Article de méthode

Visualisation de l’Interaction entre les protéines marquées Qdot et ADN λ modifiée relativement à l’échelle de la molécule unique

DOI :

10.3791/57967

⸱

17 juillet 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole pour l’étude des interactions ADN-protéines par microscopie de fluorescence de la réflexion totale interne (TIRFM) en utilisant un substrat d’ADN modifié relativement λ et un point quantique-protéines marquées.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopie de fluorescence a apporté des contributions grandes en disséquant les mécanismes de processus biologiques complexes à l’échelle de la molécule. Lors d’essais de la molécule unique pour l’étude des interactions ADN-protéines, il existe deux facteurs importants pour l’examen : le substrat de l’ADN avec assez de longueur pour l’observation facile et étiquetage une protéine avec une sonde fluorescente convenable. l’ADN de 48,5 kb λ est un bon candidat pour le substrat de l’ADN. Points quantiques (Qdots), comme une classe de sondes fluorescentes, permettent l’observation longue durée (minutes et heures) et acquisition d’images de haute qualité. Dans cet article, nous présentons un protocole pour l’étude des interactions ADN-protéines au niveau molécule unique, qui comprend la préparation relativement mis à jour le λ ADN et étiquetage une protéine cible avec la Streptavidine Qdots. Pour une preuve de concept, nous choisissons des ORC (reconnaissance d’origine complexe) dans la levure de bière comme une protéine d’intérêt et visualiser son interaction avec l’ARS (séquence autonome réplication) à l’aide de TIRFM. Par rapport aux autres sondes fluorescentes, Qdots présentent des avantages évidents dans les études de la molécule unique en raison de sa grande stabilité contre le photoblanchiment, mais il est à noter que cette propriété limite son application aux dosages quantitatifs.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interactions entre les protéines et l’ADN sont essentielles pour nombreux processus biologiques complexes, telles que la réplication de l’ADN, réparation de l’ADN et la transcription. Bien que les approches conventionnelles ont fait la lumière sur les propriétés de ces processus, de nombreux mécanismes clés sont encore peu clairs. Récemment, avec les techniques de molécule unique se développe rapidement, certains des mécanismes ont été adressés1,2,3.

L’application de la microscopie de fluorescence de la molécule unique sur la visualisation en temps....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. préparation du substrat ADN λ-ARS317

  1. Emballage et construction de substrat de l’ADN
    1. Digérer l’ADN natif λ utilisant XhoI enzyme ; amplifier un roulement 543 de fragment d’ADN de bp ARS317 partir de l’ADN génomique de bourgeonnement de levure en utilisant des amorces contenant 20 bp homologue séquences d’en amont et en aval de XhoI site enzymatique sur lambda de l’ADN. Ajouter 100 ng de Xhoj’ai digéré l’ADN λ et 10 ng d’ADN des fragments de 10 µL de système de réaction de recombinaison homologue et incuber la réaction à 37 ° C pendant 30 min.
    2. Pour créer un package l’ADN λ de recombinaison, ajouter 25 µL d’extra....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afin de visualiser l’interaction entre Qdot marqué ORC et l’ARS, nous avons tout d’abord construit le substrat d’ADN λ-ARS317. Un fragment d’ADN contenant le ARS317 a été intégré dans Xhoje site (33,5 kb) de l’ADN natif λ par recombinaison homologue (Figure 1 a). Le produit de recombinaison a été emballé à l’aide d’extraits et les particules phagiques emballés ont été cultivés sur des plaques LB (Figure 1 b). La plaque p.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole pour observer l’interaction entre la protéine Qdot marqués et l’ADN de λ relativement modifiées à l’aide de la TIRFM dans une cellule d’écoulement. Les mesures nécessaires comprennent une modification spécifique du substrat de l’ADN, ADN biotinylation, nettoyage de la lamelle couvre-objet et fonctionnalisation, flux-cellule préparation et single-molecule imaging. Il y a deux points essentiels qui est à noter. Tout d’abord, toutes les étapes avec λ ADN doivent être manipulés délicatement p.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Dr Hasan Yardimci et Dr.Sevim Yardimci de l’Institut Francis Crick genre aider dans les expériences de la molécule unique, Dr Daniel Duzdevich du laboratoire du Dr. Eric C. Greene de l’Université de Columbia, Dr Yujie Sun de l’Université de Pékin et Dr Chunlai Chen du L’Université Tsinghua de discussion utile. Cette étude a été financée par le National Natural Science Foundation de Chine 31371264, 31401059, CAS équipe interdisciplinaire de l’Innovation et la bourse avancé de Newton (NA140085) de la Royal Society.

....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lambda DNANew England BiolabsN3011Magasin 25 &mu ; L aliquotes à -20 º ;C.
XhoI EnzymeThermo Fisher ScientificFD0694
Kit de clonage à fusion rapideBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
Emballage Extraits		EpicentreMP5110La souche bactérienne LE392MP
est incluse dans ce colis.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013092Toute marque est acceptable.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical worksN/AToute marque est acceptable.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical worksN/AToute marque est acceptable.
NZ-amineAmrescoJ853-250G
Acides aminésSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
Appareil d’agitation magnétiqueIKAKMO2 basic
15 mL EppendorfEppendorf3012215115 mL, stérile, en vrac, 500pcs
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
Amorces biotinyléesThermo Fisher ScientificN/A
T4 ADN ligase, T4 ADN ligase, Tampon de réaction (10x)New England BiolabsM0202
CoverslipThermo Fisher Scientific22266882
ÉthanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009259
Hydroxyde de potassium (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
AcétoneThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80120891acide sulfurique
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001121830 % Peroxyde d’hydrogène
MéthanolSigma-Aldrich322415-2L
Acide acétiqueSigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(méthoxy-polyéthylène glycol)		LysanmPEG-SVA-5000
biotine-PEG
(biotine-polyéthylène glycol)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
Dessiccateur sous videTianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
Scelleuse sous videMAGIC SEALWP300
Scribe en verre à pointe de diamantELECTRON MICROSCOPY SCIENCES70036
Lame de verreSail Brand7101
Tube d’entréeSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2Diamètre intérieur 0,38 mm ; diamètre extérieur 1,09 mm.
Tube de sortieSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4Diamètre intérieur 0,76 mm ; diamètre extérieur 1,22 mm.
Ruban adhésif double faceSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpoxyLEAFTOP9005cinq minutes époxy
StreptavidinSigma-AldrichS4762
Microscope à fluorescenceOlympusIX71
Pompe programmable appareil Harvard 70-4504
532 nm laserCoherent Sapphire-532-50
640 nmlaser CohérentOBIS-640-100
Caméra EMCCDAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
optique de séparation		Hamamatsu photonics K.K.A12801-01
Système d’éclairage TIRFOlympusIX2-RFAEVA2
60&fois ; Objectif TIRFOlympusAPON60XOTIRF
Séparateur de faisceau laser quadri-bord dichroïque
SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Filtre passe-bande quadribandeSemrockFF01-446/510/
581/703-25
Séparateur de faisceau dichroïqueSemrockFF649-Di01-25x36
Filtre d’émissionChroma Technology CorpET585/65m
Filtre d’émissionChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck fluorescence, microscope lame de test #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Streptavidin ConjugateThermo Fisher ScientificQ10163MPStore à 4 º ; C, ne pas congeler.
ATPAmresco0220-25GPréparez une solution d’ATP de 200 mM en utilisant du ddH2O, ajustez le pH à 7,0 et conservez 10 &mu ; L aliquotes à -20 º ;C.
DTTAmrescoM109-5GPréparez une solution 1 M à l’aide de ddH2O, et stockez 10 &mu ; l aliquotes à -20 º ;C.
tube

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Imagerie de mol cule uniqueinteraction ADN prot inemarquage aux points quantiquessubstrat d ADN lambdamodification site sp cifiquemicroscopie TIRFassemblage de cellule fluxpoints quantiques rev tus de streptavidinemarquage ORC Qdot705coloration au SYTOX Orange

Articles connexes