qu’il est le refroidissement dans les tubes. La longueur de la tubulure dans notre programme d’installation est de 1,5 m.
   3. Pour éviter que l’agarose répandre hors de la plaque, envelopper les bords de la plaque en aluminium avec étiquetage des bandes pour former un mur 10 de mm de hauteur (Figure 2 b).
   4. En utilisant le réglage haute puissance, micro-ondes 200 mL d’agarose à 1 % dans un 500 mL bouteille de large-bouche ronde et verser 120 mL sur une plaque de test.
   5. Après que l’agarose a solidifié (~ 30 min), frottez doucement chaque surface d’agarose avec une éponge de cuisine standard ou une eponge de mélamine pour former la surface d’agarose légèrement grossier, afin qu’en pulvérisant l’eau sur le gel d’agarose, une membrane mince lisse de l’eau est créée et aucun forme de gouttelettes d’eau.
   6. Complètement immerger les plaques d’essai dans un récipient avec de l’eau distillée jusqu'à ce que le test est prêt à effectuer pour les empêcher de se dessécher.
3. Mettre en place le gradient directionnel unique
   1. Préparer des réactifs et des éléments sur un banc à côté de l’appareil de dosage dégradé (voir la Table des matières).
   2. Pour promouvoir le transfert de température efficace, combler les lacunes entre les blocs d’aluminium et les plaques de dosage par pulvérisation d’eau à l’interface entre les blocs et la plaque.
   3. L’utilisation de gants, enlever les plaques de dosage de la cuve d’eau. Si l’eau envahit entre le gel d’agarose et la plaque et provoque des bosses pour former à la surface, enlever l’eau avec une micropipette P1000.
   4. Placer les plaques de dosage sur les blocs d’aluminium afin que les démarcations qui mesurent 2 cm de chaque bord exactement correspondant les bords des blocs d’aluminium (Figure 2 a, C).
   5. Pulvériser de l’eau sur la surface de la plaque (une membrane mince de l’eau recouvrant la surface du gel d’agarose est suffisante) pour empêcher le gel d’agarose de se dessécher. S’assurer que la membrane de l’eau est continu et gratuit de gouttelettes d’eau car les larves peuvent se retrouvent piégés dans les gouttelettes d’eau.
   6. Couvrir le système de gradient avec une boîte en carton pour réduire l’évaporation de l’eau et contribuer à stabiliser la température de la surface du gel. Attendre 5-10 min permettre à la température de s’équilibrer.
   7. Vérifier la température de surface à 12 points sur la plaque (Figure 2). Prendre deux mesures au sein de chaque zone pour établir si oui ou non il y a la variabilité au sein d’une zone. Assurez-vous que la température à deux endroits est de ± 0,2 ° C de la température désirée.
      Remarque : La variabilité au sein d’une zone se produit généralement parce que les distances exactes des deux taches au bord des blocs d’aluminium ne sont pas identiques. Ajustez la position de la plaque sur les blocs d’aluminium pour s’assurer que les démarcations qui mesurent 2 cm de chaque bord exactement correspondant les bords des blocs en aluminium.
   8. Si le gradient de température mesuré s’écarte de la pente désirée, augmenter ou diminuer les paramètres de température de bain l’eau et vérifier à nouveau la température à la surface après que la température de l’eau salles de bain stabilize(s).
   9. Couvrir le système de gradient avec une boîte en carton avant de commencer l’essai.
4. Mis en place le gradient bidirectionnel (facultatif)
   1. Préparer des réactifs et des éléments sur un banc à côté de l’appareil de dosage dégradé (voir la Table des matières).
   2. Projections d’eau sur les surfaces des trois blocs aluminium pour promouvoir le transfert de température efficace des blocs d’aluminium sur la plaque d’essai de combler les lacunes entre les surfaces.
   3. Enlever les plaques de dosage soigneusement depuis le réservoir d’eau et placer sur les blocs d’aluminium. Si l’eau envahit entre le gel d’agarose et la plaque, ce qui pourrait causer des bosses pour former sur la surface, enlever l’eau avec une micropipette P1000.
   4. Placer la plaque de test sur les blocs d’aluminium afin que les médianes des zones premiers et le derniers de chaque bord correspondent exactement les bords des blocs aluminium bilatéral (Figure 2 b, D).
   5. Pulvériser de l’eau sur la surface de la plaque (une membrane mince de l’eau recouvrant la surface du gel d’agarose est suffisante) pour empêcher le gel d’agarose de se dessécher. S’assurer que la membrane de l’eau est continu et gratuit de gouttelettes d’eau, car les larves peuvent se retrouvent piégés dans les gouttelettes d’eau.
   6. Couvrir le système de gradient avec une boîte en carton pour réduire l’évaporation de l’eau et contribuer à stabiliser la température de la surface du gel. Attendre 5-10 min pour permettre à la température de s’équilibrer.
   7. Vérifier la température de surface à deux points le long de la ligne médiane de chacune des 10 zones (Figure 2D). Prendre deux mesures au sein de chaque zone pour établir si oui ou non il y a la variabilité au sein d’une zone. Assurez-vous que la température à deux endroits est de ± 0,2 ° C de la température désirée.
      Remarque : La variabilité au sein d’une zone se produit généralement parce que les distances exactes des deux taches au bord des blocs d’aluminium ne sont pas identiques. Ajustez la position de la plaque sur les blocs d’aluminium pour s’assurer que les médianes des zones Prénom le plus proche de chaque bord coïncider exactement avec les bords des blocs aluminium deux côté.
   8. Si le gradient de température mesuré s’écarte de la pente désirée, ajustez les paramètres de température de bain l’eau et vérifier à nouveau la température à la surface après que la température de l’eau salles de bain stabilize(s).
   9. Couvrir les blocs avec une boîte en carton jusqu’au début de l’essai.

4. lavage et Collection larvaire

1. Isoler les larves propres (option 1)
   1. Ajouter environ 40 mL de solution de saccharose 18 % à un tube 50 mL. Ramasser toutes les larves de la vial(s) de nourriture avec une scoopula et le transfert à la solution de saccharose de 18 %.
   2. Mélanger soigneusement mais délicatement à l’aide d’un scoopula pour séparer les débris de nourriture des larves. Attendez 30-60 s jusqu'à ce que le flotteur de larves à la couche supérieure du tube. Verser la couche supérieure contenant les larves (~ 10 mL) à un autre tube de 50 mL et remplir le tube avec la nouvelle solution de saccharose de 18 %. Attendez 30-60 s jusqu'à ce que le flotteur de larves à la couche supérieure à nouveau.
      NOTE : Grosses particules alimentaires parfois transfert ainsi que les larves et peuvent affecter la thermotactisme larvaire si ils ne sont pas supprimés. Si les grosses particules alimentaires restent dans la couche supérieure, répétez les étapes 4.1.1-4.1.2, ou les supprimer manuellement à l’aide d’un scoopula.
   3. Transférer la couche supérieure de larves (~ 10 mL) dans deux autres tubes de 50 mL et remplir les deux tubes avec de l’eau distillée pour réduire la concentration de saccharose, afin que les larves sombrer rapidement dans l’eau. Attendez 30-60 s jusqu'à ce que les larves se déposent au fond. Effectuer ceci et les étapes suivantes dès que possible afin d’empêcher les larves de la noyade.
   4. Jeter autant d’eau que possible en inclinant doucement les tubes. Combiner les larves dans un tube en déversant les larves avec l’eau restante et remplir le tube de l’eau distillée.
   5. Attendez 30-60 s jusqu'à ce que toutes les larves s’enfoncer et retirer autant d’eau que possible en inclinant doucement les tubes. Répétez cette étape de lavage 2 à 4 fois à entièrement supprimer saccharose et toute nourriture visible.
   6. Jeter autant d’eau que possible et transférer les larves dans un vide 35 mm boîte de Pétri par décantation. Pulvériser le tube avec de l’eau et utiliser un petit pinceau pour aider le transfert les larves.
   7. Retirer l’eau en excès de la boîte de Pétri à l’aide d’une micropipette P1000. Laissez ~0.5 mL d’eau pour prévenir la déshydratation des larves.
   8. Placez le couvercle sur le plat pour éviter les larves de s’échapper. Faites pivoter le couvercle à l’envers afin de réduire la capacité des larves de s’échapper par le petit espace entre le couvercle et le plat. Laisser les larves de récupérer pendant 10-20 min.
2. Isoler les larves propres (option 2)
   Remarque : Cette méthode alternative pour le nettoyage des larves atténue la possibilité d’étouffer les larves au cours de la procédure de nettoyage. Pour utiliser cette méthode, procédez comme suit après avoir effectué les 4.1.1-4.1.2 étapes ci-dessus.
   1. Placez une passoire de cellule (300 µm, conserve les larves 72 h AEL ou plus) au sommet d’un tube de 50 mL.
   2. Après avoir confirmé qu’il n’y a aucun corps adultes ou les débris de nourriture flottant à la surface de la solution de saccharose, verser la couche supérieure contenant les larves à travers le tamis pour piéger tous les larves sur le grillage. Laver les larves avec de l’eau distillée jusqu'à ce que le tube de 50 mL est rempli.
   3. Retirer la crépine de la cellule avec des larves et dispose de l’eau usée du tube. Placer le filtre contenant les larves sur le dessus du tube vide et laver les larves à nouveau avec de l’eau distillée jusqu'à ce que le tube de 50 mL est rempli.
   4. Retournez la crépine à l’envers un vide 35 mm boîte de Pétri et vaporiser de l’eau du dessus de la crépine de la cellule de transférer les larves à la boîte de Pétri. Transférer les larves restantes à l’aide d’un petit pinceau.
   5. Passez à l’étape 4.1.7 ci-dessus avant de passer à l’étape 5.

5. analyse et calcul

1. Retirez la boîte en carton et vérifiez la température de surface de gel immédiatement avant de transférer les larves à la plaque. Réduire au minimum le temps que le carton est ouvert afin d’éviter de perturber l’équilibre de la température. Si la surface est sèche, vaporisez un peu d’eau sur la surface.
2. Distribuer 150 ± 50 larves près du centre de chaque assiette (entre les zones 3 et 4 sur les 6 zones) pour le gradient directionnel unique (zone de dégagement ; La figure 2).
   Remarque : Pour le gradient bidirectionnel, distribuer 200-400 larves le long de la zone médiane de chaque moitié (Figure 2D).
3. Placez un couvercle de microplaque sur chaque plaque de test pour éviter les larves rampant sur. Couvrir l’installation avec une boîte en carton pour éviter l’exposition à la lumière, susceptible d’influer sur les choix larve sur le gel d’agarose.
   Remarque : Pour le gradient bidirectionnel, devrait serait-il pas nécessaire couvrir la plaque avec un couvercle, car la plaque est plus grande, et la température préférée des larves est dans la zone médiane. Par conséquent, peu de larves s’accumulent sur les bords et ont la possibilité de ramper.
4. Permettre le dosage de procéder pendant 10-30 min pour le gradient directionnel unique et pour les 15-35 min pour le gradient bidirectionnelle, selon l’âge des larves (tableau 4).
5. Enlever le carton et le couvercle de la microplaque. Photographier les plaques par dessus à l’aide d’un appareil photo numérique. Prendre deux photos de chaque plaque de test afin que l’enquêteur puisse choisir celui avec meilleur contraste et luminosité pour analyse.
6. Supprimer tous les larves sur les plaques d’essai et n’importe où à l’extérieur les plaques par aspiration.
7. Nettoyer les plaques d’essai, les tubes et la crépine de la cellule avec de l’eau distillée. Réutiliser les plaques de dosage établis ce jour-là, à moins que la surface de l’agarose est endommagée.
8. Calculer la répartition en pourcentage des larves dans chaque zone.
   1. Ouvrez l’image photographique des résultats de titrage à l’aide d’un logiciel qui permet d’ajouter des repères à l’image. Pour indiquer les zones de test, tracer des lignes verticales tous les 2 cm basée sur le tracé sur la plaque de test.
   2. Compter le nombre de larves dans chaque zone et enregistrer les numéros. Ne comptez pas les larves dans les régions de 0,5 cm d’un mur. Le gel est plus épais près des murs, et les températures de surface ne sont pas linéaires dans ces régions.
   3. Le gradient directionnel unique, calculer la répartition en pourcentage dans chaque zone comme suit :
      (le nombre de larves dans une zone déterminée de 2 cm) / (nombre total de larves dans 6 zones) x 100.
   4. Le gradient bidirectionnel, calculer la répartition en pourcentage dans chaque zone comme suit :
      (le nombre de larves dans une zone déterminée de 2 cm) / (nombre total de larves en 5 zones de chaque côté du gradient) x 100.

Résultats

Afin d’établir une unique bidirectionnel de 18 ° C à 28 ° C dégradé, nous avons mis les températures des deux bains d’eau de 16,8 ° C et 31 ° C. On obtient les températures à 13 points en mesurant la température à 26 postes dans les parties supérieures et inférieures de 6 toutes les zones, les lignes de frontière entre les zones et les extrémités de la surface du gel d’agarose (Figure 2, 2E). La distribution de la température le long du gradi...

Discussion

Pour assurer le succès de ce protocole, il est important de prendre des mesures pour obtenir un nombre suffisant de larves à réaliser les expériences. Il s’agit d’alimentation avant les mouches en flacons pâte contenant de la levure pendant 2-3 jours afin d’améliorer la ponte. Les flacons doivent être placés dans un bac contenant des flacons d’eau et enfermé dans un sac en plastique transparent, qui maintient l’humidité de l’aliment et favorise les efficaces les larves tout en permettant une exposition à des cycles norma...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Appareil de dosage à gradient
PolyScience 9106, Bain de circulation réfrigéré/chauffé 6L	Thomas Scientific	9106	Ce modèle n’est plus fabriqué. Les modèles de remplacement mis à jour incluent : 1186R00 et 1197U04 pour 120 V, 60 Hz, ou 1184L08 et 1197U04 pour 240 V, 50 Hz.
Plaque de dosage en aluminium (pour gradient unidirectionnel)			Taille extérieure : 14 x 10,1 x 0,9 cm, taille intérieure : 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodisée noire.
Plaque en aluminium (pour gradient bidirectionnel)			25 x 22 x 0,2 cm, anodisée noire.
		d’aluminium Dimensions extérieures : 25,5 x 5 x 1,4 cm, les paramètres des canaux intérieurs sont illustrés à la figure 1D.
Connecteur pour blocs et tubes en aluminium	McMaster-Carr	91355K82
Tubes sanitaires en silicone Tygon	Tygon	57296	1/4 » ID x 3/8 » OD x 1/16 » mur
Nom	>Entreprise<	>Numéro de catalogue	Comments
Items et réactifs pour
Pestle	USA Scientific	17361	Pilon pour tubes de microcentrifugation de 1,5 mL
Thermomètre	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Couvercle universel pour microplaques	Corning	6980A77
Plat de 35 mm	Corning	9380D40
Ruban d’étiquetage (pour gradient bidirectionnel)	Fisher Scientific	15-951	Ruban d’étiquetage Fisherbrand 2 po x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Préparer une solution à 1 %
Saccharose	Sigma	S0389-5KG	Préparer une solution à 18 % juste avant de commencer le test
Pinceau Fisher	Scientific	11860
Tubes	à centrifuger de 50 mLDenville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL Flacon rond à col large	Pyrex	1395-500
Passoire à cellules (pore de 300 mm)	PluriSelect	43-50300	Optionnel pour le lavage des larves
Boîte en carton (plateau de flacons)	Genesee Scientific	FS32-124
Nom	Company	Numéro de catalogue	Comments
Drosophila food
Eau			22 400 mL
Semoule de maïs, jaune (à mailles extra fines, floquée) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1 609 g
de levure de bière 100 lb	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® ; Farine de soja (10 kg/unité)	Genesee Scientific	62-115	221 g
Drosophila Agar, type II (5 kg)	Genesee Scientific	66-103	190 g
Karo sirop de maïs léger	Karo		1 700 mL
4-hydroxybenzoate de méthyle (en suspension dans de l’éthanol à 200 degrés)	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
Purée d’acide propionique. p.a.,>99,5 % (GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
Acide phosphorique  ; réactif ACS, &ge ; 85 % en poids dans H2O	Sigma Aldrich	438081-500 mL	8,5 mL