Article de méthode

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

DOI :

10.3791/58001

⸱

30 juin 2018

 ,  , 
1Virus Research & Development Laboratory, Statens Serum Institut, 2Infectious Disease Research Unit, University of Southern Denmark

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un protocole pour l’extraction des acides nucléiques virus rapide de virus inactivés Germains. L’extraction est effectuée directement dans les tubes de prélèvement sanguin et ne nécessite aucun équipement ou l’électricité. La méthode ne dépend pas des installations de laboratoire et peut être utilisé n’importe où (par exemple, dans des hôpitaux de campagne).

Résumé

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Le diagnostic rapide d’une infection est essentiel pour la gestion des épidémies, le confinement de risque et les soins aux patients. Nous avons déjà montré une méthode pour l’inactivation rapide chevet du virus Ebola lors des prélèvements sanguins pour les tests de sécurité d’acide nucléique (NA) en ajoutant un tampon de lyse/liaison commerciale directement dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide. Avec cette approche de chevet inactivation, nous avons développé une sûre, rapide et simplifiée chevet NA méthode d’extraction pour la détection ultérieure d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. L’extraction de la NA est effectuée directement dans les tubes de prélèvement sanguin et ne nécessite aucun équipement ou l’électricité.

Après que le sang est prélevé dans le tampon de lyse/liaison, les contenus sont mélangés en retournant le tube à la main, et le mélange est incubé pendant 20 min à température ambiante. Particules de verre magnétique (POP) sont ajoutés au tube, et le contenu est mélangé en retournant le tube de prélèvement à la main. Pop est ensuite recueillies sur le côté du tube de prélèvement à l’aide d’un support magnétique ou un aimant et un élastique. Les pop est lavées trois fois, et après l’addition de tampon d’élution, directement dans le tube de prélèvement, le NAs sont prêt pour les tests de NA, comme qPCR ou amplification isotherme boucle (lampe), sans l’élimination des pop de la réaction. La méthode d’extraction de NA ne dépend pas des installations de laboratoire et peut facilement être utilisé n’importe où (par exemple, dans les hôpitaux de campagne et les salles d’hôpital isolement). Lorsque cette méthode d’extraction de NA est combinée avec lampe et un instrument portatif, un diagnostic peut être obtenu au sein de 40 min de la collecte de sang.

Introduction

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En cas d’épidémie de virus, lorsque les patients sont confinés à l’hôpital d’isolement ou lorsqu’un diagnostic rapide est nécessaire, un diagnostic moléculaire précis, simple et sûr de point-of-care est impératif pour le confinement des soins et risque patient. Les deux récentes éclosions virales, du virus Ebola (EBOV) en Afrique de l’Ouest (2013) et le virus Zika en Amérique du Sud (2015), ont augmenté l’intérêt pour l’amélioration point-of-care moléculaires tests diagnostiques, comme isotherme boucle-négociée de transcription inverse amplification (RT-lampe)1,2 et recombinase polymérase amplification (RPA)3,4. RT-lampe tant l’APR sont des tests moléculaires rapides, sensibles et spécifiques qui peuvent être effectuées sur les préparatifs de l’exemple simplifié. Pour le virus Zika, RT-lampe a été combinée avec un essai d’écoulement latéral (LFA), qui peut détecter des virus Zika dans des échantillons de sang total non épurées dans 30 min1; Toutefois, pour EBOV, qui est classé comme un pathogène de groupe 4 risque et est extrêmement contagieuse, les échantillons doivent être gérées en vertu de la biosécurité de niveau 4 (BSL-4) les conditions et inactivés avant toute procédure de diagnostic sûr puisse être exécutée.

Méthodes d’inactivation simplifiée pour EBOV, telles que l’ajout de tampons de la lyse de l’échantillon2,3,4,5, ont été utilisés lors de l’épidémie ; Cependant, ces méthodes nécessitent un traitement dans des conditions de BSL-4 avec matériel de laboratoire, tels que BSL-3 armoires de biosécurité, centrifugeuses, blocs de chauffage et pipettes, au minimum. Cet équipement n’est pas normalement présent dans les quartiers d’isolement ou dans des hôpitaux de campagne. Pour relever ce défi, a tenté d’effectuer des diagnostics de valises3et plusieurs appareils portables et les machines ont été développées [par exemple, un appareil portatif pour l’extraction des acides nucléiques (NA)]6. Toutefois, les échantillons positifs EBOV encore besoin être inactif avant que ces dispositifs peuvent être utilisés.

Nous avons déjà rapporté une méthode d’inactivation des virus chevet rapide pour le EBOV7, virus de la vaccine et Cowpox virus8 par addition d’un tampon de lyse/liaison commerciale pour les tubes de prélèvement sanguin sous vide ordinaire, permettant le direct transfert de sang du patient dans l’inactivation tampon7. Cette inactivation directe et immédiate dans un système fermé élimine le besoin de manipuler les échantillons à l’aide de n’importe quel un confinement rigoureux, tels que BSL-4 conditions7, et les échantillons peuvent être traités dans des conditions normales de BSL-2. Cette méthode d’inactivation est compatible avec plusieurs systèmes d’extraction de la NA, tels que les robots et main purification kits7; Cependant, ces méthodes nécessitent des équipements de laboratoire, tels que les robots, centrifugeuses et l’électricité, qui ne sont pas toujours présents sur le terrain ou à l’intérieur de l’hôpital d’isolement.

Dans ce rapport, nous décrivons une sûre, rapide et simplifiée NA extraction méthode manuelle pour la détection moléculaire ultérieure d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. La méthode d’extraction de NA ne nécessite pas un équipement autre qu’un magnet/Magnet holder. Aucun centrifugeuses, blocs, ou électricité de chauffage ne sont nécessaires pour l’extraction de NA. Par conséquent, cette méthode ne dépend pas des installations de laboratoire et peut facilement être utilisé n’importe où (par exemple, dans des hôpitaux de campagne, dans les salles d’hôpital d’isolement, ou avec faibles ressources). La méthode d’extraction de NA est rapide et simple et peut être utilisée directement dans les tests de NA en aval, comme qPCR, RT-qPCR, lampe ou RT-lampe. Cette méthode d’extraction de NA est associé à la lampe et un instrument portable isotherme axée sur la batterie, un chevet diagnostic puisse être obtenu dans 40 min de la collecte de sang.

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Protocole

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Le Comité sur l’éthique de la recherche biomédicale, région de la capitale a donné un consentement éclairé, et toutes les méthodes décrites ici ont été exemptés de l’examen par le système des comités éthiques, conformément à la loi danoise sur les projets de développement de test.

1. préparation des Tubes sous vide de prélèvement sanguin pour l’Inactivation des Virus et Extraction rapide de NA

ATTENTION : La mémoire tampon utilisée pour ce protocole contient guanidinium thiocyanate (GITC) et un agent tensio-actif non ionique, qui sont irritants. Prendre des mesures de sécurité de laboratoire appropriés, utiliser une hotte à flux et porter des gants pour manipuler. Éviter toute peau et contact avec les yeux. Si la mémoire tampon a été renversé, la surface contaminée ne doit jamais être désinfectée directement avec la chloramine ou hypochlorite de sodium (les ingrédients actifs de « bleach ») parce que ce mélange peut conduire à la formation de cyanure toxique. Tout d’abord, enlever le tampon déversé avec du papier absorbant. Ensuite, nettoyez la surface avec l’éthanol à 70 %, puis avec de l’eau et pour finir, utilisez chloramine ou hypochlorite de sodium.

  1. Pour préparer les tubes sous vide de prélèvement sanguin, injecter 1,6 mL de tampon lyse commerciale spécifique dans un tube à vide 4 mL EDTA en perforant le couvercle du tube à l’aide d’une aiguille de 25 x 1 et une seringue de 3 mL.
    Remarque : Ne pas retirer le couvercle du tube. Le vide doit être maintenu.
  2. Stocker les tubes à vide contenant le tampon à la température ambiante jusqu'à utilisation.
    NOTE : Les tubes sont stables pendant au moins 1 an après leur préparation.

2. préparation des tampons pour l’Extraction de NA

  1. Pour préparer les tampons pour une extraction de NA, placer deux 1,8 mL, deux 4,5 mL et un 3,6 mL tubes dans un rack.
  2. Ajouter par pipetage, 960 µL de particules de verre magnétique (POP) à un tube propre 1,8 mL et étiquette avec pop.. remettre en suspension la suspension du projet gazier Mackenzie complètement avant de pipetage il.
    NOTE : Les POP ont tendance à recueillir rapidement au fond du tube.
  3. Ajouter, en pipettant également, 4 mL de tampon de lavage j’ai dans un tube propre 4,5 mL et l’étiquette en tant que WB-1.
    ATTENTION : Tampon de lavage j’ai contient du chlorure guanidinium, qui est irritant. Prendre des mesures de sécurité de laboratoire appropriés, utiliser une hotte à flux et porter des gants pour manipuler. Éviter toute peau et contact avec les yeux.
  4. Ajouter, par pipetage, 1,5 mL de tampon de lavage II dans un tube propre 3,6 mL et étiquetez-le comme WB-2.
  5. Ajouter, en pipettant également, 3 mL de tampon de lavage III dans un tube propre 4,5 mL et l’étiquette que WB-3.
  6. Ajouter, en pipettant également, 100 µL de tampon d’élution dans un tube propre 1,8 mL et étiquetez-le comme EB.
  7. Conserver les tampons aliquotés à température ambiante jusqu'à l’utilisation.
    NOTE : Les tubes sont stables pendant au moins 1 mois après leur préparation.

3. Blood Collection provenant de Patients présentant des signes et symptômes d’une infection par le Virus

ATTENTION : Prendre des mesures de sécurité de laboratoire appropriées lors de la collecte de sang du patient. Porter des gants et des lunettes. Si le patient est en isolement, s’il vous plaît suivre les procédures de sécurité biologique niveau 4.

  1. Pour collecter par voie intraveineuse du sang du patient, utiliser une aiguille à ailettes avec tube de rallonge de petit calibre et un tube vide de prélèvement contenant un tampon de lyse/liaison. Reposer le bras du patient dans une position à la baisse et positionner le tube de prélèvement inférieur à l’aiguille à ailettes. Insérer l’aiguille à ailettes dans la veine du patient et attacher le tube de prélèvement sous vide à l’extension de petit calibre.
    Remarque : Cela évitera les reflux.
  2. Après la collecte de sang, mélanger le contenu du tube en renversant le tube de 5 à 10 fois.
    Remarque : En raison de la dépression reste dans le tube de prélèvement de sang contenant 1,6 mL de tampon de lyse/liaison, le volume de l’échantillon prélevé sera automatiquement 1,6 mL.
  3. Désinfecter l’extérieur du tube à l’aide d’éthanol à 70 %.
  4. Incuber les tubes pendant 20 min à température ambiante.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici et les tubes de prélèvement de sang peuvent être conservés à-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C ou 37 ° C pendant au moins 1 mois7.
  5. Passez directement à la méthode d’extraction NA simplifiée.

4. simplifier l’Extraction NA germains

  1. Pour purifier les NA de la lyse/liaison inactivés par tampon sang, mélange le contenu du tube en faisant basculer l’aspirateur tube à la main 5-10 x.
  2. Retirez le couvercle du tube délicatement et décharger le couvercle.
  3. Versez l’aliquote préparé de pop. (1 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.
  4. Placer un nouveau couvercle d’un tube de prélèvement de sang non utilisé sur le tube contenant l’échantillon.
  5. Placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé et mélanger le contenu du tube en renversant le tube de prélèvement de sang à la main 5 - 10 fois.
  6. Placer le tube dans le support magnétique et garder un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.
  7. Retourner le support magnétique avec le tube quelques fois à la main pour s’assurer que tous les pop est collectés sur le côté du tube avec l’aimant.
    NOTE : Le support magnétique peut être remplacé par un aimant allongé et un élastique.
  8. Retirez le couvercle du tube et jeter le contenu du tube à l’aide d’une pipette à usage unique ou simplement en versant le contenu dans un tube de prélèvement de 50 mL.
    Remarque : Éviter les aérosols provenant du tube de prélèvement de 50 mL en fermant le tube avec un couvercle.
  9. Verser l’aliquote préparé de WB-1 (4 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.
  10. Placez le couvercle sur le tube et placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.
  11. Retirez le tube du Magnet holder, garder le couvercle bien serré avec un doigt.
    Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube.
  12. Resuspendre le pop en retournant le tube de prélèvement de sang à la main 5 - 10 fois.
  13. Répétez les étapes 4,6 et 4,8.
  14. Verser l’aliquote préparé de WB-2 (1,5 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.
  15. Placez le couvercle sur le tube et retirez le tube du support magnétique.
    Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube.
  16. Placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.
  17. Remettre en suspension le pop en renversant le tube de prélèvement sanguin pendant quelques secondes à la main.
  18. Répétez l’étape 4,6 et 4,8.
  19. Verser l’aliquote préparé de WB-3 (3 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.
  20. Placez le couvercle sur le tube et retirez le tube du support magnétique.
    Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube.
  21. Placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.
  22. Resuspendre le pop en retournant le tube de prélèvement de sang à la main 5 - 10 fois.
  23. Répétez les étapes 4,6 et 4,8.
  24. Versez l’aliquote préparé d’EB (100 µL) directement dans le tube de prélèvement de sang.
  25. Placez le couvercle sur le tube et retirez le tube du support magnétique.
    Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube.
  26. Resuspendre le pop dans l’EB en tapant sur le tube de prélèvement de sang 5 - 10 fois avec un doigt.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici, et les tubes peuvent être conservés à-20 ° C.
  27. Transférer une gouttelette (5-8 µL) de suspension pop au mélange en aval de réaction d’amplification de NA à l’aide d’une pipette à usage unique 1,5 mL (toute amplification en aval de NA diagnostique assay tels que lampe/RT-lampe ou qPCR/RT-qPCR dosages peuvent être utilisés).
    Remarque : Le NAs va s’en tenir à la pop, alors n’oubliez pas d’utiliser le pop dans la réaction d’amplification en aval de NA. Mélanger la suspension du projet gazier Mackenzie avant utilisation. Après avoir mélangé, pop recueillera au fond du tube.

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Résultats

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Le protocole présenté ici est simple et efficace et peut être largement appliqué à n’importe quel test moléculaire à être effectuées sur des échantillons de sang infectieux inactivés avec le tampon de lyse/liaison. Le flux de travail pour l’inactivation de sang et l’extraction de la NA est illustré à la Figure 1, y compris la préparation de sang collection tubes à vide7 (Figure 1 a), le sang collection

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Discussion

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Dans ce rapport, nous décrivons une sûre, rapide et simple chevet NA extraction méthode manuelle pour la détection moléculaire en aval d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. La méthode d’extraction NA décrite a été développée pour être effectuée directement sur des échantillons de sang prélevés dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide contenant la lyse/fixation tampon (Table des matières)7. Cet mémoire tampon spécifique inactive EBOV

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions Susanne Lopes Rasmussen et Solvej Kolbjørn Jensen pour leur assistance technique et pour manipuler les échantillons cliniques. Ce projet fait partie du consortium EbolaMoDRAD, qui a reçu un financement de l’innovants médecine Initiative 2 entreprise commune au titre de la subvention contrat N ° 115843. Cette entreprise commune bénéficie du soutien de la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et l’EFPIA et programme d’innovation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vacutainer K2 Tubes EDTA (4 mL)Becton Dickinson368861
Plus Blood CollectionBecton Dickinson362725
23G x 1 aiguilleBecton Dickinson300800
Luer LOK seringue (3 mL)Becton Dickinson309658
Aiguille papillon avec tube d’extension de petit calibreJø ; rgen Kruuse A/S121714
1 % VirkonNomeco A/S849265
MagNA Pure LC Kit d’isolement d’ADN I - Tampon de lyse/liaison - RechargeRoche Diagnostics A/S03246752001
MagNA Pure LC Kit d’isolement d’acide nucléique totalRoche Diagnostics A/S3038505001
Nunc&trade ; Tubes cryogéniques pour biobanques et cultures cellulaires (1,8 mL)Thermo Fisher Scientific375418
Nunc&trade ; Tubes cryogéniques pour biobanques et cultures cellulaires (3,6 mL)Thermo Fisher Scientific379189
Nunc&trade ; Tubes cryogéniques pour biobanques et culture cellulaire (4,5 mL)Thermo Fisher Scientific379146
DynaMag&trade ;-5 MagnetThermo Fisher Scientific12303D
Pipette de transfert (3,5 mL)Sarstedt86.1171.010
Thermo Scientific&trade ; Samco&commerce ; Pipettes de transfert à pointe fine (1,5 mL)Thermo Fisher Scientific231
Thermo Scientific&trade ; Nunc&commerce ; Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de 50 mLThermo Fisher Scientific339652

Références

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Mots-clés

Particules de verre magn tiquesInactivation viraleDiagnostics au point de serviceTubes de pr l vement sanguinTampon de lyse et de liaisonM thode manuelle au chevet du patientD tection par qPCRAmplification LAMP

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