Nous présentons ici un protocole pour l’étude des interactions ADN-protéines par microscopie de fluorescence de la réflexion totale interne (TIRFM) en utilisant un substrat d’ADN modifié relativement λ et un point quantique-protéines marquées.
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Article de méthode
Visualisation de l’Interaction entre les protéines marquées Qdot et ADN λ modifiée relativement à l’échelle de la molécule unique
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La microscopie de fluorescence a apporté des contributions grandes en disséquant les mécanismes de processus biologiques complexes à l’échelle de la molécule. Lors d’essais de la molécule unique pour l’étude des interactions ADN-protéines, il existe deux facteurs importants pour l’examen : le substrat de l’ADN avec assez de longueur pour l’observation facile et étiquetage une protéine avec une sonde fluorescente convenable. l’ADN de 48,5 kb λ est un bon candidat pour le substrat de l’ADN. Points quantiques (Qdots), comme une classe de sondes fluorescentes, permettent l’observation longue durée (minutes et heures) et acquisition d’images de haute qualité. Dans cet article, nous présentons un protocole pour l’étude des interactions ADN-protéines au niveau molécule unique, qui comprend la préparation relativement mis à jour le λ ADN et étiquetage une protéine cible avec la Streptavidine Qdots. Pour une preuve de concept, nous choisissons des ORC (reconnaissance d’origine complexe) dans la levure de bière comme une protéine d’intérêt et visualiser son interaction avec l’ARS (séquence autonome réplication) à l’aide de TIRFM. Par rapport aux autres sondes fluorescentes, Qdots présentent des avantages évidents dans les études de la molécule unique en raison de sa grande stabilité contre le photoblanchiment, mais il est à noter que cette propriété limite son application aux dosages quantitatifs.
Introduction
Interactions entre les protéines et l’ADN sont essentielles pour nombreux processus biologiques complexes, telles que la réplication de l’ADN, réparation de l’ADN et la transcription. Bien que les approches conventionnelles ont fait la lumière sur les propriétés de ces processus, de nombreux mécanismes clés sont encore peu clairs. Récemment, avec les techniques de molécule unique se développe rapidement, certains des mécanismes ont été adressés1,2,3.
L’application de la microscopie de fluorescence de la molécule unique sur la visualisation en temps....
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Protocole
1. préparation du substrat ADN λ-ARS317
- Emballage et construction de substrat de l’ADN
- Digérer l’ADN natif λ utilisant XhoI enzyme ; amplifier un roulement 543 de fragment d’ADN de bp ARS317 partir de l’ADN génomique de bourgeonnement de levure en utilisant des amorces contenant 20 bp homologue séquences d’en amont et en aval de XhoI site enzymatique sur lambda de l’ADN. Ajouter 100 ng de Xhoj’ai digéré l’ADN λ et 10 ng d’ADN des fragments de 10 µL de système de réaction de recombinaison homologue et incuber la réaction à 37 ° C pendant 30 min.
- Pour créer un package l’ADN λ de recombinaison, ajouter 25 µL d’extra....
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Résultats
Afin de visualiser l’interaction entre Qdot marqué ORC et l’ARS, nous avons tout d’abord construit le substrat d’ADN λ-ARS317. Un fragment d’ADN contenant le ARS317 a été intégré dans Xhoje site (33,5 kb) de l’ADN natif λ par recombinaison homologue (Figure 1 a). Le produit de recombinaison a été emballé à l’aide d’extraits et les particules phagiques emballés ont été cultivés sur des plaques LB (Figure 1 b). La plaque p.......
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Discussion
Nous présentons ici un protocole pour observer l’interaction entre la protéine Qdot marqués et l’ADN de λ relativement modifiées à l’aide de la TIRFM dans une cellule d’écoulement. Les mesures nécessaires comprennent une modification spécifique du substrat de l’ADN, ADN biotinylation, nettoyage de la lamelle couvre-objet et fonctionnalisation, flux-cellule préparation et single-molecule imaging. Il y a deux points essentiels qui est à noter. Tout d’abord, toutes les étapes avec λ ADN doivent être manipulés délicatement p.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions le Dr Hasan Yardimci et Dr.Sevim Yardimci de l’Institut Francis Crick genre aider dans les expériences de la molécule unique, Dr Daniel Duzdevich du laboratoire du Dr. Eric C. Greene de l’Université de Columbia, Dr Yujie Sun de l’Université de Pékin et Dr Chunlai Chen du L’Université Tsinghua de discussion utile. Cette étude a été financée par le National Natural Science Foundation de Chine 31371264, 31401059, CAS équipe interdisciplinaire de l’Innovation et la bourse avancé de Newton (NA140085) de la Royal Society.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Magasin 25 &mu ; L aliquotes à -20 º ;C. |
| XhoI Enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Kit de clonage à fusion rapide | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Emballage Extraits | Epicentre | MP5110 | La souche bactérienne LE392MP est incluse dans ce colis. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013092 | Toute marque est acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Toute marque est acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Toute marque est acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Acides aminés | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Appareil d’agitation magnétique | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, stérile, en vrac, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Amorces biotinylées | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 ADN ligase, T4 ADN ligase, Tampon de réaction (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Éthanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Hydroxyde de potassium (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acétone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | acide sulfurique |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011218 | 30 % Peroxyde d’hydrogène |
| Méthanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acide acétique | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (méthoxy-polyéthylène glycol) | Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotine-PEG (biotine-polyéthylène glycol) | Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Dessiccateur sous vide | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Scelleuse sous vide | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Scribe en verre à pointe de diamant | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Lame de verre | Sail Brand | 7101 | |
| Tube d’entrée | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | Diamètre intérieur 0,38 mm ; diamètre extérieur 1,09 mm. |
| Tube de sortie | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | Diamètre intérieur 0,76 mm ; diamètre extérieur 1,22 mm. |
| Ruban adhésif double face | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | cinq minutes époxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Microscope à fluorescence | Olympus | IX71 | |
| Pompe programmable | appareil Harvard 70-4504 | ||
| 532 nm laser | Coherent Sapphire-532-50 | ||
| 640 nm | laser Cohérent | OBIS-640-100 | |
| Caméra EMCCD | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging optique de séparation | Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| Système d’éclairage TIRF | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60&fois ; Objectif TIRF | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Séparateur de faisceau laser quadri-bord dichroïque | Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 | |
| Filtre passe-bande quadribande | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 | |
| Séparateur de faisceau dichroïque | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Filtre d’émission | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Filtre d’émission | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope lame de test #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store à 4 º ; C, ne pas congeler. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Préparez une solution d’ATP de 200 mM en utilisant du ddH2O, ajustez le pH à 7,0 et conservez 10 &mu ; L aliquotes à -20 º ;C. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Préparez une solution 1 M à l’aide de ddH2O, et stockez 10 &mu ; l aliquotes à -20 º ;C. |
Références
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....
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Réimpressions et autorisations
