Article de méthode

Extraction d’ADN de haut débit et le génotypage des larves de poisson zèbre 3dpf de découpage Fin

DOI :

10.3791/58024

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29 juin 2018

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1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

Dans cet article

Résumé

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Poisson zèbre ont été utilisés comme des organismes modèle génétique fiable dans la recherche biomédicale, en particulier avec l’avènement des techniques de modification génétique. Lorsque les larves phénotypes sont supposés, identification de l’ADN d’extraction et de génotype peut être difficile. Ici, nous décrivons une procédure efficace de génotypage pour les larves de poisson zèbre, par coupure de queue, dès 72 h après la fécondation.

Résumé

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Poisson zèbre (Danio rerio) possèdent des orthologues pour 84 % des gènes connus pour être associés à des maladies humaines. En outre, ces animaux ont un temps de génération court, facile à manipuler, afficher un taux de reproduction élevé, faible coût et se prêtent facilement à des manipulations génétiques par microinjection de DNA dans les embryons. Les progrès récents en gène outils d’édition permettent introduction précise de mutations et de transgènes chez le poisson zèbre. Maladie chez le poisson zèbre de modélisation souvent conduit à des phénotypes larvaires et mort prématurée qui peut être difficile à interpréter si génotypes ne sont pas connus. Cette identification précoce des génotypes est également nécessaire dans les expériences nécessitant une mise en commun par exemple, comme gene expression ou masse spectrométrie études. Cependant, une vaste dépistage génotypique est limitée par des méthodes traditionnelles, qui, dans la plupart des laboratoires sont effectuées uniquement sur le poisson-zèbre adulte ou chez les larves post-mortem. Nous avons abordé ce problème en adaptant une méthode d’isolement de l’ADN génomique PCR-prêt de larves de poisson zèbre direct qui peut être réalisé dès la fécondation après 72 h (hpf). Cette fois et une technique rentable, améliorée, passant d’un protocole de génotypage publiées antérieurement, permet l’identification des génotypes de biopsies de nageoire microscopiques. Les ailettes de régénèrent rapidement, car les larves se développent. Les chercheurs sont ensuite en mesure de sélectionner et élever les génotypes désirées à l’âge adulte en utilisant cet procédure de génotypage basées sur la PCR haut-débit.

Introduction

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Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un organisme vertébré largement utilisé comme modèle pour l’enquête de la maladie ainsi que pour les essais précliniques d’hypothèses thérapeutiques1,2,3. Ces animaux ont un temps de génération court, facile à manipuler, afficher un taux de reproduction élevé, faible coût et se prêtent facilement à des manipulations génétiques par microinjection de DNA dans des embryons de4. Par le développement croissant du roman transgénique et gène édition des technologies telles que les doigts de Zinc nucléases (ZFN)5, TAL-comme effecteur nucléases (TAPS)6,7et le cluster régulièrement entrecoupées court Palindromique répète (CRISPR) / associée à CRISPR 9 (Cas9) système8, le poisson-zèbre est prête à améliorer considérablement la compréhension de plusieurs conditions pathologiques. Ces technologies ont été utilisées pour créer débouchures ciblées à la fois somatique et cellules germinales chez le poisson zèbre, efficacement engendering génétiquement modifiés animaux8. Des exemples récents dans la littérature notamment la mise au point de modèles génétiques d’épilepsie et de troubles métaboliques dans le poisson-zèbre3,9,10,11,12 .

Avec les progrès réalisés dans l’édition de génome du poisson-zèbre, rapide et fiable de génotypage est devenu une étape limitante indéniable. Identification des mutations de l’ADN spécifiques adjacentes au site de cible prédit édition de génome est une étape essentielle du protocole. Traditionnellement, techniques de génotypage par découpage fin sont généralement seulement joué dans zebrafish juvénile ou adulte. Cependant, le temps passé à élever poisson zèbre à l’âge adulte (> 2 mois) retarde considérablement les progrès dans la recherche. Dans de nombreux cas, l’âge adulte ne peut être atteint en raison de l’élimination directe des gènes essentiels (par exemple, dans la modélisation de la maladie) ou gain de fonction mutations entraînant des effets phénotypiques préjudiciables. En outre, plusieurs essais nécessitent la mise en commun des larves, comme dans l’extraction de l’ARN ou de métabolite et impliquent donc une identification préalable des génotypes, qui peut être difficile quand un seul post hoc des techniques de génotypage sont disponibles. Ces exemples susmentionnés mettent en évidence l’importance des techniques de génotypage larves qui sont à la fois précise et permettre la récupération complète et un développement normal des larves. Génotypage de poisson-zèbre stade précoce ne semble pas actuellement être largement utilisé ; Ceci se matérialise par des publications récentes de modèles de maladies dans lequel larvaires génotypes sont identifiés par génotypage post-mortem plutôt que le génotypage avant l’exécution de l’expérience12,13,14. Dans cet article, une stratégie de clip de nageoire larvaire est présentée afin d’améliorer les procédures préétablies de génotypage.

Dans le passé, stratégies employant la digestion de la protéinase K au génotype vivent zebrafish larves ont conduit à la variable polymerase chain reaction (PCR) efficacité15. Bien que plus récemment publié technique de biopsie de queue microscopique fourni plus prometteurs résultats16, nous et les autres groupes n’étaient pas en mesure de reproduire le rendement élevé et la récupération de l’ADN par les auteurs. Un revers majeur du protocole décrit par Wilkinson et al. 16 pourrait être le transfert du tissu queue au tube PCR. En raison de sa taille microscopique, il est difficile de s’assurer que la nageoire a été correctement recueillie et distribuée par pipetage. Pour remédier à cet obstacle, nous avons développé un protocole amélioré pour un grand nombre de génotypage des larves de poisson zèbre direct avec près de 100 % d’efficacité9. À l’aide d’un microscalpel, l’extrémité de la queue de la nageoire est enlevée et placée sur un morceau de papier filtre. Le morceau de papier filtre contenant le tissu peut être facilement visualisé et correctement placé dans un tube PCR. Extraction de l’ADN génomique est ensuite effectuée, suivie par amplification par PCR de la région d’intérêt au génotype du spécimen. Les avantages de cette méthode incluent une haute efficacité PCR, un faible taux de faux positifs et un faible taux de mortalité. En outre, le génotypage d’un grand nombre d’embryons est possible en utilisant ce protocole. Le protocole décrit ci-après permet de nageoire-découpage des centaines de larves dans les 2-3 h à l’aide de cette approche et l’identification correcte des poissons génotypés et régénération de la queue dans les deux jours.

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Protocole

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Procédures avec des sujets animaux ont été approuvés et sont conformes aux directives de protection des animaux prévues par le Conseil canadien sur les soins de l’Animal et l’Université d’Ottawa des comités de protection des animaux.

1. préparation

  1. Préparation de la surface de la dissection par du ruban adhésif un couvercle de boîte de Pétri de 9 cm avec ruban autoclave sur sa surface intérieure. Positionnez-le sous un stéréomicroscope.
  2. Lieu de fécondation après 3-5 jours (dpf) des larves de poisson zèbre dans un Petri plat et anesthésier en ˜1.5 mM tricaïne dans les médias d’embryon x E3 1 (5 mM NaCl, KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 0,17 mM, pH 7,2).
  3. Couper l’extrémité d’une pointe de pipette P1000 avec une paire de ciseaux ou une lame de rasoir à un diamètre de 2 mm pour recevoir une larve dpf 3 avec un minimum de stress.

2. fin découpage des larves de poisson zèbre

  1. Ramasser une larve anesthésiée à l’aide d’une micropipette P1000 modifiée et placer la larve de poisson-zèbre sur la cassette autoclave positionné sur le couvercle de la boîte de Pétri.
  2. Supprimer les excès solution de tricaïne entourant la larve à l’aide d’une micropipette. La zone doit être aussi sèche que possible de la section et ramasser la nageoire avec succès mais encore humide pour assurer la survie.
  3. À l’aide d’un scalpel micro, section la nageoire caudale sous un microscope stéréo comme indiqué dans la Figure 1, tel que décrit dans Wilkinson et al.,16. Au cours de l’incision, appliquer une pression à la baisse constante au sein du site de gap de pigment de la nageoire caudale, distal par rapport à la limite de la circulation du sang (Figure 1 a). Appliquez une légère pression pour éviter d’endommager la notochorde.
  4. Visualiser la nageoire sectionnée sous le microscope et positionnez le morceau sur le dessus de la pointe de la lame microscalpel (Figure 2 a). Placez le microscalpel contenant la nageoire sur la surface d’un petit morceau de papier filtre.
    Remarque : En raison de la présence de mélanocytes dans le tissu sectionnée, cette étape permet la visualisation de la nageoire comme une petite tache noire (Figure 2 b).
  5. À l’aide de ciseaux et pinces (Figure 2), transférer le papier-filtre contenant la nageoire d’une plaque à 96 puits PCR, contenant 25 μL de solution de NaOH à 50 mM / puits (Figure 2D).
  6. Préparer une plaque à 96 puits à fond plat, le puits selon l’étiquette de la plaque PCR de numérotation. Aide de la pipette de P1000 mis à jour le rempli de 200 µL de supports de neufs 1 embryon x E3, recueillir soigneusement la larve de poisson-zèbre, en exerçant une pression douce. Distribuer la larve dans la plaque de culture de tissus de 96 puits, dans le même numéro ainsi que la plaque de PCR (Figure 2E).
  7. Assurez-vous que le papier filtre est bien immergé dans la solution (Figure 2F). Nettoyer la lame de la microscapel et la pince à épiler entre chaque coupe pour empêcher la contamination croisée en plongeant dans une solution d’éthanol 70 %. Essuyer la lame avec papier propre tissu/essuyer.
  8. Répétez les étapes 2.1-2,7 jusqu'à ce que tous les embryons ont été rognées.
  9. Stocker les larves dans la plaque à 96 puits à 28 ° C, jusqu'à ce que les génotypes ont été identifiés.
    NOTE : Les médias de l’embryon n’a pas besoin d’être changé, étant donné que le protocole peut être facilement réalisé en moins de 2 jours. Si un délai supplémentaire est nécessaire, un changement de support est recommandé.

3. Extraction d’ADN génomique

  1. Sceller la plaque PCR 96 puits et centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 1 min pour s’assurer que tous les papiers de filtre sont immergés dans la solution de NaOH.
  2. Pour la lyse tissulaire, chauffer les échantillons dans un thermocycleur à 95 ° C pendant 5 min, suivie d’un refroidissement à 4 ° C pendant 10 min.
  3. Ajouter 6 μL de 500 mM Tris-HCl, pH 8.0 à chaque échantillon. Vortex.
  4. Brièvement, centrifuger la plaque à 1 500 g, pendant 5 min à température ambiante.
  5. Utiliser 1,5 μL de surnageant ADN par réaction PCR.
  6. Préparer une PCR au génotype les larves, comme indiqué dans le tableau 1-2.
    Remarque : Ce protocole a été testé dans deux applications : multiplex réactions PCR révélant le génotype à l’aide de gels d’agarose9et hétéroduplex fonte assay (HMA) révélant les génotypes à l’aide de gel de polyacrylamide (PAGE) l’électrophorèse17.

4. alternative Extraction génomique à l’aide d’une résine de chélation

  1. Complète étape 2.5 en ajoutant papier filtre avec la nageoire coupée à une plaque PCR 96 puits, contenant 30 μL de 5 % de résine (copolymère styrène-divinylbenzène contenant des ions Iminodiacétate appariés) de chélation.
    Remarque : Ce type de résine est couramment utilisé pour lyse tissulaire et la préparation de l’ADN de PCR-prêt dans une manière rapide et efficace de18.
  2. Suivez les étapes 2.6-2.8 comme indiqué.
  3. Flasque de la PCR 96 puits et centrifuger brièvement les échantillons pour s’assurer que tout le papier filtre est noyés dans la résine de chélation.
  4. Pour la lyse tissulaire, chauffer les échantillons dans un thermocycleur à 95 ° C pendant 15 min, suivie d’un refroidissement à 4 ° C pendant 10 min.
    Remarque : Cette étape permet de lyse et liaison ultérieure des perles résine polaire aux composants cellulaires tandis que l’ADN et l’ARN restent en solution.
  5. Brièvement, centrifuger les échantillons pour les billes de résine à pellets et obtenir de l’ADN dans la suspension.
  6. Suivez les étapes 3,5 à 3,6 pour achever la procédure de génotypage.

5. application 1 : Multiplex PCR suivie d’analyse de Gel d’Agarose

  1. Après le tableau 1, mis en place une réaction de PCR multiplexe permettant la discrimination entre les mutants homozygotes et hétérozygotes larves WT. Un thermocycleur 96 puits permet d’effectuer les réactions de PCR utilisant les cyclisme conditions décrites dans le tableau 3.
    Remarque : Les réactions de PCR est possible aussi dans n’importe quel autre classique PCR thermocycleur. Cet exemple décrit la stratégie PCR utilisée par Pena, et al. 9 identifier aldh7a1 WT et allèles mutants d’insertion 5-PB dans la même réaction multiplexe.
  2. Préparer un gel d’agarose de 1 % dans un tampon de borate de sodium, coloré avec 1 x GelRed.
    Remarque : 20 x stock tampon de borate de sodium est faite de 40 mL de NaOH 10 de M, 1800 mL FD2O, pH ajusté à 8.5 avec 76 g d’acide borique et ensuite complété au volume final de 2 L à l’aide de ddH2O.
  3. Exécutez le gel dans un tampon de borate de sodium 1 x pendant 15 min à 250 V. Pour faciliter le processus, si possible, utilisez un système de gel qui est compatible avec les pipettes multicanaux pour activer les capacités de débit plus élevées en réduisant le temps de charger les échantillons.
  4. Le gel sous lumière ultraviolette (UV) pour permettre la discrimination des génotypes différents de l’image.

6. application 2 : Hétéroduplex fonte Assay

  1. Préparer PAGE 12 % gels à l’aide de la plaque d’écartement de 1,5 mm et les peignes 15-échantillons. Préparer deux gels de PAGE à l’aide de 12,21 mL de ddH2O, 2,52 mL 10 x Tris/Borate/EDTA (TBE), 10 mL de 30 % d’acrylamide, 250 μL de persulfate d’ammonium 10 % (APS) et 20 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED). Utiliser 1 x TBE tampon (0,089 M Tris-HCl, acide borique 0,089 M et 0,002 M d’acide tétraacétique (EDTA)) dans le tampon.
  2. Faire chauffer les produits PCR à 94 ° C pendant 5 min.
  3. Refroidir les tubes sur la glace ou dans le thermocycleur pendant 10 min à 4 ° C.
  4. Charger 10 μL / échantillon PCR et 8 μL de marqueur de poids moléculaire.
  5. Exécutez la PAGE à 150 V 1 x TBE en utilisant un système d’électrophorèse verticale pendant 1 h ou jusqu'à ce que le marqueur de poids moléculaire presque atteint la ligne de pied de la plaque de verre.
  6. Le gel sous UV permettant la discrimination des génotypes différents de l’image.

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Résultats

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L’efficacité de la protocoll a été démontrée par génotypage la descendance d’un croisement hétérozygote (aldh7a1+ / ot100, représenté ici comme aldh7a1+/-) ()Figure 3 a- C)9. L’allèle mutant aldh7a1ot100a une insertion 5-nucléotide (bp) dans le premier exon codante du gène aldh7a1 poisson zèbre qui mène à changement de phase et perte ...

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Discussion

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Gène des outils d’édition ont été utilisées pour introduire précisément les mutations et les transgènes chez le poisson zèbre au cours des dernières années5,6,7,8. Lorsque vous effectuez la maladie chez le poisson zèbre de modélisation, des phénotypes larvaires ou juvéniles précoces sont souvent aperçus9,12,...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

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Les auteurs aimeraient remercier le réseau de mécanisme (RDMM) (financée par les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et Génome Canada) et les modèles de maladies rares. CK est soutenu par une bourse de t (Université d’Ottawa). DLJ est soutenu par une bourse d’études supérieures du Canada Vanier. IAP est soutenu par une bourse postdoctorale d’instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Les auteurs remercient la Genetics Society of America pour l’octroi de l’autorisation de publier le présent protocole et d’utiliser une adaptation de la Figure 5 supplémentaire de Pena, et al.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte de PétriCorning430167
MicroscalpelWorld Precision Instruments500249
StéréomicroscopeNikonSMZ1500
Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfonateSigma-AldrichE10521
96 puits Plaque de culture tissulaireCostar3595
96 puits PCR assietteFisher14230232
NaOHFisherS25548A  ;
Base Tris  ;Sigma-AldrichT1503
NaClFisherBP358-10
KClSigma-AldrichP3911
MgSO4Sigma-Aldrich230391
5 % Chelex 100 sodium formeSigma-AldrichC7901
GelRed 1xBiotium41003
Acide boriqueSigma-AldrichB6768
Système Sub-Cell Model 192Bio-Rad  ;
solution d’acrylamide/bis à 30 %, 37,5 : 1bio-rad.
GoTaq Green Master Mix, 2PromegaM7123
(essuie-glaces jetables Kimwipes® ;)Sigma-AldrichZ188956
marqueur de poids moléculaire de plus de 1 kb ;Thermo ScientificSM1343
Eau sans nucléase  ;Système Sigma-AldrichW4502
Sub-Cell Model 192 (système de gel d’agarose à haut débit)Bio-Rad  ;
système d’électrophorèse vertical sur gel Mini-PROTEAN Tetra Cell  ;Bio-Rad  ;
17045081610158 lingettes en papier 17045081658004

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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