Le nombre de nouveaux biomatériaux conçus pour réparer les lésions osseuses importantes est en expansion continue dans le but d’améliorer la guérison osseuse et surmonter les complications associées à la transplantation osseuse. Nous présentons ici une stratégie multidisciplinaire pour les tests de biocompatibilité préclinique de biomatériaux pour la réparation osseuse.
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Article de méthode
Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse
Dans cet article
Résumé
Résumé
Fractures osseuses importantes de non syndiqués sont un défi en chirurgie orthopédique. Bien qu’auto - et greffe osseuse allogénique est excellente pour la guérison des lésions, il y a des complications potentielles à leur utilisation. Ainsi, matériels scientifiques mettent au point des biomatériaux synthétiques, biocompatibles pour résoudre ces problèmes. Dans cette étude, nous présentons une plateforme multidisciplinaire pour l’évaluation de biomatériaux pour la réparation osseuse. Nous avons combiné expertise biologie osseuse et d’immunologie de développer une plate-forme y compris in vitro ostéoclastes (OC) et dosages des ostéoblastes (OB) et in vivo de modèles murins de la réparation osseuse, immunogénicité et d’allergénicité. Nous montrent comment réaliser les expériences, résument les résultats et rapport sur la biocompatibilité de biomatériau. En particulier, nous avons testé la viabilité de l’OB, la différenciation et minéralisation et viabilité OC et différenciation dans le contexte des disques de β-tricalcium phosphate (β-TCP). Nous avons aussi testé une mousse (β-TCP/C) de β-TCP/collagène qui est un matériau disponible dans le commerce, utilisé en clinique pour la réparation osseuse dans un modèle murin de taille critique de substance osseuse défaut pour déterminer les effets sur la première phase de cicatrisation osseuse. Dans des expériences parallèles, nous avons évalué les réponses immunitaires et allergiques chez les souris. Notre approche génère un profil de compatibilité biologique d’un biomatériau osseux avec une gamme de paramètres nécessaires pour prédire la biocompatibilité des biomatériaux utilisés pour la guérison osseuse et la réparation chez les patients.
Introduction
La réparation osseuse est un processus complexe qui commence par la formation d’un hématome, une inflammation, Cal formation et remodelage puis1,2. Toutefois, le potentiel de régénération osseuse est limité à la taille de l’OS fracture1,3. Par exemple, les fractures des os grand causées par un traumatisme, le cancer ou l’ostéoporose ne peuvent pas guérir et sont appelées fractures osseuses non syndiqués. Ces lésions osseuses nécessitent souvent des traitements pour promouvoir la régénération et la réparation osseuse physiologique sain. Actuellement, au....
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Protocole
Les procédures ont été effectuées avec des souris BALB/c après toutes les directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Ministère autrichien de l’Education, Science and Research et ont été approuvés par le Comité sur l’éthique du Ministère autrichien de l’Education, Science et de la recherche.
1. primaire souris OB Culture
- Isolement d’OB de calotte cranienne de souris néonatales par digestion enzymatique
- Euthanasier les chiots nouveau-nés vieux de 1 à 2 jour (60 au total) par décapitation et placez les têtes dans une boîte de Pétri stérile 1 x solution saline tamponnée au phospha....
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Résultats
Pour évaluer le β-TCP pour son efficacité comme un biomatériau pour la réparation osseuse, nous avons utilisé in vitro et in vivo méthodes de dépistage. Tout d’abord, nous avons mesuré les réponses OB sur les disques de β-TCP comparées aux témoins seul moyen de base. La figure 2 montre la viabilité de l’OB en réponse à des disques de β-TCP à 7 et 14 jours de culture. La viabilité cellulaire mesurée à partir des cellules métaboliquement activ.......
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Discussion
Ici, nous montrons une approche multidisciplinaire pour l’évaluation préclinique de la biocompatibilité des biomatériaux représentatif mis au point pour la réparation et la régénération osseuse. Nous avons testé les réponses de l’OBs, OCs, et la réponse de guérison in vivo dans un défaut critique OS modèle de souris ainsi que in vitro et in vivo des réponses immunitaires. L’étude visait à démontrer comment les tests fonctionnent et résument les données et les conclusions tirées de l’examen des .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce projet de recherche a reçu financement du septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) de l’Union européenne au titre de la subvention contrat no 263363.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| <> | |||
| (&beta ;-TCP, 14 mm) | Les disques ont été frittés dans un four à moufle à une température de 1150 °C. Une description détaillée de la production se trouve dans Zimmer et al (doi : 10.1002/jbm.a.34639). Les échantillons ont été irradiés aux UV (15 min pour chaque côté) avant d’être utilisés dans des cultures cellulaires. | ||
| Mousse Orthovita Vitoss (&beta ;-Mousse TCP/C) | Orthovita | 2102-1405 | |
| Culture d’ostéoblastes de souris | |||
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Tampon de dosage ALP (2x) pH 10,4 | Dissoudre 200 mM de glycine, 2 mM de chlorure de magnésium, 2 mM de chlorure de zinc dans de l’eau ultrapure et ajuster à pH 10. | ||
| Milieu de croissance osseuse (BGM) | &alpha ;-MEM + 10 % FBS inactivé thermiquement + 1 % de pénicilline/streptomycine | ||
| Tampon de lyse cellulaire : Tampon de lyse cellulaire CyQuant 20x concentré | Thermo Scientific | C7027 | Diluez 20 fois le stock de tampon de lyse cellulaire concentré dans de l’eau ultrapure. ; |
| Réactif de viabilité cellulaire : Presto Blue réactif de viabilité cellulaire | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A13261 | |
| Collagénase de type IV de clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DC kit de dosage des protéines II | Bio Rad | 5000112 | Le kit de dosage des protéines DC contient le réactif A, le réactif B, le réactif S et le BSA pour l’étalon de référence. Pour le réactif A', ajouter 20 µ ; L réactif S à 1000 µ ; L réactif A. ; |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Filtre stérile DMSO avant utilisation. ; |
| Dispase II (protéase neutre, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| EnzCheck Phosphatase Kit de dosage pour l’activité de la phosphatase alcaline ; | Invitrogen, le | kit de dosage de phosphatase E12020 EnzCheck de Thermo Fisher Scientific contient du phosphate de 6,8-difluoro-4-méthylumbellifère (DiFMUP), du N,N-diméthylformamide et de la 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-méthylcoumarine (DiFMU). ; | |
| Sérum fœtal de bovin (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Solution de formol neutre tamponnée 10 % | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Chlorure d’hexadécylpyrdinium (cétylpyridinium) monohydraté | Sigma-Aldrich | C9002 | |
| Acide L-ascorbique 2-phosphate sesquihydrate | de magnésiumSigma-Aldrich | A8960 | |
| Chlorure de magnésium hexahydraté | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MEM alpha medium (&alpha ;-MEM) | Gibco Life Technologies ; | 11900-073 | |
| Milieu de minéralisation ostéogénique (MM) | &alpha ;-MEM + 10 % FBS inactivé par la chaleur + 1 % pénicilline-streptomycine + 50 µ ; g/mL d’acide ascorbique + 5 mM de &bêta ;-glycérophosphate | ||
| Pénicilline-streptomycine ; ; | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | ||
| Sigmafast BCIP/NBT | Sigma-Aldrich | B5655 | |
| Trypsine-EDTA (0,5 %), sans rouge de phénol (10x) | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | 15400054 | Diluer la solution mère concentrée 10 fois dans 1 PBS. |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Eau ultra-pure : Eau de culture cellulaire sans pyrogène | VWR | L0970-500 | |
| Tampon | Ajouter 0,05 % Tween20 à 1x PBS. | ||
| Chlorure | de zinc Sigma-Aldrich | 1.08816 | |
| &beta ;-Glycérophosphate disodium sel hydraté | Sigma-Aldrich | G5422 | |
| Plaque de culture en suspension 24 puits | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24 puits Plaque de culture tissulaire | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 mL Tube conique | Greiner bio-one | 227261 | |
| Plaque noire 96 puits | Greiner bio-one | 655076 | |
| Plaque transparente 96 puits | Greiner bio-one | 655001 | |
| Centrifugeuse : VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Incubateur à CO2 : HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Cryovial 2 mL | Greiner bio-one | 122263 | |
| Unité de filtration jetable FP30/0.2 CA-S | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 10462200 | Pour la filtration stérile d’une solution enzymatique. |
| Scanner à plat : Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
| Infinite M200 Pro Lecteur de microplaques | Tecan | ||
| Tube à microcentrifuger : Tube Eppendorf safe-lock 0,5 mL | VWR | 20901-505 | |
| Tube à microcentrifuger : Eppendorf tube safe-lock 1,5 mL | VWR | 21008-959 | |
| Shaker Swip (orbital et horizontal) ; | Edmund Buehler ; | ||
| Incubateur à secousses GFL3032 | GFL ; | 3032 | |
| Pipette à usage unique : pipette à sérum | Greiner bio-one | 612301 | |
| Instruments stériles (ciseaux, pince à épiler, pince courbe) | |||
| Plaque de culture tissulaire (10 cm) | Greiner bio-one | 664960 | |
| Co-culture ostéoblaste-ostéoclaste de souris | |||
| 1&alpha ;,25- Dihydroxyvitamine D3 | Sigma-Aldrich | 17936 | 1000x stock concentré (10 µ ; M dans l’éthanol 100 %) |
| Acétone | VWR Chemicals | 22065.327 | |
| Milieu de croissance osseuse (BGM) | &alpha ;-MEM + 10 % FBS inactivé par la chaleur + 1 % pénicilline-streptomycine | ||
| Eau distillée | Carl Roth | 3478.4 | |
| Éthanol (100 % vol/vol) | VWR Chemicals | 20821.365 | |
| Éthanol (70 % vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Sel LB violet rouge rapide | Sigma-Aldrich | F3381 | |
| Sérum fœtal de veau (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Solution de formol neutre tamponnée 10 % | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| MEM alpha Medium (&alpha ;-MEM) | Gibco Life Technologies ; | 11900-073 | |
| N,N-diméthylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Naphtol AS-MX phosphate | Sigma-Aldrich | N4875 | |
| Milieu de différenciation des ostéoclastes (DM) | &alpha ;-MEM + 10 % FBS inactivé par la chaleur + 1 % pénicilline-streptomycine + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamine D3 + 1 µ ; M prostaglandine E2 ; | ||
| Pénicilline-streptomycine ; | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | ||
| Prostaglandine E2 (PGE2) | Cayman Chemical Company | 9003016 | 1000x stock concentré (1 mM dans de l’éthanol 100 %) |
| Acétate de sodium trihydraté | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Tartrate de sodium dibasique dihydraté | Sigma-Aldrich | S8640 | |
| Instruments stériles (ciseaux, pinces, scalpel) | |||
| TRAP tampon pH 5,0 | Dissoudre 40 mM d’acétate de sodium, 10 mM de tartrate de sodium dans de l’eau ultrapure et ajuster à pH 5. | ||
| Eau ultrapure : Eau de culture cellulaire sans pyrogène | VWR | L0970-500 | |
| Plaque de culture en suspension à 24 puits | Greiner bio-one | 662102 | |
| Plaque de culture tissulaire à 24 puits | Greiner bio-one | 662160 | |
| Tube conique de 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| Centrifugeuse : VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Incubateur CO2 : HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Diamond Lame de plaquette (10,2 cm x 0,3 cm) | Buehler | ||
| Isomet | Buehler | ||
| (6 cm) | Greiner bio-one | 628,161 | |
| Flacon en verre à bouchon à vis 20 mL | Carl Roth | EXY4.1 | |
| Seringue stérile à usage unique 1 mL | Henry Schein Santé Animale | 9003016 | |
| Pipette à usage unique : Pipette sérique | Greiner bio-one | 612301 | |
| Aiguille stérile : Aiguille hypodermique RW 27 G x 3/4''Henry | Schein Santé Animale | 9003340 | |
| Modèle de défaut calvaire de souris | |||
| Analgésie : Buprénorphine (Bupaq) | Richter Pharma AG | ||
| Anesthésie : Kétamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Stérilisant contre le rhume : SafeSept Max | Henry Schein Santé animale | 9882765 | |
| Éthanol (70 % vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Pommade oculaire : VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Solution saline normale (solution de chlorure de sodium à 0,9 %) | Fresenius Kabi | ||
| Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | ||
| Solution de povidone iodée : Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4,5 % de formol tamponné | Carl Roth | 2213.6 | |
| Adhésif tissulaire : Histoacryl 5 x 0,5 mL | B. Braun | Surgical 1050060 | |
| Équipement de protection individuelle : gants chirurgicaux, casquette et masque, blouse | Henry Schein | Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Instruments stériles (scalpel, ciseaux, pinces, | |||
| )Aiguilles stériles : Aiguilles hypodermiques RW 27 G x 3/4'' et 30 G x 1/2'' ; | Henry Schein Santé Animale | 9003340, 9003630 | |
| Seringue stérile à usage unique 1 mL | Henry Schein Santé Animale | 9003016 | |
| Plaque chauffante : Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Tampons de gaze stériles | Henry Schein Santé Animale | 220192 | |
| Scalpel stérile jetable (Figur 20) | Henry Schein Santé Animale | 9008957 | |
| Foret chirurgical/dentaire : Implantmed SI-923 | W& H Dentalwerk Bü ; rmoos GmbH | 16929000 | |
| Pièce à main type S-II | W& H Dentalwerk Bü ; rmoos GmbH | 30056000 | |
| Tréphine, diamètre 4 mm | Hager& Meisinger GmbH | 229040 | |
| Kit de tuyaux d’irrigation 2,2 m | W& H Dentalwerk Bü ; rmoos GmbH | 4363600 | |
| Élévateur périosté 2 mm / 3 mm | Henry Schein Santé animale | 472683 | |
| Suture non résorbable : Vert polyester, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm | Henry Schein Santé animale | 300715 | |
| In vitro réponses immunitaires | |||
| Anesthésie pour l’euthanasie : Kétamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Prolifération cellulaire ELISA, BrdU (colorimétrique) Kit de dosage | Sigma-Aldrich | 11647229001 | Le kit contient une solution de marquage BrdU, une solution de fixation (FixDenat), une solution d’anticorps anti-BrdU, un tampon de lavage et une solution de substrat |
| Concanavalin A (ConA) | MP Biomedicals | 150710 | |
| Milieu de culture splénocytes | Milieu RPMI + 10 % FBS inactivé par la chaleur + 1 % de solution de pénicilline-streptomycine + 0,1 % de gentamicine + 0,2 % de ß ;-mercaptoéthanol + 1 % d’acides aminés non essentiels | ||
| Éthanol (70 % vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp ; | ||
| Gentamicin | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | ||
| souris IL-1&beta ; ELISA Ready-SET-Go ! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Souris IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| souris IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| souris INF-&gamma ; ELISA MAX Standard | BioLegend | 430801 | |
| Solution d’acides aminés non essentiels | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | ||
| Pénicilline-streptomycine ; | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | ||
| Saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | ||
| Tampon de lyse des globules rouges (GR) : BD Pharm Lyse | BD Bioscience | 555899 | |
| milieu RPMI 1640, HEPES | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | 52400025 | |
| &beta ;-Mercaptoethanol | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | ||
| tube conique de 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| plaque de culture tissulaire à 96 puits | Greiner bio-one | 655180 | |
| Centrifugeuse : VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Cell strainer 40 µ ; m | BD Bioscience | 352340 | |
| Lecteur de microplaques Infinite M200 Pro | Tecan | ||
| Seringue stérile à usage unique 1 mL | Henry Schein Santé animale | 9003016 | |
| Instruments chirurgicaux stériles (pinces, lames de verre) | |||
| Modèle intrapéritonéal à haut débit | |||
| Anesthésie : Kétamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Stérilisant contre le rhume : SafeSept Max | Henry Schein Santé animale | 9882765 | |
| Éthanol (70 % vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Pommade oculaire : VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Mouse IL-1&beta ; ELISA Ready-SET-Go ! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Souris IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| souris IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | ||
| Povidone iodée solution : Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit | Thermo Scientific | 9990700 | Pour la numération cellulaire différentielle. |
| Plaque chauffante : Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Hémocytomètre : Chambre Neubauer | Carl Roth | PC72.1 | |
| Suture non résorbable : Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Suture résorbable : Polysorb | Covidien | SL-5628 | |
| Centrifugeuse Shandon pour cytopsine | Thermo Scientific | ||
| Seringue stérile à usage unique 1 mL | Henry Schein Santé animale | 9003016 | |
| Tampons de gaze stériles | Henry Schein Santé animale | 220192 | |
| Aiguilles stériles : Aiguilles hypodermiques RW 27 G x 3/4'' et 25 G | Henry Schein Santé animale | 9003340, 420939 | |
| Instruments chirurgicaux stériles (scalpel, ciseaux, pinces, porte-aiguilles) | |||
| Trypan blue solution 0,4 % | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | 15250061 | |
| Modèle sous-cutané subchronique | |||
| Anesthésie : Kétamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Stérilisant contre le rhume : SafeSept Max Henry | Schein Santé animale | 9882765 | |
| Éthanol (70 % vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Pommade pour les yeux : VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific ; | ||
| Povidone iodée solution : Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4,5 % de formol tamponné | Carl Roth | 2213.6 | |
| Plaque chauffante : Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Suture non résorbable : Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Équipement de protection individuelle : chirurgical gants, casquette et masque, blouse | Henry Schein | Santé animale 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Seringue stérile à usage unique 1 mL | Henry Schein Santé animale | 9003016 | |
| Tampons de gaze stériles | Henry Schein Santé animale | 220192 | |
| Instruments stériles (scalpel, ciseaux, pinces, porte-aiguilles) | |||
| Aiguille stérile : Aiguilles hypodermiques RW 27 G x 3/4'' ; | Henry Schein 9003340 de santé animale | , 420939 |
Références
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
- Cooper, G. M., et al.
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Réimpressions et autorisations
