Analyse des N- glycans de Raphanus sativus Cultivars à l’aide de PNGase H+

Résumé

Nous décrivons une méthode simple et rapide pour la préparation et l’analyse des N- glycans de différents cultivars de radis (Raphanus sativus).

Résumé

Ces dernières années, les fractions glucidiques de plantes ont reçu une attention considérable, car ils sont une source potentielle de la réponse immunitaire croisée, provoquant des allergies. En outre, structures glucidiques jouent également un rôle essentiel dans le métabolisme de la plante. Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour la préparation et l’analyse des N- glycans de différents cultivars de radis (Raphanus sativus) à l’aide d’un N- glucanase spécifique pour la libération des structures végétales glucidiques. Pour y parvenir, brute de l’acide trichloroacétique précipités des homogénats de radis ont été traitées avec PNGase H⁺et étiquetées à l’aide de 2-aminobenzamide comme une balise fluorescente. Étiqueté N- glycanes échantillons ont été analysés par la suite par séparation par chromatographie liquide (UPLC) ultra performant et laser assistée par matrice desorption ionisation-temps de spectrométrie de masse (MALDI-TOF) de vol pour une structure détaillée évaluation et quantification relatives abundancies des N- glycanes structures dérivées de radis. Ce protocole peut également être utilisé pour l’analyse des N- glycans de diverses autres espèces végétales et peut-être être utile pour une enquête plus approfondie de la fonction et les effets des N- glycans sur la santé humaine.

Introduction

N- glycanes chez les plantes ont attiré l’attention accrue ces dernières années, que des recherches antérieures a souligné N- glycans comme une source potentielle des réactions immunologiques croisées qui peut provoquer des réactions allergiques^1,2 . Il a été démontré précédemment que N- glycans sur les glycoprotéines de la plante peut affecter l’activité catalytique^3,4, thermostabilité et pliage^5,6 ou localisation subcellulaire et ⁷de sécrétio....

Protocole

1. le prélèvement

1. Acheter différents cultivars de frais radis (Raphanus sativus L.).

2. isolement des protéines de radis

1. Homogénéiser environ 100 g de radis frais avec un mixeur de cuisine pendant 10 min.
2. Transférer la pâte dans un tube à centrifuger de 50 mL et centrifuger à 14 000 × g à 4 ° C pendant 20 min enlever la matière insoluble.
3. Transvaser le surnageant soigneusement dans un nouveau tube de centrifuger de 50 mL et ajouter un volume égal de solution d’acide trichloracétique (TCA) de 2 M.
   NOTE : Ajout des TCA précipitera soluble (glyco) protéines.
4. Centrifug....

Résultats

La figure 1 montre un aperçu schématique du protocole décrit, notamment l’isolement des protéines (glyco-) de radis, la préparation des N- glycans, l’analyse de l’UPLC et l’analyse de MALDI-TOF-MS de ces composants. La figure 2 montre les chromatogrammes UPLC représentatifs de dérivés N- glycans des cultivars radis analysées. La figure 3 montre les résultats obtenus des 2AB-dérivati.......

Discussion

Le protocole que nous avons présenté ici permet la comparaison des profils N- glycanes de diverses variétés de radis. Un avantage important de cette méthode par rapport aux protocoles existants, c’est qu’aucun changement de tampon entre la libération enzymatique de N- glycanes et la réaction de dérivatisation avec 2-AB n’est requises. L’étape la plus critique de cette procédure est la purification des N- glycans utilisant la colonne SPE, comme un échec pour enlever les sels ou autres impuretés .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
>
;	SCR, Shanghai	80132618
Acide acétique glacial	Huada, Guangzhou	64-19-7
Acétonitrile	Réactif général	G80988C
Acide trifluoroacétique	Énergie chimique	W810031
2-aminobenzamide	Heowns, Tianjin	A41900
Cyanoborohydrure de sodium	J& K Scientific Ltd	314162
Dimethyl sulfoxide	Huada, Guangzhou	67-68-5
Échelle de dextran marquée 2AB, 200 pmol	Agilent Technologies	AT-5190-6998
6-Aza-2-thiothymine  ;	Sigma	275514
Outils/Matériaux :
Mélangeur de cuisine	Bear, Guangzhou	LLJ-A10T1
Centrifugeuse	Techcomp	CT15RT
Évaporateur centrifuge	Hualida, Taicang	LNG-T120
Colonne SPE	Supelco	Supelclean ENVI Carb SPE
Spectromètre de masse MALDI-TOF	Bruker	Autoflex
HPLC Analyse :
Flacon HPLC à haute récupération	Agilent Technologies	;# 5188-2788
Système HPLC	Shimadzu	Nexera
Détecteur de fluorescence pour HPLC	Shimadzu	RF-20Axs  ;
Four à colonne	Hengxin	CO-2000
HPLC	Colonne Waters	Acquity UPLC BEH colonne glycane	2.1 × ; 150 mm, 1.7 &mu ; Eau
qualité LCMS	Merck Millipore	#WX00011
Acétonitrile de qualité LCMS	Merck Millipore	# 100029
Acide formique	Aladdin	F112034
Solution d’ammoniac	Aladdin	A112080

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