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Article de méthode

Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse

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DOI :

10.3791/58077

⸱

16 novembre 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Dans cet article

Résumé

Le nombre de nouveaux biomatériaux conçus pour réparer les lésions osseuses importantes est en expansion continue dans le but d’améliorer la guérison osseuse et surmonter les complications associées à la transplantation osseuse. Nous présentons ici une stratégie multidisciplinaire pour les tests de biocompatibilité préclinique de biomatériaux pour la réparation osseuse.

Résumé

Fractures osseuses importantes de non syndiqués sont un défi en chirurgie orthopédique. Bien qu’auto - et greffe osseuse allogénique est excellente pour la guérison des lésions, il y a des complications potentielles à leur utilisation. Ainsi, matériels scientifiques mettent au point des biomatériaux synthétiques, biocompatibles pour résoudre ces problèmes. Dans cette étude, nous présentons une plateforme multidisciplinaire pour l’évaluation de biomatériaux pour la réparation osseuse. Nous avons combiné expertise biologie osseuse et d’immunologie de développer une plate-forme y compris in vitro ostéoclastes (OC) et dosages des ostéoblastes (OB) et in vivo de modèles murins de la réparation osseuse, immunogénicité et d’allergénicité. Nous montrent comment réaliser les expériences, résument les résultats et rapport sur la biocompatibilité de biomatériau. En particulier, nous avons testé la viabilité de l’OB, la différenciation et minéralisation et viabilité OC et différenciation dans le contexte des disques de β-tricalcium phosphate (β-TCP). Nous avons aussi testé une mousse (β-TCP/C) de β-TCP/collagène qui est un matériau disponible dans le commerce, utilisé en clinique pour la réparation osseuse dans un modèle murin de taille critique de substance osseuse défaut pour déterminer les effets sur la première phase de cicatrisation osseuse. Dans des expériences parallèles, nous avons évalué les réponses immunitaires et allergiques chez les souris. Notre approche génère un profil de compatibilité biologique d’un biomatériau osseux avec une gamme de paramètres nécessaires pour prédire la biocompatibilité des biomatériaux utilisés pour la guérison osseuse et la réparation chez les patients.

Introduction

La réparation osseuse est un processus complexe qui commence par la formation d’un hématome, une inflammation, Cal formation et remodelage puis1,2. Toutefois, le potentiel de régénération osseuse est limité à la taille de l’OS fracture1,3. Par exemple, les fractures des os grand causées par un traumatisme, le cancer ou l’ostéoporose ne peuvent pas guérir et sont appelées fractures osseuses non syndiqués. Ces lésions osseuses nécessitent souvent des traitements pour promouvoir la régénération et la réparation osseuse physiologique sain. Actuellement, autogreffe et allogreffe osseuse transplantation est l’approche de choix4 avec les procédures de remplacement des OS 2,2 millions par an5. Bien que ces procédures ont un taux de réussite élevé, il peut y avoir des complications, par exemple, la disponibilité limitée des os, infection, morbidité du site donneur et rejet4. De nouvelles alternatives pour l’ingénierie tissulaire osseuse sont recherchés pour relever ces défis.

La conception des biomatériaux à base de polymères naturels ou synthétiques, des biocéramiques ou des métaux en combinaison avec les cellules et molécules bioactives est sur l' élévation6. Notre compréhension actuelle des os physiologiques de guérison et de guérison dans le contexte des biomatériaux dépend de divers facteurs tels que les propriétés mécaniques et de multiples facteurs les et systémiques, y compris les cellules de la circulation et le site de fracture7 ,8,9. Biomatériaux pour la régénération osseuse vise à promouvoir les osteogenicity et ostéointégration10 et est idéalement biocompatible et biodégradable poreux (promotion de nutriments, l’oxygène et la migration cellulaire). Ils doivent également être suffisamment solide pour supporter le site fracture pour soulager la douleur. En outre, des facteurs inflammatoires sont tenus d’engager le processus de guérison. Toutefois, si le biomatériau induit une inflammation excessive et réactions allergiques, cela pourrait limiter ou inhiber l’OS guérison11,12. Ainsi, une approche interdisciplinaire est nécessaire pour évaluer les biomatériaux destinés à la réparation osseuse.

Dans cette étude, nous présentons une évaluation préclinique de matières représentatives, 1) Orthovita Vitoss mousse qui est un substitut de greffe disponible dans le commerce d’os spongieux consistant en phosphate tricalcique composée de taille nanométrique pur β tricalcique les particules de phosphate (β-TCP) et collagène bovin de Type 1 (C) (β-TCP/C mousse) et 2) des disques de β-TCP. Ici, nous illustrons test de biocompatibilité de ces biomatériaux à l’aide des ostéoblastes primaires (OB) et dosages des ostéoclastes (OC), un modèle in vivo de la réparation osseuse, une évaluation immunologique comprenant in vitro la prolifération des lymphocytes T et la production de cytokines et in vivo de l’immunogénicité et l’allergénicité, comme indiqué précédemment13.

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Protocole

Les procédures ont été effectuées avec des souris BALB/c après toutes les directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Ministère autrichien de l’Education, Science and Research et ont été approuvés par le Comité sur l’éthique du Ministère autrichien de l’Education, Science et de la recherche.

1. primaire souris OB Culture

  1. Isolement d’OB de calotte cranienne de souris néonatales par digestion enzymatique
    1. Euthanasier les chiots nouveau-nés vieux de 1 à 2 jour (60 au total) par décapitation et placez les têtes dans une boîte de Pétri stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    2. Maintenez la tête par la nuque et couper la peau suite à l’aide de ciseaux stériles. Inciser la voûte crânienne en perçant il (environ 0,1 à 0,3 mm) avec une paire de ciseaux qui est ensuite insérés sous la voûte crânienne à l’arrière de la tête à la base du crâne et couper le long du bord substance latéralement de l’arrière vers l’avant au-dessus des oreilles et puis abov e l’arête nasale (Figure 1).
    3. Incuber calvaria disséqué avec 8 mL de solution de digestion filtre stérilisé (300 unités/mL collagénase type IV et 2,14 a unités/mL II dissous dans un milieu essentiel minimum α (α-MEM)) dans un tube conique de 50 mL à 37 ° C pendant 10 min dans un incubateur à agitation à 200 shakes / min.
    4. Jeter le surnageant première et répéter le processus de digestion trois fois avec 8 mL de solution de digestion. Récupérer le surnageant contenant les cellules après chaque étape de la digestion et l’ajouter à un tube conique de 50 mL. Ranger le tube conique de 50 mL avec les cellules dans un bain d’eau glacée avant d’avoir terminé la procédure de la digestion (environ 40 min).
    5. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant (avec une pipette Pasteur attachée à une pompe à vide) et resuspendre dans 40 mL de milieu de croissance osseuse (BGM) contenant des α-MEM avec 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) et 1 % solution de pénicilline-streptomycine. Ajouter ensuite 10 mL de la suspension cellulaire aux 4 plaques de culture de tissus (10 cm).
    6. Culture des cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 jusqu’au confluent (2 – 3 jours).
    7. Au confluent, aspirer le milieu vieux et laver les plaques de culture de tissu une fois avec du PBS 1 x (37 ° C). Puis aspirer le PBS et ajouter 2 mL de solution de trypsine 1 x contenant 0,5 % d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour chaque plaque de culture de tissu de 10 cm.
    8. Incuber les boîtes de 4 culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 5 min, puis vérifiez les plaques avec un microscope inversé léger pour s’assurer que les cellules sont détachent de la matière plastique. Puis transférez toutes les suspensions cellulaires (total 8 mL) dans un tube conique de 50 mL contenant 10 mL de BGM fraîche. Lavez chaque plaque avec 5 mL de frais BGM et transfert vers le même tube conique de 50 mL.
    9. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules de 16 mL de BGM fraîche. Préparer 16 nouvelles 10 cm tissue culture plaques (Division 1:4) contenant 9 mL de BGM. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque assiette.
    10. Répétez les étapes 1.1.6. à 1.1.8.
    11. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 mL de BGM fraîche. Compter les cellules et calculer la concentration en cellules.
      Remarque : Cette procédure génère environ 7,5 – 8,3 x 105 cellules/chiot.
    12. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans de la moyen 10 % contenant du diméthyl sulfoxyde (DMSO), α-MEM de 40 % et 50 % FBS. Transfert en 1,5 mL de la suspension cellulaire à 2 mL cryovials pour un total de 2 x 106 cellules par flacon.
    13. Flash gel les flacons dans l’azote liquide pour le stockage à long terme dans un réservoir d’azote liquide. Utiliser les cellules dans l’année afin d’assurer la pleine fonctionnalité. Utilisent ces OBs primaires pour évaluer la prolifération (étape 1.2), la différenciation (dosages ALP : étape 1.4., 1.5.) et la minéralisation (étape 1.6.) en présence des biomatériaux. Utiliser ces cellules pour la maturation des précurseurs d’OC OS-moelle osseuse en co-culture (étape 2.3).
  2. Essai de prolifération OB
    1. Incuber les disques de β-TCP de diamètre de 14 mm dans 1 mL de BGM dans une plaque 24 puits suspension de culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h avant d’ajouter les plaques de vitroplants standard OBs. utilisation primaires pour les contrôles et les plaques de culture de suspension pour les exemples de biomatériau pour éviter la fixation des cellules de la matière plastique.
    2. Aspirer le milieu d’incubation avant et puis remettre en suspension les OBs de souris primaire de BGM. Ajouter 4,4 x 104 OBs/cm2 sur les disques pré-incubées β-TCP dans une plaque de culture 24 puits suspension et pour le groupe témoin, dans une plaque de culture de tissus de 24 puits (1 mL/puits). OBs seront attachera à la plaque de culture tissulaire ou ce biomatériau.
    3. Incuber pendant 14 jours à 37 ° C et 5 % de CO2. Au cours de la période d’incubation, changer le milieu tous les 2-3 jours et ajouter 1 mL de BGM frais dans chaque puits.
    4. Pour évaluer la prolifération de l’OB, transférer les disques de β-TCP 7 et 14 jours à nouveaux puits d’exclure les signaux provenant des cellules cultivées sur la plaque de culture de suspension.
    5. Aspirer le milieu ancien, ajouter 0,5 mL de BGM (37 ° C) et incuber les boîtes de culture pendant 30 min à 37 ° C et 5 % de CO2. Puis ajoutez 55 µL de 10 x réactif de prolifération cellulaire (01:10 dilution) directement dans le puits de la culture. Pour les flans, préparer trois puits contenant 0,5 mL de BGM et 55 µL de la prolifération des hématies 10 x. Incuber les boites pendant 30 min à 37 ° C et 5 % de CO2.
    6. Retirer et de transférer 150 µL de surnageant de chaque puit dans une plaque 96 puits noire et de lire la fluorescence avec excitation à 560 nm et d’émission à 590 nm. Soustraire les lectures vierges d’après les relevés de l’échantillon.
  3. Tests de différenciation et de la minéralisation OB
    1. Incuber les disques de β-TCP de diamètre de 14 mm dans 1 mL de BGM dans une plaque 24 puits suspension de culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h avant d’ajouter les plaques de culture de tissus standard OBs. utilisation des contrôles et des plaques de culture de suspension pour les échantillons de biomatériau éviter fixation des cellules de la matière plastique.
    2. Aspirer le milieu d’incubation avant et puis remettre en suspension les OBs de souris primaire de BGM. Ajouter 8,8 x 104 OBs/cm2 sur les disques pré-incubées β-TCP dans une plaque de culture 24 puits suspension et pour le groupe témoin, dans une plaque de culture de tissus de 24 puits (1 mL/puits). OBs seront attachera à la plaque de culture de tissus ou de l’échantillon de biomatériau.
    3. Remplacez le BGM par 1 mL de milieu de minéralisation ostéogénique (MM) contenant des BGM, 50 µg/mL d’acide ascorbique et 5 mM β-glycérophosphate 24h après l’ajout de l’OBs et incuber pendant 14 jours à 37 ° C et 5 % de CO2. Changer le milieu tous les 2 – 3 jours avec 1 mL de MM fraîchement préparée dans chaque puits.
  4. Différenciation d’OB évaluée par l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) de lysats cellulaires
    1. Pour mesurer l’activité de l’ALP le 7e jour après l’addition de MM, aspirer le milieu de culture des puits et laver ensuite avec 1 mL de PBS stérile 1 x (37 ° C). Aspirez soigneusement le PBS pour permettre les cellules attachées à rester sur le plastique de culture de tissus ou de biomatériau et figer les plaques à-80 ° C.
    2. Après 24 h (ou jusqu'à 2 semaines), décongeler le contrôle vitroplants plaque et la plaque de culture de suspension de biomatériau à température ambiante (RT) de préparer pour la lyse OB. Pour les échantillons de biomatériau, transférer les disques de β-TCP dans une plaque de culture nouvelle suspension pour exclure les cellules fixés à la plaque. Ajouter 75 µL / puits de la 1 x tampon de lyse cellulaire pour les deux plaques. Agiter les plaques pendant 5 min sur un agitateur à 400 secousses/min.
    3. Transvaser le lysat cellulaire dans un tube à microcentrifugation 0,5 mL et centrifuger à 300 x g pendant 6 min à ta pour enlever les débris. Ajouter 50 µL de surnageant lysat cellulaire échantillon sur une plaque de 96 puits noire et puis ajouter 50 µL d’une solution composée de 200 µM 6,8-difluoro-4-méthylumbelliféryl phosphate (DiFMUP) un substrat fluorogène dissous dans 2 x ALP solution tampon (pH 10 / puits). Mis en place deux puits vides avec 100 µL d’une solution de 1:1, contenant 1 x buffer de lyse cellulaire et 2 x ALP.
    4. Préparer 8 étalons de référence avec 100 μL/puits avec le 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) variant de 0,5 à 200 μM dissous dans une solution contenant 1 x cellule lysis buffer et 2 x ALP pour générer une courbe de référence standard 1:1.
    5. Incuber les plaques noires à 37 ° C pendant 15 min et puis lire la fluorescence avec l’excitation à 358 nm et d’émission à 455 nm. Soustraire les lectures vides des étalons de référence et des lectures des échantillons.
    6. Normaliser l’activité enzymatique ALP des lysats cellulaires à la quantité totale de protéine à un dosage colorimétrique pour la concentration en protéine. Préparer l’albumine sérique bovine étalons de référence de protéine (BSA) à une plage allant de 0,05 à 2,5 µg/µL dissous dans 1 x tampon de lyse cellulaire pour générer la courbe d’étalonnage.
    7. Préparer les lysats cellulaires échantillon et normes protéique BSA en doublons. Ajouter 5 µL de la cellule lysate ou 5 µL de protéine BSA standard dans une plaque à 96 puits, puis ajouter 25 µL de réactif A' et 200 µL de réactif B. Set up deux puits vides 5 µl de 1 x tampon de lyse cellulaire. Incuber les plaques à RT pendant 15 min et puis lire l’absorbance à 690 nm. Soustraire les lectures vides des étalons de référence et des lectures des échantillons.
  5. Différenciation d’OB évaluée par coloration ALP en culture cellulaire
    1. Tacher ALP en OBs cultivées sur jour 7 après l’addition de MM sur une plaque de culture de tissus de contrôle et le biomatériau dans une plaque de culture de suspension.
    2. Aspirer le milieu de culture des puits et remplacez-le avec 0,5 mL de PBS 1 x (37 ° C). Aspirer le PBS et fixer les cellules en les incubant dans 0,5 mL de formol 10 % tamponnée à ta pendant 1 min.
    3. Aspirer le formol 10 % tamponnée avec une pipette à usage unique et ajouter 0,5 mL de tampon de lavage (0,05 % Tween20 dans du PBS 1 x).
    4. Dissoudre un comprimé de substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitrobleu tétrazolium (BCIP/NBT) dans 10 mL d’eau ultrapure et vortex jusqu'à dissolution complète. La solution doit être protégée de la lumière et utilisée moins de 2 h.
    5. Aspirer le tampon de lavage et remplacez avec 0,5 mL de solution de substrat BCIP/NBT et incuber la plaque à la RT dans l’obscurité pendant 10 min. aspirer la solution colorante et par 0,5 mL de tampon de lavage.
    6. Transférer les disques colorés β-TCP dans un nouveau puits et numériser les plaques ALP tachée avec un scanner à plat conventionnel à la souillure d’ALP record.
  6. Minéralisation OB évaluée par coloration avec l’alizarine rouge S (ARS)
    1. Aspirer le milieu de culture par les puits contenant primaire OBs 14 jours après l’addition de MM et rincer deux fois avec 0,5 mL de PBS 1 x à RT. aspirer le PBS et fixer les cellules en ajoutant 0,5 mL de la 10 % tamponnée solution de formol à RT pendant 10 min.
    2. Aspirer le formol 10 % tamponnée avec une pipette à usage unique et laver deux fois avec 0,5 mL de l’eau ultrapure.
    3. L’OBs fixes, ajouter 0,25 mL de solution de coloration de ARS de 40 mM (pH 4,2) dissous dans l’eau ultrapure et incuber la plaque à RT pendant 10 min sur un agitateur à 100 secousses/min.
    4. Aspirer la solution colorante avec une pipette à usage unique et rincer avec 1 mL d’eau ultrapure. Répéter cette étape 5 à 10 fois pour supprimer non-spécifique de coloration.
      Remarque : La solution de lavage doit être sans couleur.
    5. Aspirer l’eau ultrapure et ajouter 1 mL de PBS froid. Incuber la plaque à RT pendant 10 min sur un agitateur à 100 secousses/min.
    6. Aspirer le PBS, transférer les disques colorés β-TCP dans un nouveau puits et analyser les plaques avec un scanner à plat à la minéralisation record.
    7. Ajouter 0,25 mL de solution de chlorure de cétylpyridinium 10 % et incuber la plaque à RT pendant 15 minutes sur un agitateur à 100 secousses/min pour extraire le colorant à ARS.
    8. Transférer les surnageants dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 17 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
    9. Ajouter la solution de chlorure de cétylpyridinium 10 % aux extraits avec un taux de dilution de 01:10:01 : 20 et ajouter les échantillons (300 µL) dans une plaque à 96 puits dont deux puits vides contenant du chlorure de cétylpyridinium 10 % seulement.
    10. Préparer des étalons de référence ARS 7 allant de 4 à 400 µM en diluant l’ARS 40 mM coloration solution (pH 4,2) avec la solution de chlorure de cétylpyridinium de 10 % pour générer la courbe d’étalonnage.
    11. Ajouter 300 µL de l’étalon de référence des doublons à la plaque à 96 puits.
    12. Lire l’absorbance des échantillons, flans et faire référence à des normes à 520 nm.
    13. Soustraire les lectures vides des étalons de référence et des lectures des échantillons.

2. souris OB-OC co-culture de dériver OCs Mature

  1. Préparation et stérilisation des tranches de l’os cortical bovine
    1. Segments d’os de tissu environnant de nettoyer et enlever l’OS trabéculaire et la moelle osseuse.
    2. Sécher l’os à 50 ° C pendant 24 h.
    3. Couper l’OS en plus petits morceaux et couper en tranches (environ 300 – 350 µm d’épaisseur) à l’aide d’une faible vitesse scie avec une lame de diamant.
    4. Couper les tranches de 300 – 350 µm en disques quadratiques (1 cm2).
    5. Pour nettoyer les disques d’OS (1 cm2), les mettre dans un flacon en verre fermant à clé et remplir avec de l’eau distillée. Transférer le flacon en verre rempli dans un bain à ultrasons et laisser agir pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.
    6. Videz l’eau distillée, ajouter de l’éthanol à 70 % et laisser agir pendant 5 min.
    7. Décanter l’éthanol à 70 % et les remplacer par l’éthanol à 100 %.
      NOTE : Stocker les tranches d’os dans l’éthanol à 100 % à 4 ° C pendant 4 semaines.
    8. Irradier les tranches de l’OS avec la lumière UV pour 15 min de chaque côté dans des conditions stériles. Conserver les tranches OS stérilisé dans une plaque de culture stériles à ta jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  2. Isolement des précurseurs de la moelle osseuse OC
    1. Euthanasier utilisant une injection intrapéritonéale (i.p.) d’une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg de souris BALB/c de 8 à 12 semaine vieux naïves.
    2. Isoler les précurseurs chimiques OC la moelle osseuse et souris fémur et le tibia.
    3. Retirez les jambes avec des ciseaux stériles du point plus proche à l’organe à l’articulation de la hanche, couper les branches au niveau des genoux et les chevilles et enlever les tissus mous avec bistouri stérile et forceps. Couper les épiphyses. Débusquer et suspendre la moelle avec 1mL de BGM dans un 6 cm boîte de Petri stérile en utilisant une aiguille de 27G, attachée à une seringue de 1mL pour obtenir une suspension de cellules.
    4. Ajouter la suspension de cellules dans un tube conique de 50 mL, laver les 6 cm boîte de Pétri avec 5 mL de BGM et transférer dans le même tube conique de 50 mL. Centrifuger à 350 x g à 4 ° C pendant 5 min. remettre en suspension les cellules dans un milieu de différenciation OC (DM) contenant BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-vitamine D3 et 1 µM prostaglandine E2 (1 mL/puits).
      Remarque : Une souris BALB/c fournit un nombre suffisant de précurseurs de l’OC pour une plaque de culture de 24 puits.
  3. Préparation de co-culture souris OB-OC avec le biomatériau
    1. Incuber les disques de β-TCP de diamètre 14 mm ou OS bovin tranches (1 cm2) dans 1 mL de BGM dans une plaque 24 puits suspension de culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h avant d’ajouter les cellules.
      NOTE : Tranches d’os bovin sont un groupe de contrôle de substrat physiologique pour l’étude de la différenciation OC en présence de biomatériaux.
    2. Ajouter 8,8 x 104 cellules/cm2 de l’OBs primaires suspendue de BGM sur les biomatériaux ou l’os de contrôle dans une plaque de culture de suspension 24 puits ou sur une plaque de culture de tissus de 24 puits. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
      NOTE : OBs fixer le plastique ou l’OS biomatériau ou bovin.
    3. Ajouter fraîchement isolées précurseurs OC la moelle osseuse pour les 24 h de culture primaire OBs et culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 5 jours. Remplacez le support par fraîchement préparée OC DM tous les deux jours. Puis, détachant OCs pour les phosphatases acides tartrate-résistantes (TRAP) pour évaluer la différenciation OC.
  4. Évalué par coloration au piège de la différenciation OC
    1. Afin de caractériser les matures OCs multinucléées, obtenu à l’étape 2.3.3, aspirer le milieu de culture de la plaque de culture de tissus de contrôle et de la plaque de culture de suspension biomatériau et ajouter 1 mL de PBS 1 x (37 ° C). Aspirer le PBS et fixer les cellules en incubant eux dans 1 mL de solution de formol 10 % mis en mémoire tamponné à la droite pendant 10 min.
    2. Aspirer la solution de formol 10 % tamponnée avec une pipette à usage unique et ajouter 1 mL de PBS 1 x à RT. répéter cette étape trois fois, puis aspirer le PBS, remplacez par 1 mL de tampon de piège (pH 5) et incuber les plaques à 37 ° C pendant 30 min.
    3. Aspirer le tampon de piège et ajouter 1 mL d’éthanol à l’acétone et 100 % 1:1. Incuber la plaque à RT 30 art. rapidement aspirer l’éthanol-acétone solution avec une pipette à usage unique et sécher complètement les plaques à température ambiante.
    4. Pour le piège solution de coloration, préparer un 10 mg/mL solution phosphate de naphtol-AS-MX en dissolution de N, N-diméthylformamide, 0,6 mg/mL de violet rapide rouge sel dans le tampon de piège et ajouter 0,1 mL de solution mère naphtol-AS-MX phosphate à 10 mL de sel violet rapide rouge dans le tampon de piège.
    5. Ajouter 1 mL de piège solution de coloration et incuber les plaques à 37 ° C pendant 10 min, puis aspirer le piège solution de coloration et ajouter 1 mL d’eau ultrapure pour arrêter la réaction.
    6. Transférer les disques de la β-TCP et les tranches de l’OS bovin après coloration dans un nouveau puits, observer rouge OCs teinté à l’aide d’un microscope optique (grossissement : 10 X) et énumérer les TRAP + OCs mature avec trois ou plusieurs noyaux.

3. critique taille souris défaut substance modèle

  1. Injecter la buprénorphine 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée (s.c.) à des souris BALB/c 8 - semaine vieux pour l’analgésie.
  2. Anesthésier les souris avec un mélange de 100 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 5 mg/kg, ajouter un gel ou une pommade pour les yeux de les garder humide et placez la souris sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant toute la procédure pour éviter l’hypothermie. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par pinch orteil et la queue.
  3. Raser la fourrure sur le dessus de la tête entre les oreilles et nettoyer la surface avec 7,5 % povidone iode solution et 70 % d’éthanol.
  4. Faire une incision sagittale médiane sur le dessus du crâne entre les oreilles avec un scalpel stérile pour exposer la voûte crânienne et de retirer les tissus conjonctifs pericranium au-dessus de l’os pariétal droit en grattant avec un scalpel.
  5. Créer un défaut de taille critique dans l’os pariétal droit à l’aide d’un trépan dentaire stérile avec un diamètre de 4 mm (2000 tr/min) sous irrigation constante avec une solution saline normale à encoche dans l’os pariétal droit et couper à travers l’ectocortex et quelques endocortex.
  6. Pour éviter d’endommager la dure-mère, utilisez un petit ascenseur périostique pour percer l’endocortex restant, soigneusement soulevez la substance osseuse et enlevez-le avec une pince. Le vice qui en résulte doit être circulaire et environ 3,5 mm de diamètre.
  7. Remplir le défaut substance préalablement trempées (PBS stérile 1 x à ta) β-TCP/C mousse à l’aide de pinces.
  8. Préparer le nombre approprié de sham, appariés selon l’âge des témoins négatifs avec un défaut vide.
  9. Pour garder ce biomatériau en place, mettre 0,5 µL d’adhésif de tissu au bord du défaut à deux points opposés.
  10. Fermer la peau avec une suture non résorbable.
  11. Nettoyer tous les instruments chirurgicaux avec froid stérilisant pour maintenir des conditions stériles avant d’effectuer l’opération suivante sur une souris anesthésiée.
  12. Pour le traitement post-opératoire, placer les animaux sur une plaque de chauffage propre et sec à 37 ° C dans le domaine de la chirurgie pour une surveillance appropriée au cours de la période de récupération. Surveiller la fréquence respiratoire, la température corporelle et la couleur des muqueuses et des yeux toutes les 10 min jusqu'à ce qu’ils se réveiller.
  13. Transférer les souris conscientes exploités dans une cage avec nourriture et d’eau séparés des autres animaux jusqu'à la guérison complète. Injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine s.c. pour traitement analgésique postopératoire deux fois par jour pendant 72 h. retour complètement rétablis souris à leur cage.
  14. Pour déterminer l’efficacité de ce biomatériau, euthanasier les i.p. de souris avec une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg.
  15. À post-implantatoire 8 à 12 semaines, décapiter la souris euthanasiée avec des ciseaux pointus.
  16. Fixer la tête décapitée de la souris dans 30 mL de 4,5 % tamponnée solution de formol pendant 1-2 semaines garantir la pleine pénétration du fixateur dans le tissu.
  17. Transférer les chefs dans l’éthanol à 70 % pour le stockage à long terme à 4 ° C pendant un an.
  18. Utilisation micro calculé tomographie (microCT) ou des techniques histologiques enrobement normalisées pour évaluer la régénération osseuse. Il est possible d’utiliser plus d’analyse sur des échantillons post mortem à haute résolution (90 kV, 4 min) en 2D et 3D sagittal et frontal avions.
  19. Pour histologie enrobement, déshydrater les têtes en croissant des grades d’éthanol et incorporer en glycol méthyl méthacrylate.
  20. Couper des blocs de méthacrylate de méthyle-encastrés de glycol avec une scie à diamant et broyer les sections d’une épaisseur d’environ 80 à 100 µm.
  21. Évaluer le goff Laczko OS coupes coloré afin d’identifier de nouveaux OS formation14.

4. in Vitro les réponses immunitaires

  1. Euthanasier i.p. de souris BALB/c 8 - semaine vieux de naïf avec une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg.
  2. Placez la souris sur son côté droit, se raser la fourrure sur le côté gauche et nettoyer la peau sur le côté gauche de l’abdomen avec l’éthanol à 70 %.
  3. Faire un 10 mm de long et une incision profonde de 1 mm dans la peau de la souris sur le côté gauche vers l’arrière suivant les côtes sur l’estomac à l’aide de ciseaux stériles.
  4. Ouvrir la peau et puis exposer le péritoine. Faire un 10 mm de longueur et moins de 1 mm de profondeur incision dans le péritoine, à l’aide de ciseaux dans des conditions stériles.
  5. Poussez l’estomac proximal pour exposer la rate.
  6. Tenez la rate doucement avec une pince stérile et retirez-le en coupant le tissu et les vaisseaux attachés en dessous.
  7. Placez la rate intacte dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de froid 1 x PBS stérile.
  8. Préparer une suspension monocellulaire de hacher la rate à l’aide d’une pince stérile 2 ou 2 lames de verre stérile.
  9. Enlevez les débris en le faisant passer à travers un tamis de cellule de 40 µm stérile avec du PBS 1 x contre le rhume en utilisant le piston d’une seringue de 1 mL.
  10. Centrifuger la suspension monocellulaire à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C dans un tube conique de 50 mL, aspirer et éliminer le surnageant. Puis Resuspendre le culot dans 5 mL de tampon de lyse des globules rouges (GR).
  11. Incuber la suspension cellulaire pendant 14 min à RT et arrêter la réaction en ajoutant 45 mL de milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
  12. Centrifuger les cellules après la lyse cellulaire à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C et ensuite jeter le surnageant.
  13. Splénocytes de remettre dans un milieu RPMI contenant 10 % inactivés par la chaleur FBS, solution de pénicilline-streptomycine 1 %, 0,1 % de gentamicine, 0,2 % de β-mercaptoéthanol et 1 % des acides aminés non essentiels.
  14. Les incuber β-TCP/C mousse dans une plaque de 96 puits stériles culture contenant du milieu RPMI pendant 24 h à 37 ° C et 5 % de CO2 avant l’ensemencement de la cellule.
  15. Ajouter des splénocytes à titré nombres, par exemple., 1,25 x 105, 2,5 x 105 et 5 x 105/well à Herbert George wells dans une plaque à 96 puits vitroplants contenant du milieu RPMI et additifs, avec ou sans la mousse de β-TCP/C pré-incubées.
  16. Ajouter 10 µg/mL la concanavaline A (Con A) dissous dans le milieu pour un total de 100 µL/puits dans les puits appropriés et puis incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 72 h.
  17. Mesurer la prolifération cellulaire avec un dosage bromodéoxyuridine (BrdU). Ajouter 10 µL/puits de la solution de marquage BrdU après 48 h de culture cellulaire et puis incuber la plaque pendant 24 h supplémentaires.
  18. Après 72 h, récupérer le surnageant et conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  19. Ajouter 200 µL/puits de la solution de fixation à chaque puits et puis incuber 30 min à RT. aspirer la solution de fixation. Ajouter 100 µL/puits de la solution d’anticorps anti-BrdU et incuber pendant 90 min.
  20. Aspirer la solution d’anticorps, rincez les puits trois fois avec 200 à 300 µL/puits de la solution de lavage et enlever la solution de lavage.
  21. Ajouter 100 µL de solution de substrat et incuber pendant 3 à 10 min à la droite, puis mesurer l’absorbance à 450 nm.
  22. Mesurer l’interleukin-1β (IL-1β), interleukine 2 (il-2), interleukine-4 (IL-4) et l’interféron-γ (IFN-γ) dans les surnageants recueillis à l’aide d’un technique ELISA.

5. haut débit modèle intrapéritonéale

  1. Offrir une 6-8 semaines vieilles souris femelles BALB/c avec un mélange de 100 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 5 mg/kg et ajouter un gel ou une pommade pour les yeux de les garder humide et placez la souris sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant toute la procédure pour éviter l’hypothermie. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par pinch orteil et la queue.
  2. Raser la fourrure abdominale et nettoyer avec 7,5 % povidone iode solution et 70 % d’éthanol.
  3. Faites une incision médiane longue de 8 mm à travers la peau le long de la linea alba. Faire une petite incision dans le péritoine, à l’aide d’un scalpel.
  4. Place PBS stérile imbibé de greffes de β-TCP/C mousse (2 x 2 x 2 mm3) dans la cavité péritonéale ou sans addition de matériaux pour les souris témoins appariés selon l’âge des trompe-l'œil.
  5. Suture du péritoine et la peau avec des sutures résorbables et non résorbables, respectivement.
  6. Nettoyer tous les instruments chirurgicaux avec froid stérilisant pour maintenir des conditions stériles avant d’effectuer l’opération suivante sur une souris anesthésiée.
  7. Pour le traitement post-opératoire, placer les animaux sur une plaque de chauffage propre et sec à 37 ° C dans le domaine de la chirurgie pour une surveillance appropriée au cours de la période de récupération. Surveiller la fréquence respiratoire, la température corporelle et la couleur des muqueuses et des yeux toutes les 10 min jusqu'à ce qu’ils se réveiller.
  8. Transférer les souris conscientes exploités dans une cage avec nourriture et d’eau séparés des autres animaux jusqu'à la guérison complète. Retour souris pleinement récupérés de leurs cages.
    Remarque : Cette procédure induit une douleur minime. Traitement analgésique postopératoire n’est habituellement pas nécessaire. Si la commande animaux montrent des signes de douleur, injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine s.c. ou un autre appropriée des médicaments analgésiques pour soulager la douleur.
  9. Euthanasier la souris 7 jours après l’implantation, avec une solution de 200 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 24 mg/kg
  10. À post-implantatoire 7 jours, lavage de la cavité péritonéale à l’aide de 1 mL d’une seringue avec une aiguille 25 G pour un total de 3 mL de PBS froid en maintenant la tête de la souris enfoncé et en insérant l’aiguille dans le quadrant abdominal inférieur gauche et viser dans la partie proximale.
    Remarque : Le liquide péritonéal devrait être libre de globules rouges.
  11. Centrifuger le liquide de lavage péritonéal à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C et recueillir le liquide péritonéal à conserver à-20 ° C pour les mesures de ELISA de cytokines IL-1β, il-2 et IL-4.
  12. Aspirer le surnageant, resuspendre le culot dans 1 mL de PBS et compter les cellules péritonéales utilisant le bleu trypan sur un hémocytomètre.
  13. Cytocentrifuge la suspension cellulaire à 5 x 105 cellules sur des lames de verre, laisser les lames à sec et des taches pour un nombre d’éléments différentiels.
  14. À l’aide d’un microscope optique, compter un minimum de 300 cellules au total et différencier les macrophages, les éosinophiles, neutrophiles et lymphocytes.

6. toxicité subchronique modèle sous-cutanée

  1. Anesthésier la souris BALB/c femelle 6 – 8 semaines vieux avec un mélange de 100 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 5 mg/kg, ajouter le gel ou pommade pour les yeux de les garder humide et placez la souris sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant toute la procédure pour éviter l’hypothermie. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par pinch orteil et la queue.
  2. Placez la souris sur le dos, se raser la fourrure abdominale et nettoyer la surface rasée avec 7,5 % povidone iode solution et 70 % d’éthanol.
  3. Faites une incision médiane longue de 8 mm à travers la peau le long de la linea alba de l’abdomen à l’aide d’un bistouri, puis implant PBS imbibés biomatériau (2 x 2 x 2 mm3) sous la peau ou n’ajouter aucuns matériel pour les souris témoins appariés selon l’âge des trompe-l'œil.
  4. Suture de la peau avec une suture non résorbable.
  5. Nettoyer tous les instruments chirurgicaux avec froid stérilisant pour maintenir des conditions stériles avant d’effectuer l’opération suivante sur une souris anesthésiée.
  6. Pour le traitement post-opératoire, placer les animaux sur une plaque de chauffage propre et sec à 37 ° C dans le domaine de la chirurgie pour une surveillance appropriée au cours de la période de récupération. Surveiller la fréquence respiratoire, la température corporelle et la couleur des muqueuses et des yeux toutes les 10 min jusqu'à ce qu’ils se réveiller.
  7. Transférer les souris conscientes exploités dans une cage avec nourriture et d’eau séparés des autres animaux jusqu'à la guérison complète. Retour souris pleinement récupérés de leurs cages.
    Remarque : Cette procédure induit une douleur minime. Traitement analgésique postopératoire n’est habituellement pas nécessaire. Si la commande animaux montrent des signes de douleur, injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine s.c. ou un autre analgésique approprié.
  8. Lorsqu’il est prêt à examiner le site d’implantation, euthanasier les i.p. de souris avec une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg.
  9. Après l’implantation huit semaines, le site d’implantation avec les tissus (1 cm2) environnants de l’accise.
  10. Difficulté le tissu dans une solution de formol 4,5 % mis en mémoire tamponné pendant la nuit, incorporer à la paraffine et coupé en 4 sections de µm.
  11. Tache 4 sections de tissus inclus en paraffine µm à l’hématoxyline et éosine (H & E) pour l’inflammation ou de Masson trichrome de la fibrose et le dépôt de collagène.

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Résultats

Pour évaluer le β-TCP pour son efficacité comme un biomatériau pour la réparation osseuse, nous avons utilisé in vitro et in vivo méthodes de dépistage. Tout d’abord, nous avons mesuré les réponses OB sur les disques de β-TCP comparées aux témoins seul moyen de base. La figure 2 montre la viabilité de l’OB en réponse à des disques de β-TCP à 7 et 14 jours de culture. La viabilité cellulaire mesurée à partir des cellules métaboliquement activ...

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Discussion

Ici, nous montrons une approche multidisciplinaire pour l’évaluation préclinique de la biocompatibilité des biomatériaux représentatif mis au point pour la réparation et la régénération osseuse. Nous avons testé les réponses de l’OBs, OCs, et la réponse de guérison in vivo dans un défaut critique OS modèle de souris ainsi que in vitro et in vivo des réponses immunitaires. L’étude visait à démontrer comment les tests fonctionnent et résument les données et les conclusions tirées de l’examen des ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce projet de recherche a reçu financement du septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) de l’Union européenne au titre de la subvention contrat no 263363.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
<>
(&beta ;-TCP, 14 mm)Les disques ont été frittés dans un four à moufle à une température de 1150 °C. Une description détaillée de la production se trouve dans Zimmer et al (doi : 10.1002/jbm.a.34639). Les échantillons ont été irradiés aux UV (15 min pour chaque côté) avant d’être utilisés dans des cultures cellulaires.
Mousse Orthovita Vitoss (&beta ;-Mousse TCP/C)Orthovita2102-1405
Culture d’ostéoblastes de souris
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
Tampon de dosage ALP (2x) pH 10,4Dissoudre 200 mM de glycine, 2 mM de chlorure de magnésium, 2 mM de chlorure de zinc dans de l’eau ultrapure et ajuster à pH 10.
Milieu de croissance osseuse (BGM)&alpha ;-MEM + 10 % FBS inactivé thermiquement + 1 % de pénicilline/streptomycine
Tampon de lyse cellulaire : Tampon de lyse cellulaire CyQuant 20x concentréThermo ScientificC7027Diluez 20 fois le stock de tampon de lyse cellulaire concentré dans de l’eau ultrapure.  ;
Réactif de viabilité cellulaire : Presto Blue réactif de viabilité cellulaireInvitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
Collagénase de type IV de clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138
DC kit de dosage des protéines IIBio Rad5000112Le kit de dosage des protéines DC contient le réactif A, le réactif B, le réactif S et le BSA pour l’étalon de référence. Pour le réactif A', ajouter 20 µ ; L réactif S à 1000 µ ; L réactif A.  ;
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD8418Filtre stérile DMSO avant utilisation.  ;
Dispase II (protéase neutre, grade II)Roche4942078001
EnzCheck Phosphatase Kit de dosage pour l’activité de la phosphatase alcaline  ;Invitrogen, lekit de dosage de phosphatase E12020 EnzCheck de Thermo Fisher Scientific contient du phosphate de 6,8-difluoro-4-méthylumbellifère (DiFMUP), du N,N-diméthylformamide et de la 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-méthylcoumarine (DiFMU).  ;
Sérum fœtal de bovin (FBS)Sigma-AldrichF7524
Solution de formol neutre tamponnée 10 %Sigma-AldrichHT501128
GlycineSigma-AldrichG8898
Chlorure d’hexadécylpyrdinium (cétylpyridinium) monohydratéSigma-AldrichC9002
Acide L-ascorbique 2-phosphate sesquihydratede magnésiumSigma-AldrichA8960
Chlorure de magnésium hexahydratéSigma-AldrichM2670
MEM alpha medium (&alpha ;-MEM)Gibco Life Technologies  ;11900-073
Milieu de minéralisation ostéogénique (MM)&alpha ;-MEM + 10 % FBS inactivé par la chaleur + 1 % pénicilline-streptomycine + 50 µ ; g/mL d’acide ascorbique + 5 mM de &bêta ;-glycérophosphate
Pénicilline-streptomycine  ;   ;Sigma-AldrichP4333
Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific  ;
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
Trypsine-EDTA (0,5 %), sans rouge de phénol (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific  ;15400054Diluer la solution mère concentrée 10 fois dans 1 PBS.
Tween20Sigma-AldrichP1379
Eau ultra-pure : Eau de culture cellulaire sans pyrogèneVWRL0970-500
TamponAjouter 0,05 % Tween20 à 1x PBS.
Chlorurede zinc Sigma-Aldrich1.08816
&beta ;-Glycérophosphate disodium sel hydratéSigma-AldrichG5422
Plaque de culture en suspension 24 puitsGreiner bio-one662102
24 puits Plaque de culture tissulaireGreiner bio-one662160
50 mL Tube coniqueGreiner bio-one227261
Plaque noire 96 puitsGreiner bio-one655076
Plaque transparente 96 puitsGreiner bio-one655001
Centrifugeuse : VWR Mega Star 600RVWR
Incubateur à CO2 : HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 mLGreiner bio-one122263
Unité de filtration jetable FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200Pour la filtration stérile d’une solution enzymatique.
Scanner à plat : Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro Lecteur de microplaquesTecan
Tube à microcentrifuger : Tube Eppendorf safe-lock 0,5 mLVWR20901-505
Tube à microcentrifuger : Eppendorf tube safe-lock 1,5 mLVWR21008-959
Shaker Swip (orbital et horizontal)  ;Edmund Buehler  ;
Incubateur à secousses GFL3032GFL  ;3032
Pipette à usage unique : pipette à sérumGreiner bio-one612301
Instruments stériles (ciseaux, pince à épiler, pince courbe)
Plaque de culture tissulaire (10 cm)Greiner bio-one664960
Co-culture ostéoblaste-ostéoclaste de souris
1&alpha ;,25- Dihydroxyvitamine D3Sigma-Aldrich179361000x stock concentré (10 µ ; M dans l’éthanol 100 %)
AcétoneVWR Chemicals22065.327
Milieu de croissance osseuse (BGM)&alpha ;-MEM + 10 % FBS inactivé par la chaleur + 1 % pénicilline-streptomycine
Eau distilléeCarl Roth3478.4
Éthanol (100 % vol/vol)VWR Chemicals20821.365
Éthanol (70 % vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Sel LB violet rouge rapideSigma-AldrichF3381
Sérum fœtal de veau (FBS)Sigma-AldrichF7524
Solution de formol neutre tamponnée 10 %Sigma-AldrichHT501128
MEM alpha Medium (&alpha ;-MEM)Gibco Life Technologies  ;11900-073
N,N-diméthylformamideSigma-AldrichD4551
Naphtol AS-MX phosphateSigma-AldrichN4875
Milieu de différenciation des ostéoclastes (DM)&alpha ;-MEM + 10 % FBS inactivé par la chaleur + 1 % pénicilline-streptomycine + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamine D3 + 1 µ ; M prostaglandine E2  ;
Pénicilline-streptomycine  ;Sigma-AldrichP4333
Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific  ;
Prostaglandine E2 (PGE2)Cayman Chemical Company90030161000x stock concentré (1 mM dans de l’éthanol 100 %)
Acétate de sodium trihydratéSigma-AldrichS7670
Tartrate de sodium dibasique dihydratéSigma-AldrichS8640
Instruments stériles (ciseaux, pinces, scalpel)
TRAP tampon pH 5,0Dissoudre 40 mM d’acétate de sodium, 10 mM de tartrate de sodium dans de l’eau ultrapure et ajuster à pH 5.
Eau ultrapure : Eau de culture cellulaire sans pyrogèneVWRL0970-500
Plaque de culture en suspension à 24 puitsGreiner bio-one662102
Plaque de culture tissulaire à 24 puitsGreiner bio-one662160
Tube conique de 50 mLGreiner bio-one227261
Centrifugeuse : VWR Mega Star 600RVWR
Incubateur CO2 : HeraCell 240Thermo Scientific
Diamond Lame de plaquette (10,2 cm x 0,3 cm)Buehler
IsometBuehler
(6 cm)Greiner bio-one628,161
Flacon en verre à bouchon à vis 20 mLCarl RothEXY4.1
Seringue stérile à usage unique 1 mLHenry Schein Santé Animale9003016
Pipette à usage unique : Pipette sériqueGreiner bio-one612301
Aiguille stérile : Aiguille hypodermique RW 27 G x 3/4''HenrySchein Santé Animale9003340
Modèle de défaut calvaire de souris
Analgésie : Buprénorphine (Bupaq)Richter Pharma AG
Anesthésie : Kétamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Stérilisant contre le rhume : SafeSept MaxHenry Schein Santé animale9882765
Éthanol (70 % vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Pommade oculaire : VitA POS 5 gUrsapharm
Solution saline normale (solution de chlorure de sodium à 0,9 %)Fresenius Kabi
Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific  ;
Solution de povidone iodée : Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4,5 % de formol tamponnéCarl Roth2213.6
Adhésif tissulaire : Histoacryl 5 x 0,5 mLB. BraunSurgical 1050060
Équipement de protection individuelle : gants chirurgicaux, casquette et masque, blouseHenry ScheinAnimal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Instruments stériles (scalpel, ciseaux, pinces,
)Aiguilles stériles : Aiguilles hypodermiques RW 27 G x 3/4'' et 30 G x 1/2''  ;Henry Schein Santé Animale9003340, 9003630
Seringue stérile à usage unique 1 mLHenry Schein Santé Animale9003016
Plaque chauffante : PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Tampons de gaze stérilesHenry Schein Santé Animale220192
Scalpel stérile jetable (Figur 20)Henry Schein Santé Animale9008957
Foret chirurgical/dentaire : Implantmed SI-923W& H Dentalwerk Bü ; rmoos GmbH16929000
Pièce à main type S-IIW& H Dentalwerk Bü ; rmoos GmbH30056000
Tréphine, diamètre 4 mmHager& Meisinger GmbH229040
Kit de tuyaux d’irrigation 2,2 mW& H Dentalwerk Bü ; rmoos GmbH4363600
Élévateur périosté 2 mm / 3 mmHenry Schein Santé animale472683
Suture non résorbable : Vert polyester, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cmHenry Schein Santé animale300715
In vitro réponses immunitaires
Anesthésie pour l’euthanasie : Kétamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Prolifération cellulaire ELISA, BrdU (colorimétrique) Kit de dosageSigma-Aldrich11647229001Le kit contient une solution de marquage BrdU, une solution de fixation (FixDenat), une solution d’anticorps anti-BrdU, un tampon de lavage et une solution de substrat
Concanavalin A (ConA)MP Biomedicals150710
Milieu de culture splénocytesMilieu RPMI + 10 % FBS inactivé par la chaleur + 1 % de solution de pénicilline-streptomycine + 0,1 % de gentamicine + 0,2 % de ß ;-mercaptoéthanol + 1 % d’acides aminés non essentiels
Éthanol (70 % vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp ;
GentamicinGibco, Thermo Fisher Scientific  ;
souris IL-1&beta ; ELISA Ready-SET-Go !Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Souris IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
souris IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
souris INF-&gamma ; ELISA MAX StandardBioLegend430801
Solution d’acides aminés non essentielsGibco, Thermo Fisher Scientific  ;
Pénicilline-streptomycine  ;Gibco, Thermo Fisher Scientific  ;
Saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific  ;
Tampon de lyse des globules rouges (GR) : BD Pharm LyseBD Bioscience555899
milieu RPMI 1640, HEPESGibco, Thermo Fisher Scientific  ;52400025
&beta ;-MercaptoethanolGibco, Thermo Fisher Scientific  ;
tube conique de 50 mLGreiner bio-one227261
plaque de culture tissulaire à 96 puitsGreiner bio-one655180
Centrifugeuse : VWR Mega Star 600RVWR
Cell strainer 40 µ ; mBD Bioscience352340
Lecteur de microplaques Infinite M200 ProTecan
Seringue stérile à usage unique 1 mLHenry Schein Santé animale9003016
Instruments chirurgicaux stériles (pinces, lames de verre)
Modèle intrapéritonéal à haut débit
Anesthésie : Kétamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Stérilisant contre le rhume : SafeSept MaxHenry Schein Santé animale9882765
Éthanol (70 % vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Pommade oculaire : VitA POS 5 gUrsapharm
Mouse IL-1&beta ; ELISA Ready-SET-Go !Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Souris IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
souris IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific  ;
Povidone iodée solution : Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining KitThermo Scientific9990700Pour la numération cellulaire différentielle.
Plaque chauffante : PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Hémocytomètre : Chambre NeubauerCarl RothPC72.1
Suture non résorbable : Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Suture résorbable : PolysorbCovidienSL-5628
Centrifugeuse Shandon pour cytopsineThermo Scientific
Seringue stérile à usage unique 1 mLHenry Schein Santé animale9003016
Tampons de gaze stérilesHenry Schein Santé animale220192
Aiguilles stériles : Aiguilles hypodermiques RW 27 G x 3/4'' et 25 GHenry Schein Santé animale9003340, 420939
Instruments chirurgicaux stériles (scalpel, ciseaux, pinces, porte-aiguilles)
Trypan blue solution 0,4 %Gibco, Thermo Fisher Scientific  ;15250061
Modèle sous-cutané subchronique
Anesthésie : Kétamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Stérilisant contre le rhume : SafeSept Max HenrySchein Santé animale9882765
Éthanol (70 % vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Pommade pour les yeux : VitA POS 5 gUrsapharm
Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific  ;
Povidone iodée solution : Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4,5 % de formol tamponnéCarl Roth2213.6
Plaque chauffante : PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Suture non résorbable : Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Équipement de protection individuelle : chirurgical gants, casquette et masque, blouseHenry ScheinSanté animale 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Seringue stérile à usage unique 1 mLHenry Schein Santé animale9003016
Tampons de gaze stérilesHenry Schein Santé animale220192
Instruments stériles (scalpel, ciseaux, pinces, porte-aiguilles)
Aiguille stérile : Aiguilles hypodermiques RW 27 G x 3/4''  ;Henry Schein 9003340 de santé animale, 420939
Disques de phosphate fort10010023 de lavage 10010023Scie basse vitesse Boîte de Pétri 10010023 porte-aiguille.1050006415750037111400501514012210010023313500101001002310010023

Références

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