Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Summary

Nous décrivons une méthode pour isoler des cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals suivies par séquençage de RNA unicellulaires. Cette méthode permet des analyses du développement de la lignée endocrine du pancréas, de la cellule hétérogénéité et transcriptomique dynamique.

Abstract

Les cellules endocrines du pancréas, qui sont regroupées en îlots, réglementent la stabilité de glucose de sang et le métabolisme énergétique. Les types cellulaires distincts dans les îlots, y compris les cellules sécrétrices d’insuline β, sont distinguent des progéniteurs endocriniens communes durant le stade embryonnaire. Cellules endocrines immatures étendre via la prolifération cellulaire et mûrissent durant une période de développement longtemps après la naissance. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces processus ne sont pas clairement définis. Unicellulaire RNA-sequencing est une approche prometteuse pour la caractérisation de populations cellulaires distincts et voies de différenciation lignée suivi cellulaire. Nous décrivons ici une méthode pour la cellule unique RNA-séquençage des cellules β du pancréas isolé du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals.

Introduction

Le pancréas est un organe vital métabolique chez les mammifères. Le pancréas est composé de compartiments endocrines et exocrines. Les cellules endocrines du pancréas, y compris les cellules productrices d’insuline β et cellules productrices de glucagon α, cluster ensemble dans les îlots de Langerhans et coordonnée de réguler l’homéostasie du glucose systémique. La dysfonction des cellules endocrines entraîne dans mellitus de diabète, qui est devenue un enjeu majeur de santé publique dans le monde entier.

Les cellules endocrines du pancréas sont dérivés de Ngn3⁺ progéniteurs au cours de l’embryogenèse¹. Plus tard, durant la période périnatale, les cellules endocrines prolifèrent aux îlots immatures de forme. Ces cellules immatures continuent de développer et de devenir progressivement des îlots matures, qui deviennent richement vascularisés pour réguler l’homéostasie du glucose de sang dans les adultes,².

Bien qu’un groupe de facteurs de transcriptionnelles a été identifié qui régulent la différenciation des cellules β, la voie précise de la maturation des cellules β est encore incertaine. En outre, le processus de maturation des cellules β comporte également la régulation de la cellule numéro expansion^3,4 et la génération de l’hétérogénéité cellulaire^5,6. Cependant, les mécanismes de régulation de ces processus n’ont pas été bien étudiées.

Unicellulaire RNA-sequencing est une approche puissante qui peut profil sous-populations de cellules et tracer cell lineage voies développementales⁷. Profitant de cette technologie, la clé des événements qui se produisent au cours du développement des îlots pancréatiques peuvent être déchiffrés au niveau unicellulaire⁸. Parmi les protocoles de RNA-sequencing unicellulaires, Smart-seq2 permet la génération d’ADNc pleine longueur avec une sensibilité améliorée et précision et l’utilisation des réactifs types à bas coût⁹. Puce-seq2 prend environ deux jours pour construire une banque d’ADNc pour séquençage¹⁰.

Ici, nous proposons une méthode pour isoler des cellules marquées fluorescence β du pancréas de foetus pour adultes de souris transgéniques Ins1-DP¹¹, à l’aide de la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et analyse de la performance de transcriptomique à la niveau unicellulaire, utilisant la technologie Smart-seq2 (Figure 1). Ce protocole peut être étendu pour analyser les transcriptions de tous les types de cellules endocrines pancréatiques dans les États normales, pathologiques et vieillissement.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Pékin.

1. pancréas isolement

1. Pour les embryons E17.5 (embryonnaire jour 17,5) :
   1. Estimer embryonnaire jour 0,5 d’après le point dans le temps lorsque la fiche vaginale apparaît.
   2. Sacrifier les souris enceintes en CO₂ administration. Vaporiser la fourrure abdominale avec 70 % d’alcool.
   3. Faire une incision en forme de V avec des ciseaux de la région génitale, s’étendant aux côtes. Ce processus s’ouvre complètement la cavité abdominale.
   4. Disséquer l’utérus hors de la cavité abdominale et le placer dans un plat de 10 cm contenant PBS froid.
   5. Disséquer les embryons de l’utérus avec une pince à pointe fine sous un stéréomicroscope, enlever les autres tissus, tels que le placenta et le cordon ombilical. Placer tous les embryons dans un plat de 10 cm contenant PBS froid.
   6. Déchirer la cavité abdominale des embryons et déterrer les tissus viscéraux avec des pincettes de coude. Transférer les tissus viscéraux dans une boite de fond noir 6 cm contenant PBS froid.
   7. Le pancréas est situé dans le coin supérieur gauche de l’abdomen et l’attache à l’estomac, la rate et du duodénum (jaune pointillé dans la Figure 2 a)¹². Détacher les pancréas du tissu viscéral à l’aide de pinces et de regrouper le tissu pancréatique dans un flacon de 20 mL contenant 5 mL de solution de collagènase froid de 0,5 mg/mL : la collagénase P de 0,5 mg/mL dans le tampon de l’isolement (HBSS contenant 10 mM HEPES, 1 mM MgCl₂ 5 mM de Glucose, pH 7,4).
2. Pour les souris P0-P15 (jour après la naissance 0-15) :
   1. Sacrifier et fixer la souris en respectant les branches d’un morceau de paillasse protecteur avec du ruban adhésif. Vaporiser la fourrure abdominale avec 70 % d’alcool.
   2. Ouvrir complètement la cavité abdominale comme indiqué au point 1.1.3. Ainsi qu’à la gauche de la souris, tirez sur l’intestin. Cette procédure va exposer les lobes duodénales, gastriques et de la rate, du pancréas. Soigneusement disséquer tous les lobes du pancréas (Figure 2 b)¹² et regrouper le tissu pancréatique dans un flacon de 20 mL contenant 5 mL de solution de collagènase froid de 0,5 mg/mL.
3. Pour les souris P18-P60 (jour après la naissance de 18-60) :
   1. Préparer la solution de la collagénase. Rester sur la glace jusqu'à prêt à l’emploi.
   2. Sacrifier la souris et ouvrir la cavité abdominale, comme mentionné ci-dessus (étape 1.1.2 et 1.1.3).).
      Remarque : Ne pas blesser le foie, toute blessure au foie réduira la pression d’écoulement dans le canal cholédoque et réduire l’efficacité de la perfusion de l’étape suivante.
   3. Retirez la xiphoïde. Tirez sur l’intestin, ainsi qu’à la droite de la souris et poussez le lobe gauche et droit médial du foie de chaque côté pour exposer la vésicule biliaire (flèche blanche dans la Figure 2) et le canal cholédoque.
   4. Serrez le duodénum avec une paire de pinces de petit bateau à la position supérieure et inférieure, flanquant le site où le canal cholédoque pénètre dans le duodénum (Figure 2D).
      Remarque : Ne pas clamper les lobes gastriques ou spléniques du pancréas. La solution de collagénase ne coulera pas dans le lobe gastrique et de la rate, du pancréas à l’étape suivante si serré.
   5. Remplir une seringue de 5 mL de solution de collagènase froid de 0,5 mg/mL et insérer une aiguille 30 G dans la vésicule biliaire. Soigneusement et en douceur, manipuler l’aiguille dans le canal cholédoque.
   6. Perfuse le pancréas par l’injection de 1 à 5 mL de solution de collagènase froid de 0,5 mg/mL, selon la taille de la souris. L’injection doit être lent et constant pour que l’aiguille ne glisse pas hors de la gaine et empêcher l’intestin contre l’éclatement sous haute pression liquide. L’injection est terminée lorsque le pancréas est pleinement développé.
   7. Disséquer le pancréas (le jaune pointillé dans la Figure 2D) hors de la cavité abdominale à l’aide de forceps immédiatement après la perfusion. Placer le tissu dans un flacon de 20 mL contenant 5 mL de solution de collagènase froid de 0,5 mg/mL. Si manipuler plus d’une souris à la fois, perfuse les souris un par un et centraliser les tissus dans solution de collagènase froid dans un flacon de 20 mL, jusqu'à ce que toutes les souris ont été disséqués.

2. Digestion de collagénase et l’isolement de l’Islet

1. Le flacon de 20 mL contenant le tissu pancréatique dans un bain-marie à 37 ° C et incuber pendant 3 min équilibrer la température.
2. Agiter doucement le tube pendant 3 à 5 min. Si le tissu pancréatique est bien gonflé, elle dissociera graduellement en morceaux petit tissu jusqu'à ce qu’il est finalement dispersée uniformément. Le temps de digestion varie selon la taille du pancréas et de l’efficacité de la perfusion.
3. Filtrer le produit digéré à travers un tamis en nylon de 0,25 mm dans un tube à centrifuger de nouveau 50 mL. Bien laver le filtre à l’aide d’une seringue de 20 mL contenant PBS glacée.
4. Pour E17.5-P15 pancréas, passez à l’étape 3.1.
5. Pour pancréas P18-P60, centrifuger à 200 x g pendant 1 min et éliminer le surnageant. Remettre en suspension le tissu avec du PBS froid.
6. Verser 5 mL de la suspension des tissus dans un plat de fond noir 6 cm. Les îlots pancréatiques sont des structures de blancs laiteux, petits, compacts et tissu acinaire est lâche et translucide blanc. Choisir des îlots avec une pipette μL 200 et transférez-les dans un tube de 1,5 mL contenant une petite quantité de froid PBS.

3. la trypsine Digestion du tissu pancréatique ou îlots

1. Centrifuger le tube contenant du tissu pancréatique ou îlots à 200 x g pendant 1 min à 4 ° C et éliminer le liquide surnageant sans déranger le culot.
2. Resuspendre le culot avec 0,25 % de trypsine-EDTA et incuber dans un bain-marie à 37 ° C. Après 4 min d’incubation, doucement et parfois aspirer (pipette) pendant 1 min à l’aide de 200 conseils μL.
   Remarque : Pour E17.5-P3 pancréas, ajouter 1 mL de trypsine-EDTA. Pour pancréas P4-P15, ajouter 3 mL trypsine-EDTA. Pour les 100-300 îlots, ajouter 1 mL de trypsine-EDTA. Réglez le volume de la trypsine-EDTA selon la quantité de tissu.
3. Arrêter la digestion en ajoutant 0,4 x volume de sérum froid fœtal (SVF) et mélanger en douce vortex.
4. Centrifuger à 250 x g pendant 3 min à 4 ° C. Éliminer le liquide surnageant sans déranger le culot.
5. Remettre en suspension les cellules avec tampon de 200 μL froid FACS (HBSS contenant 1 % FBS, pH 7,4). Transférer les cellules dans un tube de 5 mL FACS.
6. Rapidement tourner le tube de FACS pour permettre la suspension cellulaire de passer par le filtre pour enlever les débris non digérés grand tissu. La suspension monocellulaire dans le tube est maintenant prête pour le tri des FACS.

4. single-cell lyse

1. Préparer le tampon de lyse cellulaire.
   Remarque : Effectuez toutes les expériences sous une hotte de stérilisation UV avec hotte à flux laminaire. Tous les tubes, les plaques et les pointes de pipette devraient être RNase - DNase- libre. Décontaminer le capot et les pipettes avec solution away RNase avant utilisation.
   1. Décongeler les réactifs sur la glace : dNTP (10 mM), primer oligo-dT (10 μM) et SCGDE stock solution (01:20).
   2. Diluer la SCGDE à 1:5 x 10⁵ avec de l’eau exempte de nucléase.
   3. Calculer le volume de tampon de lyse cellulaire nécessaire. Ajouter 0,1 μL d’inhibiteur de RNase (40 U/μl), 1,9 μL de 0,2 % (vol/vol) X-100 Triton, 1 μL de dNTP et 1 μL de primer oligo-dT 0,05 μL de SCGDE dilué pour un volume final de 4,05 μL de chaque cellule.
   4. Aliquoter le tampon de lyse cellulaire en tubes PCR de 0,2 mL mince-mur 8 bandes ou plaques 96 puits. Centrifuger les tubes ou les planches pendant 30 s à 4 ° C.
      Remarque : Centrifuger les tubes PCR de 0,2 mL mince-mur 8 bandes à 7500 x g et plaques 96 puits à 800 x g dans les étapes suivantes.
2. Cueillette de cellule unique et lyse.
   1. Manuellement pic FACS Trier monocellules Ins1-DP⁺ dans un tampon FACS dans 8-bande des tubes PCR à l’aide d’une pipette capillaire de 30 à 40 µm ou directement Trier monocellules Ins1-DP⁺ dans des plaques à 96 puits. Le volume contenant une seule cellule est considérée être inférieure à 0,3 μL.
      Remarque : Utilisation des nuages de points avant hauteur (FSC-H) vs avant zone de dispersion (FSC-A) stratégie de blocage pour discrimination doublet, FSC-H vs côté zone de dispersion (SSC-A) pour les débris et fluorescence gating Ins1-DP⁺ dans le tri cellulaire (Figure 3 a-3C). Pour la méthode de cueillette, trier les cellules cibles dans un tube de 1,5 mL contenant 300 μL FACS tampon. La concentration finale appropriée est de 5 à 10 cellules/μl. Ajuster le volume tampon en conséquence. Pour la méthode collection, trier une seule cellule dans chaque puits d’une plaque de 96 puits suivant le manuel de l’instrument. ^{7 , 13}
   2. Vortex tubes ou plaques à lyser les cellules et libérer l’ARN. Centrifuger les tubes ou les planches pendant 30 s à 4 ° C et immédiatement les placer sur la glace.
      Remarque : Les cellules peuvent être stockées à-80 ° C pendant une semaine.

5. cellule unique cDNA Amplification

1. Transcription inverse (RT).
   1. Décongeler les réactifs de RT (tableau 1) sur la glace.
   2. Incuber les échantillons à 72 ° C pendant 3 min et mettre immédiatement les tubes ou des plaques sur la glace pendant au moins 1 min. Centrifuger brièvement les tubes ou les planches pendant 30 s à 4 ° C.
      Remarque : Utilisez un thermocycleur avec un couvercle de 105 ° C chauffé pour tous les incubations.
   3. Préparer le mélange de RT pour toutes les réactions, comme décrit dans le tableau 1.
   4. Ajouter 5,7 μL de mélange RT à chaque échantillon pour porter le volume à un total de 10 μL. Doucement le mélange de vortex et centrifuger pendant 30 s à 4 ° C.
   5. Placer les échantillons dans un thermocycleur et démarrez le programme RT comme suit : 42 ° C pendant 90 min, 10 cycles (50 ° C pendant 2 min, 42 ° C pendant 2 min), 70 ° C pendant 15 min et maintenez à 4 ° C.
2. Avant l’amplification par PCR.
   1. Décongeler les réactifs PCR (tableau 2) sur la glace.
   2. Préparer le mélange PCR pour toutes les réactions, comme décrit dans le tableau 2.
   3. Ajouter 15 μL de mélange PCR pour chaque échantillon, qui contient les réactions du premier-brin. Doucement le mélange de vortex et centrifuger pendant 30 s à 4 ° C.
   4. Placer les échantillons dans un thermocycleur et démarrer le programme PCR suivant : 98 ° C pendant 3 min, 18 cycles (98 ° C, 20 s, 67 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 6 min), 72 ° C pendant 5 min et maintenez à 4 ° C.
      Remarque : Le produit de la PCR peut être stocké à 4 ° C pendant moins d’une semaine ou à-20 ° C /-80 ° C pendant 6 mois.
3. Purification de la PCR.
   1. Ajouter 25 μL de remises en suspension perles de purification de l’ADN (1 x) pour chaque échantillon de l’étape précédente et mélangez bien en vortex. Puis, faites tourner rapidement le tube ou les plaques à température ambiante pour recueillir le liquide, mais éviter la colonisation de perles.
      NOTE : Equilibrer les perles de purification de l’ADN à température ambiante pendant 15 minutes et vortex avant utilisation.
   2. Incuber 5 min à température ambiante.
   3. Place le tube ou plaque sur un approprié magnétique reposer jusqu'à ce que la solution est claire, puis soigneusement retirer et jeter le surnageant.
   4. Ajouter 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparés pour laver les perles tandis que dans le support magnétique, incuber pendant 30 s, puis soigneusement retirer et jeter la solution d’éthanol.
      Remarque : La solution d’éthanol à 80 % (vol/vol) doit être fraîchement préparée chaque fois.
   5. Répétez l’étape 5.3.4 pour un total de deux lavages.
   6. Avec précaution, retirer et jeter le reste de solution d’éthanol et de l’air sec les perles tout en tube ou plaque est sur le support magnétique.
      Remarque : Éviter de trop sécher les perles pour assurer l’efficacité maximale d’élution.
   7. Ajouter 11 μL d’eau exempte de nucléase pour Éluer la cible de l’ADN de la perle et bien mélanger en vortex. Puis, rapidement tourner le tube ou la plaque et placer sur un support magnétique jusqu'à ce que la solution est claire. Transférer 10 μl de l’échantillon dans un nouveau tube PCR.
      Remarque : Si dimères existent après un rond simple de purification, basée sur la taille de la cDNA distribution détection, purifier à nouveau pour enlever les dimères complètement. Les dimères peuvent influer sur le calcul de rendement d’ADNc si autorisé à rester dans l’échantillon.
4. Contrôle de la qualité applicables à l’ARNC.
   1. Choisir au hasard les échantillons pour détecter le rendement total de cDNA en utilisant un fluorimètre.
   2. Évaluer les niveaux d’expression de gène marqueur par PCR en temps réel (qPCR) (Figure 4E). Retirer 1 μL d’échantillon à diluer 40 fois et effectuer à l’aide d’une plaque 384 puits de qPCR. Préparer le mélange de qPCR tel que décrit dans le tableau 3. Conditions de cyclisme : 95 ° C pendant 10 min, 45 cycles (95 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 15 s).
   3. Choisir au hasard les échantillons pour détecter la distribution de taille en utilisant un instrument de l’électrophorèse capillaire parallèle.

6. cDNA Library Construction

1. Réaction de Tagmentation par la transposase Tn5.
   1. Détecter le rendement total de l’ADNc des cellules qPCR-sélectionné à l’étape 5.4.2 utilisant un fluorimètre. Utilisation 2 ng de l’ADNc comme produit de départ.
   2. Décongeler les réactifs de réaction tagmentation (tableau 4) sur la glace.
   3. Préparer la réaction de tagmentation dans un tube de PCR de 0,2 mL mince-mur 8 bandes, tel que décrit dans le tableau 4et mélanger soigneusement en vortex. Puis, faites tourner rapidement vers le bas de la solution à température ambiante.
   4. Incuber les échantillons à 55 ° C pendant 10 min et de tenir à 4 ° C.
   5. Immédiatement ajouter 2 μL de 5 x TS dans chaque échantillon contenant la tagmented ADN pour arrêter la réaction. Mélanger soigneusement par vortex et ensuite faites tourner rapidement vers le bas de la solution à température ambiante.
   6. Incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante. L’ADN doit être traité immédiatement pour l’enrichissement final PCR.
2. Amplification de fragments adaptateur-ligaturé.
   1. Décongeler les réactifs PCR (tableau 5) sur la glace.
   2. Préparer le mélange PCR de l’enrichissement, comme décrit dans le tableau 5et mélanger soigneusement en vortex. Puis, faites tourner rapidement vers le bas de la solution à température ambiante.
   3. Effectuer la PCR en utilisant le programme suivant : 72 ° C pendant 10 min, 98 ° C pendant 30 s, 8 cycles (98 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 3 min), 72 ° C pendant 5 min et maintenez à 4 ° C.
      Remarque : Le nombre de cycles dépend de la quantité d’ADN de bibliothèque attendue.
3. Purification de la PCR avec sélection de la taille.
   1. Ajouter 14 μL de remises en suspension perles de purification de l’ADN (0,7 x) pour chaque échantillon de l’étape précédente et mélangez bien en vortex. Puis, rapidement tourner le tube à température ambiante pour recueillir le liquide, mais éviter la colonisation de perles.
      NOTE : Equilibrer les perles de purification de l’ADN à température ambiante pendant 15 minutes et vortex avant utilisation.
   2. Incuber 5 min à température ambiante.
   3. Placer le tube sur un support magnétique approprié jusqu'à ce que la solution est claire, soigneusement le surnageant de transfert à une nouvelle bande de tube et jeter la bande précédente de tube.
   4. Ajouter 3 μL de remises en suspension perles de purification de l’ADN (0,15 x) à chaque échantillon dans la bande de tube et mélangez bien en vortex. Puis, rapidement tourner le tube à la température ambiante.
   5. Incuber 5 min à température ambiante.
   6. Place le tube ou plaque sur un approprié magnétique reposer jusqu'à ce que la solution est claire, puis soigneusement retirer et jeter le surnageant.
   7. Ajouter 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparés pour laver les perles tandis que dans le support magnétique, incuber pendant 30 s, puis soigneusement retirer et jeter la solution d’éthanol.
      Remarque : La solution d’éthanol à 80 % (vol/vol) doit être fraîchement préparée chaque fois.
   8. Répétez l’étape 6.3.7 pour un total de deux lavages.
   9. Avec précaution, retirer et jeter le reste de solution d’éthanol et de l’air sec les perles tout en tube ou plaque est sur le support magnétique.
      Remarque : Éviter de trop sécher les perles pour assurer l’efficacité maximale d’élution.
   10. Ajouter 11 μL d’eau exempte de nucléase pour Éluer la cible de l’ADN de la perle et bien mélanger en vortex. Puis, rapidement tourner le tube ou la plaque et placer sur un support magnétique jusqu'à ce que la solution est claire. Transférer 10 μl de l’échantillon à une nouvelle bande de tube.
4. Contrôle de la qualité d’ADNc final.
   1. Mesurer la concentration de chaque bibliothèque à l’aide d’un fluorimètre et vérifier la granulométrie en utilisant un instrument de l’électrophorèse capillaire parallèle.
      Remarque : Le rendement de l’ADN est généralement entre 15 et 25 ng pour chaque bibliothèque. Les fragments allant de 250 bp 450 bp est observé. Si les dimères restent après purification, comme l’a confirmé le contrôle de distribution de taille, purifier avec 1 x perle de purification de l’ADN, une fois de plus.
5. Mise en commun de bibliothèque
   1. Selon la taille de fragment approximative, quantités égales de pool d’ADN de chaque échantillon, en veillant à ce qu’aucun d'entre eux contiennent les mêmes combinaisons de cartes N6XX et N8XX.

7. séquençage de l’ADN

1. Bibliothèques du sujet avec code à barres au séquençage de single-end bp 51 en utilisant un système de séquençage haut-débit. Effectuer le séquençage suivant le protocole du fabricant. La profondeur de séquençage de chaque cellule est environ 1 million se lit en moyenne⁸, au moins 0,5 millions lit par cellule¹⁴.

8. Analyses bioinformatiques

1. Séquençage de l’évaluation de la qualité et l’alignement.
   1. Évaluer la qualité des lectures séquencées à l’aide de FastQC (v0.11.3)¹⁵ avec les paramètres suivants : « fastqc--extrait -o output_dir input_fastq ».
   2. Fusionner le génome de la souris avec les séquences SCGDE en utilisant la commande « cat mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa ».
   3. Construire bowtie2 indice¹⁶ (v2.2.5) avec les paramètres suivants : « bowtie2-build mm10_ERCC.fa mm10_ERCC ».
   4. Aligner les lectures à l’aide de tophat2 (v2.1.0)¹⁷ avec les paramètres suivants : « tophat2 -o output_dir -G gene.gtf--transcriptome-index trans_index mm10_ERCC input_fastq ».
2. Quantifier les niveaux d’expression de gène.
   1. Comte mappé lit pour chaque gène à l’aide de HTSeq (v 0.6.0)¹⁸ avec les paramètres suivants : '' htseq-comte, bam -f - r pos -s pas - une 30 gene.gtf accepted_hits.bam > read_count.txt''.
   2. Normaliser les niveaux d’expression de gène aux transcriptions par million (TPM)¹⁹.
3. Contrôle de la qualité des cellules.
   1. Exclure les cellules avec moins de 0,5 millions de lectures mappés ou moins de 4 000 gènes (TPM > 1).
      NOTE : le critère d’exclusion dépend sur les types de cellules et de la profondeur de la séquence.
   2. Conserver les cellules expriment des marqueurs endocrines (p. ex., Ins1 pour les cellules β, Gcg pour cellules α) et exclure les cellules expriment des marqueurs non endocrines (p. ex., Spi1 de leucocytes).
4. Analyse en composantes principales (PCA)
   1. Identifier les gènes très variables selon SCGDE spike-ins, comme précédemment décrit²⁰.
   2. Effectuer des PCA à l’aide de la fonction « APC » dans le R package FactoMineR (v1.31.4)²¹, avec log2(TPM + 0.1) de gènes très variables.
   3. Visualiser les résultats de l’APC avec ggplot2 (v2.0.0)²².
5. Hiérarchique de clustering.
   1. Identifier les gènes avec les plus hautes charges composantes principales (PC) en utilisant la fonction « dimdesc » FactoMineR (v1.31.4)²¹.
   2. Effectuer un regroupement hiérarchique à l’aide de la fonction « heatmap.2 » dans le R paquet gplots (v3.0.1)²³, avec log2 (TPM + 1) les valeurs relatives de haute PC chargement des gènes.

Results

Pancréas ont été disséqués souris embryonnaires, néonatals et postnatals (Figure 2 a et 2 b). Pour plus de jours après la naissance 18 souris, l’effet digestif dépend du degré de perfusion ; par conséquent, l’injection est l’étape la plus importante pour l’isolement des îlots pancréatiques (Figure 2-2E et le tableau 6). Autant collagénase a été injectée comme c’...

Discussion

Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode efficace et facile à utiliser pour étudier les profils d’expression unicellulaire des cellules β pancréatiques. Cette méthode pourrait être utilisée pour isoler les cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals et d’effectuer des analyses transcriptomiques unicellulaires.

L’étape la plus critique est l’isolement des cellules β unique en bon état. Pancréas complètement perfusés répondent mieux à la digestion ultérieure....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagénase P	Roche	11213873001
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	Thermo Fisher Scientific	25200114
Sérum fœtal bovin (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Dumont #4 Forceps	Roboz	RS-4904
Dumont #5 Forceps	Roboz	RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Longueur	Microscope stéréo BD	305106
	Zeiss	Stemi DV4
	Zeiss	Stereo Lumar V12
	Centrifugeuse Eppendorf	5810R
Eppendorf	5424R
Tube à fond rond en polystyrène avec capuchon de crépine	BD-Falcon	352235
Microplaque PCR 96 puits	Axygen	PCR-96-C
Tapis d’étanchéité en silicone	Axygen	AM-96-PCR-RD
Tube PCR à puits mince	Extragène	P-02X8-CF
Trieur de cellules	BD Biosciences	BD FACSAria
Pipette capillaire	Sutter	B100-58-10
RNaseZap	Ambion	AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix	Life Technologies	4456740
Eau distillée	Gibco	10977
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
dNTP mix	New England Biolabs	N0447
Inhibiteur de la RNase recombinante	Takara	2313
Superscript II transcriptase inverse	Invitrogen	18064-014
Tampon premier brin (5x)	Invitrogen	18064-014
DTT	Invitrogen	18064-014
Bétaïne	Sigma-Aldrich	107-43-7
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Eau sans nucléase	Invitrogen	AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)	KAPA Biosystems	KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP billes	Vazyme	N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	Vazyme	Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Prep Kit de préparation V2 pour Illumina	Vazyme	TD502	Comprend 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 pour Illumina	Vazyme	TD203	Comprend 16 N6XX et 24 N8XX
Kit d’analyse de fragments NGS haute sensibilité	Advanced Analytical Technologies Advanced Analytical Technologies	DNF-474
1x HBSS sans Ca2+ et Mg2+			138 mM NaCl ; 5,34 mM KCl 4,17 mM NaHCO3 ; 0,34 mM Na2HPO4 0,44 mM KH2PO4
		d’isolement	1 × ; HBSS contenant 10 mM d’HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucose, pH 7,4
tampon			1 & times ; HBSS contenant 15 mM HEPES, 5,6 mM de glucose, 1 % FBS, pH 7,4
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2393
Oligo-dT30VN amorce			5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO
			5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR
amorces			5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Amorce			5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'
Gapdh Amorce			5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Amorce			avant 5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'
Ins2 Amorce			inversée 5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'