Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

Résumé

Ici, nous décrivons une procédure pour la compensation des tissus, marquage fluorescent et l’imagerie à grande échelle du tissu de cerveau de souris qui, ainsi, permet la visualisation de l’organisation en trois dimensions des types de cellules dans le néocortex.

Résumé

Le néocortex mammifère se compose de nombreux types de neurones excitateurs et inhibiteurs, chacune avec des propriétés électrophysiologiques et biochimiques spécifiques, les connexions synaptiques, et in vivo des fonctions, mais leur base anatomique et fonctionnelle Organisation de cellulaires à l’échelle du réseau est mal comprise. Nous décrivons ici une méthode pour l’imagerie en trois dimensions des neurones marqués fluorescent à travers de vastes zones du cerveau pour l’enquête de l’organisation cellulaire corticale. Certains types de neurones sont étiquetés par l’injection de traceurs fluorescents de neuronales rétrogrades ou l’expression de protéines fluorescentes chez les souris transgéniques. Bloc des échantillons de cerveau, par exemple, un hémisphère, préparés après fixation, rendues transparentes avec des méthodes de compensation des tissus et soumis d’immunomarquage fluorescent des types spécifiques de cellules. Grandes surfaces sont analysés à l’aide de microscopes confocaux ou deux photons équipés d’objectifs de distance de travail grand et platines motorisées. Cette méthode peut résoudre l’organisation périodique des modules fonctionnels spécifiques au type microcolonne cellulaire dans le néocortex de souris. La procédure peut être utile pour l’étude de l’architecture cellulaire tridimensionnelle dans les zones du cerveau différentes et d’autres tissus complexes.

Introduction

Le néocortex mammifère est composé d’un grand nombre de types de cellules, chacune avec les modèles d’expression de gènes spécifiques, les propriétés électrophysiologiques et biochimiques, les connexions synaptiques, et in vivo fonctionne^{1,2 ,3,4,5,6,7}. Si ces types de cellules sont organisés en structures répétées a été peu clair. Les colonnes corticales, y compris les colonnes de l’orientation visuelle et somatosensoriels bari....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par le Comité des expériences sur animaux RIKEN Wako et Comité de sécurité de Experiment RIKEN génétique recombiné et interprétés conformément aux directives institutionnelles des animaleries de la RIKEN Brain Science Institut.

1. préparation de l’imagerie Chambers

1. L’imagerie chambre¹⁹
   1. À partir de feuilles de caoutchouc de silicone, préparer une chambre avec une épaisseur d’environ 5 mm et le plancher des plaques de différentes épaisseurs. Également, préparer des boîtes de Pétri avec et sans un fond de verre (

Résultats

Nous marqué des neurones de projection corticale par l’expression de tdTomato dans Tlx3-cre/Ai9 souris transgéniques et visualisé des neurones de projection cérébrale secondaire par l’injection du traceur rétrograde CTB488 dans la protubérance. L’hémisphère gauche du cerveau était soumis à la méthode SeeDB et analysés à l’aide d’un microscope biphotonique avec une immersion en eau long objectif de distance de travail (25 X, N.A. 1,1, distance de travail 2 mm) et une plat.......

Discussion

Nous avons présenté les procédures pour obtenir des images en trois dimensions à grande échelle de l’organisation spécifique du type de cellule des types de grandes cellules en couche néocorticales souris 5. Par rapport à la coloration de la tranche conventionnelle, la méthode est plus utile dans la détermination de l’organisation en trois dimensions du néocortex. La méthode permet l’acquisition d’images de la plus large et les régions plus profondes du cerveau par rapport à la typique en vivo la microscopie 2 p.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris transgéniques Crym-egfp	MMRRC	012003-UCD
Tlx3-cre Souris transgéniques	MMRRC	36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdSouris Tomato	Jackson Laboratory	JAX #7909
Feuille de caoutchouc de silicone	AS ONE	6-611-01	Épaisseur de 0,5 mm
Feuille de caoutchouc de silicone	AS ONE	6-611-02	Épaisseur de 1,0 mm
Feuille de caoutchouc silicone	AS ONE	6-611-05	3,0 mm d’épaisseur
Boîtes de Pétri	Falcon	351008
Verre de couverture	Matsunami	C022241
Toxine cholérique sous-unité B (recombinante), conjugué Alexa Fluor 488	Invitrogen	C22841
Toxine cholérique sous-unité B (recombinante), conjugué Alexa Fluor 555	Invitrogen	C22843
Toxine cholérique sous-unité B (recombinante), conjugué Alexa Fluor 594	Invitrogen	C22842
Toxine cholérique sous-unité B (recombinante), conjugué Alexa Fluor 647	Invitrogen	C34778
26 G Seringue	Hamilton	701N
Pompe d’injection	KD Scientific	KDS 310	Pons
Pompe d’injection	KD Scientific	KDS 100	Manipulateur supérieur d’injection de colliculus
	Narishige	SM-15
Pentobarbital sodique	Kyoritsu Seiyaku	Somnopentyl
Isoflurane	Pfizer
Lidocaïne	AstraZeneca	Xylocaïne injection 1 % avec épinéphrine
Foret	Toyo Associates	HP-200
Hémostatique microfibrillaire Avitene	Davol Inc	1010090
Alonalfa	Daiichi-Sankyo	Alonalpha A
Soie chirurgicale	Ethicon	K881H
Incubateur	UVP	HB-1000 Hybridizer
Pipette en verre	Drummond Scientific Company	2-000-075
Extracteur d’électrodes	Sutter Instrument Company	P-97
Paraffine Liquide, léger	Nacalai tesque	26132-35
Saline	Otsuka	1326
Paraformaldéhyde	Nacalai tesque	26126-54
Aiguille de tungstène	Inter medical	&Phi ; 0.1 *L200 mm
Vibratome	Leica	VT1000S
50 mL tube plastique	Falcon	352070
&alpha ;-thioglycérol	Nacalai tesque	33709-62
D(-) Fructose	Nacalai tesque	16315-55
BluTack	Bostik	CKBT-450000
Microscope à deux photons	Nikon	A1RMP
Objectifs à longue distance de travail à immersion dans l’eau	Nikon	CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Objectifs à immersion dans l’eau à longue distance de travail	Nikon	CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Platine motorisée	COMS	PT100C-50XY
Filtre	Semrock	FF01-492/SP-25
Filtre	Semrock	FF03-525/50-25
Filtre	Semrock	FF03-575/25-25
Filtre	Semrock	FF01-629/56
Filtre	Chroma	D605/55m
Tube en plastique de 5 mL	AS ONE	VIO-5B
Tube en plastique de 2 mL	Eppendorf  ;
Urea	Nacalai tesque	35905-35
Triton X-100	Nacalai tesque	35501-15
Glyserol	Sigma-aldrich	191612
D(-)-sorbitol	Wako	191-14735
Methyl-&beta ;-cyclodextrin	Tokyo industrie chimique	M1356
&gamma ;- Cyclodextrine	Wako	037-10643
N-acétyl-L-hydroxyproline	Actifs essentiels pour la peau	33996-33-7
DMSO	Nacalai tesque	13445-45
Albumine sérique bovine	Sigma-aldrich	A7906
Tween-20 (1,1 g/mL)	Nacalai tesque	35624-15
Chèvre anti-souris IgG (H+L) Adsorbée croisée Secondaire Anticorps, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21422
Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) anti-Rabbit (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21428
Anticorps IgG anti-souris (H+L) Anticorps secondaire à adsorbe croisé Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21235
Anticorps secondaire anti-souris (H+L) Anticorps secondaire à adsorbe croisé élevé, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206
Microscope confocal	Olympus	FV1000
Objectifs à longue distance de travail par immersion dans l’eau	Olympus	XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuN	Millipore	MAB377
Anti-NeuN	Millipore	ABN78
Anti-CTIP2	Abcam	ab18465
Anti-Statb2	Abcam	ab51502
Anti-GAD67	Millipore	MAB5406
Anti-GABA	Sigma	A2052
Anti-Parvalbumine	Swant	235
Anti-Parvalbumine	Frontier Institute	PV-Go-Af460
Anti-Parvalbumine	Sigma	P3088
Anti-Parvalbumine	Abcam	ab11427
Anti-Somatostatine	Peninsula Laboratories	T-4103
Anti-c-Fos	CalbioChem	PC38

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