Induction chirurgicale simple de perte auditive conductrice avec vérification utilisant la visualisation d'otoscope et la réponse comportementale de sursaut de clap dans le rat

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour établir une induction conductrice reproductible de perte auditive par la perforation et la vérification chirurgicales de membrane tympanique par la visualisation d'otoscope et l'évaluation comportementale par le sursaut de clap.

Résumé

La perte auditive conductrice (LCH) est une déficience auditive répandue chez l'homme. Le but du protocole est de décrire une procédure chirurgicale simple pour induire l'ACh chez les rongeurs. Le protocole démontre CHL par perforation de membrane tympanique. La vérification de la chirurgie de LCH était par l'examen d'otoscope et l'évaluation comportementale par la réponse de sursaut de clap, reproductible et fiable, et sont des méthodes simples pour démontrer la perte d'audition s'est produite. La procédure simple de l'EsCH est avantageuse en raison de sa reproductibilité et de sa souplesse à différentes activités de recherche sur les pertes auditives. Les limites d'induire CHL par une approche chirurgicale sont associées à la courbe d'apprentissage pour effectuer l'intervention chirurgicale et la confiance dans l'examen audiologique. Induire une déficience auditive par l'UneCH permet d'étudier facilement les manifestations neuronales et les résultats comportementaux de la perte auditive.

Introduction

La prévalence de la perte auditive chez les enfants et les adultes est d'environ 19,5 %¹ et 15,2 %² respectivement. Cependant, environ 39,3 % de tous les nouveau-nés ayant subi un dépistage auditif anormal ne reçoivent pas de traitement correctif tel que rapporté par les Centers for Disease Control³. La perte auditive est une condition largement étudiée, et le rongeur est un modèle robuste pour étudier les troubles normaux liés à l'audition et l'ouïe^4,5,6,7^{,8,9 ,10,11,12,13,14,15}. Les troubles auditifs tels que la perte auditive conductrice (LCH) entraînent une augmentation de la dépression synaptique à court terme dans le cortex auditif⁴, ce qui entraîne des pentes psychométriques moins profondes associées aux seuils de détection de la modulation de fréquence. ⁵. Les modèles de perte auditive conductrice par l'ablation/déplacement chirurgical du malleus, de la ponction de membrane tympanique (TM) ou du bouchon d'oreille sont facilement employés et permettent l'induction rapide du modèle de perte auditive^{5,14 ,15,16,17,18}. L'objectif du protocole et de la méthode actuels est de démontrer un modèle simple et reproductible de CHL chez les rongeurs.

Le protocole actuel est peu coûteux (300 $US avec tous les outils) et facilement modifiable à différentes activités de recherche. Le rat a eu des évaluations détaillées de l'anatomie de l'oreille moyenne^{19,20,21,22,23}, approches chirurgicales²⁴, modèles dans les médias d'otite^{25, 26,27} et TM rinçant la régénération^{16,17,18,28,29,30}, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier perte. Ici, une procédure simple d'induction de CHL est décrite avec la vérification par l'otoscope et l'évaluation comportementale avec la réponse de sursaut de clap dans le rat, qui peut alors être employée pour explorer des séquelles additionnelles de perte d'audition. La procédure de LCH est induite par la perforation chirurgicale du TM. La vérification de la procédure de l'OLC est effectuée par visualisation d'otoscope pour déterminer l'absence du TM. L'évaluation comportementale est effectuée par un niveau de pression sonore élevé de décibels (dB) (SPL) à la main. Cette méthode a été appliquée précédemment dans une variété de rongeurs. Il est facile à reproduire, produit des différences psychométriques robustes et des changements dans les réponses physiologiques neuronales^4,5,16,17,18.

Protocole

La présente étude et les procédures ont été approuvées par les comités d'éthique de la recherche animale de la City University de Hong Kong, de l'Université de Hong Kong et du Département de la santé de la Région administrative spéciale de Hong Kong.

1. Animaux

1. Utiliser des rats Sprague-Dawley (SD) de deux mois (N ' 90, 200-250 g).
   REMARQUE : Les rongeurs ont été fournis par l'unité des animaux de laboratoire accréditée de l'Université de Hong Kong.
2. Maintenir les rats sous une température constante de 25 oC et une humidité de 60 à 70 % à l'Unité de recherche sur les animaux de laboratoire.
3. Les rongeurs de maison dans les cycles de lumière/obscurité de 12/12-h avec accès à la nourriture et à l'eau potable, ad libitum.
4. Acclimater les rongeurs à l'environnement du logement pendant au moins un jour avant la chirurgie de la LCH.
5. Ramassez le rongeur par les éraflures et anesthésiez le rongeur avec un cocktail de kétamine et de xylazine (80-100 mg/kg : 5-10 mg/kg, respectivement) par injection intrapéritone (combiner 1,0 ml de kétamine avec 0,5 ml de xylazine comme concentration finale).
   REMARQUE : Utilisez une seringue de 1 ml avec une aiguille de 23 à 25 G. Injecter environ 0,2 ml par 100 g de poids corporel du rat pendant 30 min d'anesthésie.
6. Effectuer le pincement de l'orteil pour vérifier la sensation de douleur et de corroborer l'anesthésie appropriée. Une réaction à la pince profonde d'orteil (par le retrait du membre postérieur) indique l'anesthésie insuffisante.

2. Configuration chirurgicale

1. Stérilisez tous les équipements dans un stérilisateur de perles de verre autoclave ou chaud avant le début de la chirurgie. Nettoyer la zone chirurgicale avec 70% d'éthanol.
2. Utilisez des gants en latex et une blouse de laboratoire avant de commencer l'intervention.
3. Placez un drapé chirurgical stérile sur le banc propre (Figure 1A).
4. Stériliser les micro-ciseaux et un otoscope avant la chirurgie pour minimiser l'infection de l'oreille (Figure 1B).
5. Placez les micro-ciseaux et l'otoscope dans la zone stérile.
6. Placez le rongeur dans le champ chirurgical et en alignement avec le chirurgien.
7. Procéder à l'induction chirurgicale de la LCH.

3. Induction chirurgicale de la perte auditive conductrice

1. Placez la queue et la tête du rongeur alignés dans une position encline, la tête la plus proche du chirurgien.
2. Visualisez l'oreille gauche et droite du rongeur sous otoscope pour assurer la membrane tympanique saine (Figure 2a). Évaluer l'oreille droite et gauche de chaque rongeur pour vérifier l'état de santé avant l'induction de la LCH.
3. Prenez l'hélice de l'oreille et étendez le canal auditif externe (c.-à-d. le canal auditif, le meatus auditif externe, le canal auditif ci-temps) pour faire obscurcir l'intérieur et noircir par la profondeur. Ici, le canal auditif est rendu perpendiculaire à la surface du TM.
   REMARQUE : Assurez-vous que le cannel auditif est directement parallèle maintenant et que le TM forme un angle droit avec l'axe d'insertion des micro-ciseaux. Il sera visualisé comme un tube noir sans lumière. Parfois, le canal auditif doit être incliné à un léger angle, à environ 15 degrés de la surface planaire du crâne. Cela garantit que la main du chirurgien est perpendiculaire à la surface du TM.
4. Introduire les micro-ciseaux au centre du canal auditif en prêtant attention à ne pas écrémer ou entailler le tissu du canal auditif et procéder légèrement, à environ 5 mm du centre de l'obscurité, poussant vers l'avant doucement à travers le centre de la TM.
   REMARQUE : La ponction TM peut être confirmée par un bruit de bruit lorsque les pointes de micro-ciseaux perforent le TM. Le bruit éclatant peut être entendu à environ 2 min 52 s dans la vidéo. Ce n'est pas un son de ciseaux; c'est un bruit de perforation TM. Comme mesuré post-analyse, le "pop" est d'environ 20 dB SPL plus grand que le son de fond tel qu'enregistré par un microphone à haute fréquence. Il n'est pas nécessaire de vérifier le son "pop" dans cette mesure, la visualisation otoscope est suffisante. L'enquêteur peut avoir besoin de s'assurer qu'un « pop » est entendu au cours de chaque procédure de l'IlL.
5. Ouvrez immédiatement les micro-ciseaux à ressort et tournez trois fois après avoir perforé le TM pour assurer le déplacement de la tête du malleus loin du TM (seulement si le déplacement du malleus est souhaité).
6. Retirez les micro-ciseaux et placez le rongeur sous l'otoscope pour la visualisation.
   REMARQUE : Il est important de noter qu'aucun saignement significatif ne devrait se produire après l'intervention chirurgicale. Euthanasier le rongeur et ne pas procéder à une évaluation comportementale en cas de saignement.
7. Induire la LCH bilatérale en procédant comme ci-dessus dans l'oreille opposée.

4. Visualisation d'otoscope

1. Confirmer une chirurgie réussie de lUNE avec un otoscope utilisant un spéculum de petit diamètre pour visualiser l'oreille moyenne de rongeur.
2. Évaluer chaque rongeur avant et après l'intervention chirurgicale de la LCH sous l'otoscope. Assurer la confirmation de la MT normale (figure 2a) et endommagée TM après l'induction de la LCH (figure 2b).
3. Soins postopératoires pour le rongeur
   1. Placez le rongeur dans la cage de la maison sous une lampe chaude.
   2. Observez l'induction du rongeur après la LCH jusqu'à ce que le rongeur lui-même ait droit.
   3. Injectez le rongeur avec du sérum de glucose (dextrose/saline) pour retrouver conscience et placer le rongeur dans la cage domestique pour la récupération.
      REMARQUE : Utilisez une aiguille de 23 G mlas avec une seringue de 10 ml pour injecter 5 ml de salin après une chirurgie de la LCH.
   4. Injecter le rongeur par intramusculaire avec enréofloxacine antibactérienne 0,05 mg/kg deux fois au cours de la période de récupération de 24 h.
   5. Observez régulièrement le rongeur pour un comportement de douleur ou des symptômes après la chirurgie.

5. Évaluation comportementale (validation de l'induction de la LCH) - réponse de sursaut de clap

1. Corroborer CHL (après confirmation d'otoscope) 24 h post-chirurgie avec l'évaluation comportementale se composant du clap-startle-test.
2. Placez le rat induit par la LCH à côté d'un rat normal dans deux cages adjacentes séparées.
3. Placez les rongeurs dans une pièce silencieuse.
4. Tenez-vous à environ 0,5 m des rongeurs et continuez à applaudir dans des durées également espacées à plusieurs reprises (5 claps ont été choisis et espacés sur 1 seconde).
   REMARQUE : Le sursaut de clap produit par le clap de main mesuré 40 dB SPL plus grand que le bruit de fond tel qu'enregistré par un microphone à haute fréquence.

Résultats

La procédure simple de LCH a été exécutée sur 90 rats et de ce groupe 2 a eu le saignement significatif et 2 n'a pas eu la perte d'audition le lendemain comme évalué par le sursaut comportemental de clap. Ces quatre rats ont été jetés. Les rats doivent être jetés comme décrit par les raisons dans la discussion en raison de complications. Induire la ponction tM et/ou le déplacement/déplacement de malleus (figure 2B) suscitent des manifestations comportementale...

Discussion

Nous décrivons une induction chirurgicale simple de CHL avec la vérification utilisant la visualisation d'otoscope et la réponse comportementale de sursaut de clap dans le rat. Ici nous démontrons la méthode sur le rat et précédemment cette méthode a été appliquée aux gerbilles et aux souris. La méthode peut facilement être adoptée à d'autres rongeurs. L'induction de la LCH permet l'étude d'une forme subtile de perte auditive qui se manifeste par des altérations corticales auditives et des résultats comportementaux psych...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Gants en latex, en polyvinyle ou en nitrile	AMMEX		Utilisez des gants non poudrés 8 mil
Micro-ciseaux à ressort (voir Fig. 1b)	RWD Life Science	S11035-08	Longueur totale de 8,0 cm, avec tranchant de 3,5 mm, ou micro-pinces similaires. Une pince à épiler standard avec action à ressort suffira pour
l’Otoscope mini 3000	HEINE  ;	D-008.70.120M	L’otoscope LED standard suffira
Rat ou souris	JAX labs N’importe		quel petit rongeur  ;
Petite cage à rongeurs	Tecniplast	1284L	Besoin de deux cages pour séparer le rongeur CHL du rongeur entendant. Si les rongeurs sont en contact direct les uns avec les autres, ils se surprendront les uns les autres. Dimensions de la cage 365 x 207 x 140 mm, surface au sol : 530 cm2/82,15 po2