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Article de méthode

Abrasion épithéliale cornéenne avec oculaire Burr comme modèle pour la cornée, la cicatrisation

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DOI :

10.3791/58071

⸱

10 juillet 2018

 ,  , 
1Helsinki Institute of Life Science, Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 2School of Medicine and Institute for Science and Technology in Medicine, Keele University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour infliger une abrasion de la surface oculaire de la souris et de suivre la processus de cicatrisation par la suite. Le protocole profite d’une bavure oculaire pour éliminer partiellement l’épithélium de surface de le œil chez les souris anesthésiés.

Résumé

La cornée murine fournit un excellent modèle pour étudier la cicatrisation des plaies. La cornée est la couche la plus externe de le œil et est donc la première défense des blessures. En fait, le type le plus commun de blessure à l’oeil dans la clinique est une abrasion cornéenne. Ici, nous utilisons une bavure oculaire pour provoquer une usure résultant en retrait de l’épithélium cornéen in vivo sur des souris anesthésiés. Cette méthode permet de perturbation épithéliale ciblée et reproductible, laissant les autres zones intactes. En outre, nous décrire la visualisation de l’épithélium abrasée avec coloration de fluorescéine et fournir des conseils concrets sur la façon de visualiser la cornée abrasée. Puis, nous suivons la chronologie de la cicatrisation 0, 18 et 72 h après abrasion, jusqu'à ce que la plaie est re-epithelialized. Le modèle d’abrasion épithéliales de lésion de la cornée est idéal pour les études sur la prolifération des cellules épithéliales, de migration et de ré-épithélialisation des couches cornéens. Toutefois, cette méthode n’est pas optimale pour étudier l’activation stromale lors de la cicatrisation des plaies, car la bavure oculaire ne pénètre pas dans les couches de cellules stromales. Cette méthode convient également pour des applications cliniques, par exemple, de l’essai préclinique de l’efficacité des médicaments.

Introduction

Les couches épithéliales de nombreux organes sont exposés à des blessures. Toutefois, ils contiennent également de la possibilité de compenser pour la perte de tissu grâce à la cicatrisation des plaies. La cornée offre un excellent modèle pour étudier la cicatrisation des plaies. Il forme la surface externe de le œil et fournit une couche de protection pour les machines sensibles oculaire. Ainsi, la cornée fonctionne comme une barrière physique aux pathogènes et aux pertes d’eau. Elle est composée de trois couches ; épithélium et stroma, endothélium. L’épithélium de la cornée constitue la couche la plus superficielle de la cornée. Cellules épithéliales maintiennent la fonction barrière de la cornée en respectant strictement les uns aux autres par l’intermédiaire de jonctions serrées1,2,3. Une membrane de sous-sol cornée acellulaire, membrane de Bowman, sépare l’épithélium du stroma étendue, qui contient des keratocytes réfractaire. Dans le stroma, endothélium canal de nutriments, l’eau et l’oxygène de la couche supérieure.

Abrasion de la cornée est très fréquents dans la clinique4. Lésions de la cornée sont diverses, mais sont en grande partie causées par de petites particules telles que la poussière ou de sable, des égratignures ou autres corps étrangers. Le protocole décrit ici vise à reproduire un type cliniquement pertinent d’abrasion épithéliale cornéenne. Ce faisant, ce protocole fournit une méthode contrôlable et séminale de cliniciens et de chercheurs cornéennes mettre en œuvre leurs propres études. Nous avons effectué un test de réparation in vivo des blessures sur la cornée murine par abrasion les tissus avec une ronce oculaire Terni, l’II Algerbrush. Ici, nous ciblons l’abrasion uniquement à l’épithélium cornéen central et laisser les autres parties de l’organe sans dommages. Ainsi, le protocole est idéal pour l’étude des cellules épithéliales cornéennes dynamique ou de la membrane basale au cours de la ré-épithélialisation, cell migration, la prolifération et la différenciation en vivo5. Récemment, ce modèle a été utilisé pour analyser la dynamique de cellules progénitrices dans la cornée murine, aussi bien quant à dévoiler la capacité des cellules épithéliales cornéennes différenciées en rétablissant le créneau de la cornée des cellules souches après blessure6,7. Suite à l’abrasion, la cornée revient à sa transparence normale et la résistance à la traction. Fait intéressant, une étude in vitro a indiqué que réépithélialisation s’effectue sans de prolifération accrue des cellules8. Ce protocole décrit la chronologie de la guérison sans interruption dans la cornée murine. La méthode est donc applicable pour tester l’effet des drogues sur la guérison des patrons et vitesse.

La cornée a été largement utilisée pour les études de cicatrisation. Cependant, de nombreuses études ont compté sur d’autres modèles de blessure. Un modèle bien établi de lésion de la cornée est la brûlure alcaline qui est effectuée par l’application d’hydroxyde de sodium (NaOH) avec ou sans filtre papier sur la surface cornéenne9. Exposition alcaline provoque une blessure large et diffuse qui affecte non seulement l’épithélium cornéen, mais aussi la conjonctive et stroma9,10. Les solutions alcalines fortes montrent pour provoquer des ulcères cornéens, opacification et une néovascularisation9. Cellules inflammatoires envahissent le stroma généralement dans les 6 h et y restent jusqu'à 24 heures11. Ainsi, blessure alcaline est une méthode utile dans les études liées à l’activation stromale. Un autre type de lésion chimique peut être infligé en appliquant le diméthylsulfoxyde (DMSO) sur la cornée9,10. Autres modèles de lésion couramment utilisés comprennent des plaies cicatricielles qui pénètrent par les blessures de stroma et réfractive, qui sont limités à la partie supérieure du stroma14,15. Ces méthodes sont également utiles pour répondre aux questions au sujet de la guérison des plaies stromales. Modèles de lésion différents ont leurs propres avantages et inconvénients. Abrasion ou débridement, de l’épithélium de la cornée a été développée à l’aide de scalpels ternis ou lames sur ex vivo cornées16. Cette méthode a plus tard été utilisés in vivo sur des souris, rat et lapin17,18,19,20,21,22. À l’aide de la bavure oculaire (Figure 1), nous enlever seulement une zone sélectionnée de l’épithélium, laissant le reste de l’épithélium pas affectée. De cette façon, il est possible de cibler précisément l’élimination épithéliale dans différentes parties de la cornée. En outre, la taille de l’abrasion pouvant être évaluée par la coloration de fluorescéine. En outre, ici, nous suivons fermeture abrasion au cours de la période de cicatrisation.

Cette méthode présente plusieurs avantages, i) y compris la localisation précise du site de l’abrasion, qui n’est pas possible avec lésion chimique, ii) l’abrasion est rapide à réaliser, et iii) il est non invasif. Dans les présentes, nous décrivent la méthode à l’aide de la souris NMRI non-consanguines comme modèle, mais cela pourrait s’appliquer à la vaste gamme de modèles génétiques de la souris, ainsi que pour le rat et le lapin, qui est des modèles communs utilisés pour étudier les perturbations cornée humaine.

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Protocole

Toutes les expériences sont approuvées par le Conseil national d’expérimentation animale.

1. les préparatifs

  1. Préparer toutes les solutions et les garder à température ambiante, sauf indication contraire. Suivre les règlements d’élimination des déchets aux solutions et matériaux dispose utilisé.
  2. Utilisation NMRI et ICR tel stocks, entre les âges 4-12 semaines et ou l’autre sexe. Si vous utilisez la souche C57BL/6, suivre la méthode de préparation de kétamine-médétomidine dans étape 1.3.2. Pour les autres étapes, suivez les instructions décrites dans 1.3.3.-1.3.5.
  3. Preparez la médecine vétérinaire frais et de temps avant l’intervention. Carprofène servira plus tard, donc il n’est pas nécessaire de le préparer à ce stade.
    1. Pour préparer une solution de kétamine-médétomidine anesthésie, mélanger 0,375 mL (concentration en stock 50 mg/mL) de la kétamine (Ketaminol Vet) 0,25 ml (concentration des stocks 1 mg/mL) de médétomidine (Cepetor Vet) et ajouter 1,25 mL stérile 0,9 % NaCl. Administrer de 0,15 mL/20 g de poids de la souris (7,5 mg/kg, la kétamine et 1 mg/kg, médétomidine).
    2. Pour préparer une solution plus diluée de kétamine-médétomidine anesthésie chez la souris C57BL/6, mélanger 0,375 mL (concentration en stock 50 mg/mL) de la kétamine avec 0,25 mL (concentration des stocks 1 mg/mL) de la médétomidine et ajouter 2,5 mL de stérile 0,9 % NaCl. Administrer de 0,15 mL/20 g de poids de la souris (3,75 mg/kg, la kétamine et 0,5 mg/kg, médétomidine).
      NOTE : Ceci est une autre étape, que pour les souris C57BL/6 adultes.
    3. Pour préparer une analgésie Subutex, ajouter 0,1 mL (concentration en stock 0,3 mg/mL) du Subutex à 1,9 mL stérile 0,9 % NaCl. Administrer 0,2 mL/20 g de poids de la souris (0,15 mg/kg).
    4. Atipamézole interruption d’anesthésie, ajoutez pour 0,1 mL (concentration en stock 5 mg/mL) d’Atipamézole à 4,9 mL de 0,9 % NaCl. Administrer de 0,15 mL/20 g de poids de la souris (0,75 mg/kg).
    5. Pour l’analgésie pendant l’anesthésie après utiliser carprofène. Ajouter 0,1 mL (concentration en stock 50 mg/mL) de carprofen à 4,9 mL de 0,9 % NaCl. Administrer de 0,15 mL/20 g de poids de la souris (7,5 mg/kg).
  4. Préparer la solution de coloration fluorescente
    1. Pour visualiser l’abrasion sous la lumière bleu Cobalt (Figure 1), utiliser une solution fluorescente. Préparer une solution de fluorescéine de 0,1 % en première mesure 10 mg de sel de fluorescéine avec une échelle fine, puis l’ajouter à 10 mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    2. Protéger la solution de fluorescéine de lumière et agiter pendant 5 minutes sur un agitateur.
      Remarque : La solution de fluorescéine est sensible à la lumière ; conserver la solution couverte de la lumière. Cette solution peut être conservée à + 4 ° C pendant 2-3 jours. Pour l’usage, il est utile de placer la solution de fluorescéine dans un flacon compte-gouttes qui est utilisé pour les gouttes pour les yeux. Utilisez un filtre stérile lors du déplacement de la solution vers le compte-gouttes.
  5. Nettoyer la pointe de ronce oculaire avant et après utilisation ; tout d’abord avec du PBS puis avec 70 % EtOH. Si vous faites une abrasion à plusieurs souris au cours de la même opération, faire les étapes de nettoyage entre chaque souris.
  6. Mettre la plaque chauffée sur (+ 37 ° C) et placer une serviette en papier sur elle.

2. cornée à l’Abrasion

ATTENTION : Utiliser des vêtements de protection (gants, blouse de laboratoire) quelle manipulation souris. Peser la souris afin d’estimer le volume de médicament à administrer.

  1. Utilisez la méthode scruffing une main pour manipuler la souris23. Administrait mélange de kétamine-médétomidine par voie intrapéritonéale (i.p.) pour le bas-ventre gauche. Placez la souris à une cage individuelle et attendez qu’il s’endormir. Cela prend généralement moins de 5 minutes. Puis, administrer premier Subutex, puis Atipamézole par injection intrapéritonéale. Utilisez la même technique de manutention.
    Remarque : Une fois que l’anesthésie est donné, le protocole ne devrait pas être suspendu à tout moment.
  2. Avant de continuer, assurez-vous que la plaque chauffante est chaude. Placez votre souris anesthésiée sur la plaque chauffante. Le niveau de l’anesthésie est bon si le réflexe de la queue est absent, mais le réflexe de l’orteil est présent. Vérifiez ces réflexes en pinçant la queue et les orteils avec les doigts ou une pince. Ne pas utiliser une force excessive. L’anesthésie sera derniers 20-25 minutes.
  3. Pour créer une abrasion, utilisez la bavure oculaire nettoyée. Faire pivoter la base de la bavure pour mettre en marche les vibrations qui sont essentielle pour faire de l’abrasion. Sentir la vibration dans la main lorsque la meule fonctionne correctement.
    1. Ouvrir un œil à la fois en tenant les paupières séparément avec les doigts. Alors fermement toucher la meule à la cornée et de déplacer l’instrument en arrière ainsi que sur le côté sur la surface oculaire. La vibration de burr interprétera le scratch ; ne pas appuyer sur, secouer ou déchirure de la cornée. Dans la cornée centrale, 20 abraser les mouvements sur la surface est suffisante pour induire la plaie. Ne pas soulever la bavure et essayez de rester dans la région de la cornée à abraser. Acquisition d’une abrasion de taille standard nécessitera plusieurs tours de pratique.

    NOTE : Asepsie cornéenne est possible avant l’abrasion à l’aide de Bétadine solution ophtalmique.

3. imagerie de l’Abrasion

  1. Illuminer la région abrasée Cobalt bleu stylo photonique (Figure 1) et de solution de fluorescéine. La surface oculaire apparaît incolore en lumière ambiante. Après l’application de la fluorescéine, la région abrasée émet une fluorescence verte lorsque illuminant le œil avec la lampe-stylo.
    1. Si nécessaire, ouvrez le œil abrasée de même que dans 2,3 et administrer une goutte de fluorescéine solution du flacon compte-gouttes. Laver l’oeil avec PBS ou 0,9 % NaCl à réduire le fond de la fluorescéine. Utilisez un compte-gouttes ou une pipette pour le lavage. Aspirer le liquide loin avec un chiffon doux et nettoyer les cils, si nécessaire. L’excès de liquide recueille généralement jusqu'à la frontière nasale de le œil, près de l’ouverture du canal lacrymal.
      ATTENTION : Evitez de toucher la cornée tout en cleaining comme les écorchures mineures pourraient être induites.
  2. Prendre des photos de l’abrasion cornéenne.
    1. Pour obtenir des images similaires au cours de chaque séance d’imagerie, utiliser des outils de fixation stable à la lumière de plume de bleu Cobalt et le reflex (Figure 2). Ce protocole prévoit un programme d’installation qui est facile à répéter (Figure 2).
      1. Pour attacher la stylo lumière et la caméra, utilisez une lampe de table avec un bras flexible et pince et un bras réglable appareil photo avec une pince, respectivement. Collier de serrage le stylo lumineux de la lampe de table et de la position juste au-dessus de l’oeil de la souris. Positionnement de la lumière différemment seraient susceptibles de modifier la visualisation de l’abrasion. Une suggestion pour le positionnement de ces outils est décrite à la Figure 2.
    2. Le reflex permet de prendre des photos de le œil. Placer l’animal dans une distance désirée, la position et la mise au point de la caméra (01:12) à la lumière de la salle. Après cela, fermez toutes les autres lampes sauf la lumière du stylo bleu Cobalt.
      Remarque : La poignée de lumière de plume de bande vers le bas ou utilisez un élastique pour garder la lumière sur tout le temps au cours de l’imagerie. Cela pourrait aider si l’image devient floue. Il est plus facile d’effectuer l’étape d’imagerie avec un collègue.

4. se réveiller après Abrasion cornéenne

  1. Administrer la première Subutex, puis Atipamézole par injections i.p.. Utilisez la même technique de manipulation comme dans 2.1.
  2. Déposer une goutte d’antibactériens, fucidin acide onguent (Isathal) aux yeux abrasées et non abrasée pour hydrater et de garder la surface oculaire propre à partir de bactéries après l’anesthésie.
  3. Comme la souris se réveillera en 5 à 20 minutes sur la plaque chauffée, observer la souris au cours de la période de réveil post anesthésique. Quand il devient mobile, placez-le dans une cage individuelle.
    Remarque : Si il prend plus de temps de se réveiller, placez votre souris dans la cage avec un coussin chauffant ou placer la cage entière sur la plaque chauffante et surveiller la souris régulièrement. Alors que l’anesthésie s’estompe, la souris typiquement secoue et atteint vers le haut avec le corps antérieur. Ce comportement doit retourner à la normale en 3-4 heures et ensuite vous pouvez placer la souris à une cage partagée.
  4. Administrer carprofène i.p. pour analgésie et oeil pommade sur deux jours consécutifs après l’abrasion, de même que dans des étapes 2.2. et 4.2.

5. l’imagerie au cours de la cicatrisation des plaies

  1. Dans ce protocole, durée d’utilisation des points 18 h et 72 h après l’abrasion pour observer la fermeture de la plaie.
    1. Pour l’imagerie consécutive, anesthésier les souris comme expliqué au point 2.2.
    2. Prendre des photos comme cela est expliqué dans le 3.
    3. Réveillez les animaux avec Atipamézole i.p. et surveiller la période de réveil comme il est expliqué au 4.3.
      Remarque : si ce n’est continuer le suivi, euthanasier la souris juste après 5.1.2. L’euthanasie est décrite au point 6.1.

6. cornée Collection et enrobage de paraffine

  1. Après le dernier point de temps sacrifier l’animal. Placez votre souris dans une chambre qui peut être remplie de CO2. Remplissent l’air de la chambre de CO2. Lorsque l’animal est immobile, disloquer les vertèbres cervicales en tirant fermement de la base de la queue en appuyant sur la région du cou vers le bas en même temps.
    ATTENTION : Toujours suivre les directives de l’organisme local de bien-être animal.
  2. Recueillir le globe oculaire tout en pratiquant une ouverture dans la peau du côté de le œil avec des ciseaux de dissection. Placez les ciseaux dans le globe oculaire et couper le nerf oculaire pour les sauter le globe oculaire hors de l’orbite. Utilisez les pinces si le œil ne sort pas facilement.
    1. Faire un trou à l’arrière de le œil, sur le côté de la rétine, avec une aiguille 26G pour permettre une pénétration gratuite de solutions à l’intérieur de le œil.
      Remarque : Ne laissez pas les yeux deviennent secs, au lieu de cela, placez-le dans du PBS jusqu’en continuant avec le protocole.
  3. Recueillir le globe oculaire dans un tube de 2 mL avec du PBS. Une pause pas l’expérience à ce stade.
  4. Retirer les PBS et fixer des globes oculaires dans 4 % de paraformaldéhyde (PFA) à + 4 ° C pendant 4-5 heures.
  5. Déplacer le globe oculaire fixe sur une cassette de tissu pour le traitement des tissus. Utilisez un tissu traitement machine et le programme suivant :
    1. Rincer avec du PBS.
    2. Incuber 2 x 45 min dans l’éthanol à 70 % à température ambiante.
    3. Incuber pendant 2 x 1 h dans l’éthanol à 94 % à température ambiante.
    4. Incuber 3 x 45 min dans de l’éthanol absolu à température ambiante.
    5. Incuber 3 x 1 h dans du xylène, à température ambiante et dernier xylène à 37 ° C.
    6. Incuber 3 x 1 h en cire de paraffine à 60 ° C.
  6. Après traitement des tissus, incorporez le globe oculaire dans la paraffine liquide (+ 60 ° C) à l’aide d’un bloc d’encastrement tissu. Placer le œil à l’intérieur du bloc de sorte que c’est sur le côté et la bordure périphérique est vers le haut. Laissez le bloc se solidifier sur une plaque froide pendant 5 à 10 minutes.

7. paraffine Sections de la cornée

  1. Préparer le microtome pour le sectionnement conformément aux instructions de l’institution ou du fabricant.
    ATTENTION : Faites attention lorsque vous manipulez la lame tranchant microtome.
  2. Place un bain-marie avec eau ultrapure à côté le microtome à température ambiante et l’autre avec de l’eau ultrapure chauffé à + 50 ° C.
  3. Faire 5 µm épaisseur importante du globe oculaire.
    Remarque : La lentille se brise facilement au cours de la section. Pour éviter cela, enduire la surface de coupe avec un tissu humide, chaque fois qu’une nouvelle ligne de sections est démarrée. Utiliser l’eau du robinet afin d’humidifier le tissu.
  4. Placez les sections à côté de l’autre dans le bain-marie à température ambiante et puis déplacez-les vers le bain d’eau chaude à l’aide d’une lame de verre. Étirer les sections dans le bain d’eau chaude jusqu'à ce que toutes les rides relax et la matte de sections deviennent.
  5. Sécher les lames de verre avec sections nuit à + 37 ° C.
  6. Joindre les sections aux diapositives en gardant la lame pendant une minute sur une plaque chauffée à + 60 ° C. Après cela, les sections peuvent être directement transformées pour la coloration, les méthodes immunohistological ou conservées à + 4 ° C.

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Résultats

Ce protocole décrit un modèle visant à infliger une blessure à l’abrasion de la cornée de souris et suggère comment suivre et de visualiser le processus de guérison après l’abrasion. Récemment, nous avons utilisé cette méthode pour étudier le rôle des cellules souches épithéliales cornéennes pendant la cicatrisation6. L’utilisation des outils établis est la clé d’une expérience réussie à l’abrasion. Nous et autres, avons utilisé les bavures oculaire Algerbrush II (...

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Discussion

Méthodes blessantes sont populaires outils d’étudier différents aspects de l’homéostasie cornéenne et pathologies. Le modèle de l’abrasion offre une méthode bien maîtrisée pour résoudre des problèmes pertinents en ophtalmologie. Cependant, certains points critiques dans le protocole sont intéressant de souligner. Notamment, des détails présentés au sujet de la médecine vétérinaire, chronologie guérison de blessure et résultat sont optimisés pour une utilisation avec des stocks non consanguins de NMRI et ICR, mais peuvent...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Kaisa Ikkala pour sa précieuse assistance technique et aide perspicace quand s’actualisant cette méthode, ainsi que par la suite au cours de la mise en œuvre à nos questions de recherche centrale. Nous tenons également à remercier le centre d’Animal de laboratoire et Anna Meller pour son aide avec les lignes directrices du travail vétérinaire.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
NMRI sourisEnvigo275
0,9 % NaClutiliser stérile
MedetomidineVetmedicVnr087896Nom du marché : Cepetor Vet
KetamineIntervetVnr511485Nom du marché : Ketaminol
Vet BuprenorfinInvidior3015248Nom du marché : Temgesic
AtipamezolOrion PharmaVnr471953Nom du marché : Antisedan Vet
CarprofenNorbrookVnr027579Nom du marché : Norocarp Vet
1 % pommade oculaire à l’acide fucidineDechraVnr080899Nom du marché : Isathal
Sel de fluorescéineSigma-AldrichF6377
SolutionPBS
Algerbrush ii bavure oculaire ( Pointe 0,5 mm)Algerbrush6.39768E+11
Bleu cobalt stylo lumièreSP ServicesDE/003
Plaque chauffanteKunz Instruments2007-0217
Appareil photo reflex numériqueNikonD80
Bras et pince réglablesNeewer10086132Hauteur 28 cm
Lampe de table avec un bras flexible et une pincePrisma
Lingette douceKimtechScience7552
Chambre
Ensemble d’outils de dissectionOutils scientifiques
SeringuesBeckton Dickinson303172
26G aiguillesBeckton Dickinson303800
2 mL Eppendorf tubeSarstedt689
Casette de tissusSakura Finetech4118F
Machine de traitement de tissus ASP200SLeica
XyleneVWRUN1307
Cire de paraffineMilliporeK95523361
Moule d’enrobage de tissus 32 x 25 x 6 mmSakura Finetech4123
MicrotomeMicromHM355
Bain-marie pour sectionnerOrthex60591
Bain-marie pour sectionnerLeicaHI1210
Lame de microtomeFeatherS35
Lame en verreTh.Geyer GmbH & Co.7 695 019
Eau ultrapureMilliporeMPGP04001MilliQ
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127PFA
saline tamponnée au phosphate à CO2fins

Références

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