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Article de méthode

Dynamique de protéomique et de miRNA analyse des Polysomes d’isolé souris coeur après Perfusion de Langendorff

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DOI :

10.3791/58079

⸱

29 août 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour effectuer le polysome profilage sur le cœur isolé perfusé souris. Nous décrivons des méthodes pour la perfusion cardiaque polysome profilage et analyse des fractions polysome en ce qui concerne les ARNm, miARN et le protéome polysome.

Résumé

Études des changements dynamiques dans la traduction des protéines nécessitent des méthodes spécialisées. Ici, nous avons examiné les changements dans les protéines nouvellement synthétisées en réponse à l’ischémie et reperfusion en utilisant le cœur isolé perfusé souris couplé avec le profilage polysome. Pour mieux comprendre les changements dynamiques dans la traduction des protéines, nous avons caractérisé l’ARNm qui étaient chargés de ribosomes cytosoliques (polyribosomes ou polysomes) récupéré polysomes mitochondriales et comparativement les répartition ARNm et de protéines dans le fractions de haut rendement (nombreux ribosomes attachés à l’ARNm), faible rendement (moins ribosomes attachés) qui comprenait également les polysomes mitochondriales et les fractions non-traduction. miARN peut également être associé ARNm qui est en cours de traduction, ce qui réduit l’efficacité de la traduction, nous avons étudié la distribution des miARN dans les fractions. La distribution des miARN, ARNm et de protéines a été étudiée dans des conditions basales perfusées, à la fin des 30 min de global ischémiques et après 30 min de reperfusion. Nous présentons ici les méthodes utilisées pour réaliser cette analyse, en particulier, l’approche à l’optimisation de l’extraction de la protéine de la gradient de saccharose, car cela n’a pas été décrite avant — et fournissent des résultats représentatifs.

Introduction

Le cœur répond à la lésion d’ischémie (I) et de la reperfusion (R) de manière dynamique. Cependant, il y a petit aperçu des changements aigus dans la synthèse des protéines au cours de la réponse. Pour y remédier, nous avons profité de la méthode bien établie de polysome1 pour identifier les changements dans l’abondance des protéines qui reflètent la redistribution des ribosomes et des facteurs de régulation traductionnelle du cytosol aux polysomes, le profilage et le augmentation des protéines nouvellement synthétisées (NSP). Dans le cadre d’I / R, l’augmentation de la synthèse des protéines nouvelles se produit dans un laps de temps qui est incompatible avec la transcription de l’ARNm nouveau2; en outre, une discordance entre les niveaux d’expression de mRNA et l’abondance de la protéine a été rapporté3. Pour ces raisons, nous avons choisi d’analyser les changements dans le protéome dynamique comme en témoigne la traduction des protéines. Pour ce faire, nous quantifier des ARNm dans les fractions de polysome et d’analyser la composition en protéines dans les fractions de polysome. Enfin, parce que les microARN (miRs) réglemente la disponibilité d’ARNm pour traduction et peut interférer avec l’efficacité de la protéine traduction4,5, nous avons examiné la distribution des miRs dans les fractions de polysome, mettant l’accent sur la réponse à I / r.

Nous avons choisi d’utiliser le modèle de perfusion de Langendorff isolés de souris et tissus récoltés dans des conditions basales de la perfusion continue, après 30 min global ischémiques et après 30 min d’ischémie suivie d’une reperfusion de 30 min. Nous avons ensuite solubilisée le tissu cardiaque et séparés des polysomes sur un gradient de sucrose, suivie de l’analyse protéomique et détection sélective des ARNm et des miARN par PCR et microarray, respectivement. Cette combinaison de méthodes représente une approche puissante pour comprendre le protéome dynamique, qui permet la détection simultanée des ARNm, miRNA et fournisseurs de services réseau, ainsi que la redistribution des protéines régulatrices, miRNA et ARNm entre fractions nontranslating, polysomes de faible rendement et les polysomes de haute efficacité (voir Figure 1). Aperçus de la régulation dynamique de ce processus seront prolongées par une analyse plus approfondie de la phosphorylation des facteurs réglementaires clés tels qu’eIF2α ou mTOR. Maintenant, ces différentes étapes sont décrites en détail.

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Protocole

Toutes les études animales ont été effectués conformément aux lignes directrices et approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité du Cedars-Sinai Medical Center.

1. Langendorff Perfusion du cœur de souris

  1. Perfusion de Langendorff de coeur de souris avec ischémie et reperfusion
    1. Administrer intrapéritonéale pentobarbital sodique 70 mg/kg à la souris adulte (âgés de 8 semaines, mâle, C57BL6/j). Confirmer une anesthésie profonde par l’absence de retrait à l’orteil pincée.
    2. Anticoagulate avec de l’héparine intrapéritonéale 500 U/kg.
    3. Ouvrir le coffre par incision sternal. Ouvrir le diaphragme et couper le long de la frontière côtière à l’axe axillaire antérieure. Ensuite, couper l’axe axillaire antérieure jusqu'à la patte avant d’ouvrir complètement la cage thoracique. Après, visualisation des coeur, serrer l’aorte ascendante avec une pince et exciser rapidement le cœur. La mort est due à l’exsanguination. Placer le cœur au froid Krebs (NaCl 6,9 g/L de KCl, 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, glycémie 2 g/L et CaCl2 0,373 g/L).
    4. Canule dans l’aorte avec une aiguille à pointe arrondie et perfuse le cœur marqués avec une solution de Krebs en mode de pression constante.
    5. Après une période de stabilisation de 15 min, sous réserve du cœur un global ischémiques pendant 30 min, suivie d’une reperfusion pendant 30 min.
    6. Récolter les cœurs après perfusion de base de 15 min, 30 min d’ischémie ou 30 min de reperfusion. Coupez les oreillettes et clin d’oeil-gel le tissu dans l’azote liquide.
    7. Conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation

2. tissu homogénéisation, solubilisation et la densité de saccharose sédimentation dégradée

  1. Préparation de gradient
    1. Préparer 2 solutions (15 % et 50 %) de saccharose de 100 mL, mélanger 4 mL de NaCl 2,5 M ;
      0,8 mL MgCl2 1,25 M ; 1 mL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 ; 15 g ou 50 g de saccharose (15 % et 50 %, respectivement) ; eau ultrapure pour atteindre 100 mL ; et à la couleur de la solution de 15 % de xylène cyanol 0,02 mg/mL)
    2. Filtrer chaque solution (0,22 µm filtres)
    3. Le jour où que le gradient est à servir, préparer 40 mL de chaque solution de sucrose et ajouter cycloheximide à chaque solution pour obtenir une concentration finale de 100 µg/mL
      1. Un fabricant de gradient permet de préparer un mélange entre les solutions de saccharose de 15 % et 50 %
      2. Remplir le compartiment gauche avec 5 mL de la pente de 15 % de saccharose
      3. Remplissez le compartiment droit avec le gradient de sucrose à 50 %
      4. Ouvrir le robinet et de mettre en marche la pompe à agiter les deux petits compartiments avec agitateur magnétique
      5. Utiliser un tube relié au deuxième robinet pour permettre à la solution de saccharose mixtes à l’écoulement dans un tube de centrifugation-ultra avec parois minces. Volume final sera d’environ 10 mL.
    4. Garder les gradients à 4 ° C (une nuit ou plus si nécessaire, mais pas plus)
  2. Homogénéisation du tissu cardiaque
    1. Homogénéiser le coeur frais ou congelé avec un polytron dans le tampon de lyse filtrée (modifié pour fractionnement gradient de saccharose) contenant 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4 % NP-40. Inclure le cycloheximide 100 µg/mL pour maintenir la structure de polysome, inhibiteur de RNase U 0,1 et inhibiteur de la protéase cocktail (1 comprimé pour 50 mL).
    2. Incuber le lysat de glace en 15 min.
    3. Centrifuger à 18 000 x g pendant 15 min à 4 ° C pour enlever la matière insoluble et recueillir le surnageant.
    4. Réserve 50 µL pour détermination des protéines, ARN et analyse d’intégrité RNA (voir Figure 2).
    5. Le surnageant (500 – 100 µL) de couche sur le dessus les gradients et équilibrer les tubes avec tampon de lyse.
  3. Sédimentation et collection des fractions
    1. Effectuer ultracentrifugation pendant 120 min à 37 000 tr/min à 4 ° C dans un rotor oscillant de seau. Selon le fabricant, ce qui correspond à 228 000 x g au rayon maximal.
    2. Collecter chaque dégradé sous forme de 17 fractions (fraction environ 600 µL de chaque) dans des tubes de microcentrifuge avec une surveillance continue de l’absorbance à 254 nm (OD254).
    3. Le collecteur de fraction du programme comme suit :
      1. Jeter les premières min 3 de collection (correspondant à du liquide contenu dans les tubes avant le gradient)
      2. Du 4 au 19 min, recueillir les fractions à la vitesse de 1 mL/min dans les 17 fractions.
    4. Placer les fractions sur la glace dès que chacun est recueillie. Congeler les échantillons à-80 ° C, si elles ne sont pas traités immédiatement. Un tracé densitométrique typique de UV du dégradé comme elle est collectée est illustré Figure 1.

3. isolement et analyse des ARNm de Polysome et Fractions Nontranslating

  1. Extraction d’ADN messagère
    1. Décongeler les fractions sur la glace, s’ils étaient congelés flash après le prélèvement
    2. Transférer 200 µL de chacune des fractions dans un nouveau tube
      NOTE : À cette étape, deux ou plusieurs fractions consécutives peuvent être regroupées ensemble. Il doit être fait soigneusement après avoir analysé le graphe de254 OD afin que les fractions polysome et non-polysome ne se mélangent.
    3. Ajouter 10 ng de la luciférase RNA comme contrôle interne à chaque échantillon dans but de normalisation.
      NOTE : Amorces luciférase devraient être utilisés comme témoin interne pour normaliser les résultats.
    4. Ajouter 700 µL de réactif d’extraction d’ARN (monophasique solution de phénol et guanidine isothiocyanate ; voir Table des matières) dans chaque tube. Bien mélanger et laisser incuber les tubes pendant 5 min à ta (température ambiante).
    5. Ajouter 140 µL chloroforme et le vortex pour 15 s. Incuber pendant 2-3 min à température ambiante.
    6. Centrifuger les échantillons pendant 15 min à 12 000 x g à 4 ° C.
    7. Transvaser avec soin la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.
    8. Étant donné que la teneur en ARN des fractions n’est pas élevée, ajouter 10 µg de glycogène comme transporteur dans chaque tube.
    9. Ajouter 350 µL isopropanol dans chaque tube. Bien mélanger et laisser incuber à-20 ° C pendant 1 h augmenter le rendement.
    10. Centrifuger pendant 15 min à 12 000 x g à 4 ° C.
    11. Jeter le surnageant et ajouter 700 µL d’éthanol 75 % pour laver le culot de RNA.
    12. Centrifuger pendant 5 min à 7 500 g à 4 ° C.
    13. Supprimer l’éthanol et laissez l’air pellet sécher pendant 10 à 15 min.
      Remarque : Trop sécher le culot de RNA empêchera sa solubilisation complète dans l’eau.
    14. Resuspendre le culot de RNA dans 50 μL de RNase-libre ultrapure H2O.
    15. Incuber les échantillons pendant 10 min à 55 ° C.
    16. 2 μL de chaque échantillon permet de mesurer la qualité et la quantité de l’ARN extrait et stocker le reste à-80 ° C.
  2. QPCR et transcription inverse
    1. Utiliser 4 μL de synthèse de cDNA de transcriptase inverse nécessaire (voir la Table des matières) pour une réaction de 20 μL. Préparer le supermix selon le nombre d’échantillons. Transférer le volume requis dans chaque tube et ajouter 5 μl de l’entrée de RNA dans chaque tube. Ce volume peut être corrigé pour être pertinents pour la plage des Taq polymérase des conditions de travail.
    2. Incuber les tubes dans un thermocycleur avec le programme suivant, recommandé par le fabricant : 5 min à 25 ° C, 20 min de transcription inverse pendant 20 min à 46 ° C et l’inactivation de la transcriptase inverse pendant 1 min à 95 ° C.
    3. Exécutez le programme optimisé pour chaque paire d’amorces qPCR.
      Remarque : Pour détecter la présence de certains ARNm dans les fractions, un volume égal de chaque fraction (de l’ARN isolé) devrait servir pour la transcription inverse.
  3. Analyse des résultats
    1. Utilisez la valeur de Ct du gène intéressé et la luciférase pour calculer les valeurs de Ct de delta
    2. Exprimer chaque delta fraction valeur Ct comme le pourcentage de la valeur totale de mRNA contenue dans toutes les fractions de visualiser la distribution de l’ARNm dans les différentes fractions (tableau 1)

4. isolement et analyse des miARN de Polysome Fractions et Fractions Nontranslating

  1. Extraction d’ADN messagère et miRNA
    Remarque : Ce protocole suit les instructions du fabricant, avec quelques changements.
    1. Décongeler le glycogène et le contrôle à spike. Rester sur la glace.
    2. Ajouter 700 µL de réactif d’extraction miRNA à 200 µL de l’échantillon.
    3. Ajouter 1 µg/µL de glycogène et homogénéiser à l’aide de la pipette. Il incuber pendant 5 min à température ambiante.
    4. Ajouter 3,5 µL de 1,6 x 108 épi-en contrôle et mélanger.
    5. Ajouter 200 µL de chloroforme et vortex il pendant au moins 15 sec.
    6. Incuber pendant 3 min à température ambiante.
    7. Centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
    8. À l’aide d’une pipette, transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Jeter les phases intermédiaire et inférieur.
    9. Ajouter 1,5 x volume d’éthanol à 100 % au surnageant et mélanger.
    10. Transférer 700 µL de ce mélange dans la colonne d’extraction de miRNA et il centrifuger à pleine vitesse pendant 15 s à RT et jeter le cheminement ; Répétez cette étape avec n’importe quel échantillon restant.
    11. Ajouter 700 µL de tampon de 1 à la colonne et il centrifuger à pleine vitesse pendant 15 s à ta ; jeter le cheminement.
    12. Ajouter 500 µL de tampon 2 à la colonne et il centrifuger à pleine vitesse pendant 15 s à ta ; jeter le cheminement.
    13. Ajouter 500 µL d’éthanol à 80 % à la colonne et il centrifuger à pleine vitesse pendant 2 min à ta ; jeter le cheminement.
    14. Transférer la colonne pour une nouvelle 2 mL non écrêtée de tube, ouvrez le couvercle et il centrifuger à RT pendant 5 min à pleine vitesse ; jeter le cheminement.
    15. Ajouter 16 µL d’eau exempte de RNAse dans la colonne et centrifuger à pleine vitesse pendant 1 min à la RT. garder l’éluat sur glace ou stocker à-80 ° C pour des analyses.
      Remarque : Deux microlitres de chaque échantillon peuvent être utilisés pour l’analyse de l’OD.
  2. Transcription inverse
    1. Préparer sur la glace. Pour chaque réaction de RT-PCR de 20 µL, ajouter 4 µL de tampon RT miRNA, 2 µL d’acides nucléiques, 9 µL d’ARN total, 2 µL d’enzyme et 3 µL d’eau exempte de RNAse ; mélanger et tourner brièvement vers le bas.
    2. Définissez le thermocycleur comme suit :
      37 ° C pendant 60 min ;
      95 ° C pendant 5 min ;
      Cale de 4 ° C.
    3. Retirer les tubes du thermocycleur et ajouter 200 µL d’eau exempte de RNAse. Conserver à-20 ° C ou procéder à la PCR en temps réel.
  3. PCR en temps réel
    Remarque : Ce protocole suit 96 puits plaque format. Préparer le mélange de réaction sur la glace.
    1. Préparer le mélange de réaction PCR et ajouter des ADNc (à partir de miARN ci-dessus) selon la plage acceptée par le protocole. Plusieurs réactions peuvent être préparées dans le lot.
    2. Ajouter un total de 25 µL du mélange PCR + ARNC dans chaque puits.
    3. Sceller la plaque à l’aide d’un joint de la plaque optique.
    4. Centrifuger la plaque pendant 1 min à 1 000 x g à la température ambiante.
    5. Programmez le cycler en temps réel comme suit :
      Étape d’activation initiale à 95 ° C pendant 15 min ;
      3-étape cyclisme : dénaturation à 94 ° C pendant 15 s ; recuit à 55 ° C pendant 30 s ; extension à 70 ° C pendant 30 s (effectuer la collecte de données de fluorescence) ; Ajouter 40 cycles ;
      Courbe de fusion selon la valeur par défaut de cycler.
  4. Analyse comparative
    1. Exemple de normalisation (voir tableau 2) :
      1. Trouver la valeur minimale de la SCM.
      2. Normaliser toutes les valeurs SCM à ce minimum.
      3. Soustraire cette valeur à partir des valeurs de Ct de miARN d’intérêt (MOI) et le gène de référence (REF).
      4. Analyser les données à l’aide de la formule 2-ΔCt .

5. analyse protéomique

  1. Extraction des protéines des fractions de polysome
    1. Combiner les fractions collectées saccharose en trois fractions finales. Marquer les fractions comme lourd (polysomes de rendement élevé dans les fractions commun 4, 5, 6 et 7 la plus forte concentration de saccharose, fond du tube dégradé), lumière (polysomes de faible efficacité en fraction mise en commun, 8, 9, 10 et 11 ; milieu de la tube de gradient) et non-traduction (fractions commun 12, 13, 14 et 15 avec la plus faible concentration de saccharose ; sommet du tube dégradé). Effectuer dosage protéique sur des fractions commun.
    2. Préparation 100 % stock d’acide trichloracétique (TCA) et conserver à 4 ° C dans l’obscurité. 0,5 mL de l’échantillon se mêlent 60 µL de 100 % TCA et incuber à-20 ° C durant la nuit dans l’obscurité.
      Remarque : Utiliser des tubes de rétention de faible teneur en protéines de 1,5 mL (voir Table des matières).
    3. Après une nuit d’incubation, décongeler l’échantillon sur la glace et centrifuger à 15 000 x g, 4 ° C pendant 30 min. jetez surnageant.
      Remarque : 100 µg de protéines dans l’échantillon donne pellet protéine visible dans le bas du tube.
    4. Acétone pré refroidissement dans le congélateur-20 ° C. Ajouter 0,5 mL d’acétone froid au culot de protéine et centrifuger à 15 000 x g, 4 ° C pendant 15 min. jetez surnageant. Répéter cette étape deux fois.
    5. Sécher à l’air le culot. Resuspendre le culot dans 360 µL de tampon Tris-HCl à 50 mM (pH 8).
      Remarque : Si nécessaire, utilisez un sonicateur impulsion pour Resuspendre le culot.
    6. Ajouter 40 µL de 0,1 M le dithiothréitol (concentration finale 10 mM) et incuber à 55 ° C sur l’agitateur pendant 45 min. Ajouter 50 µL de 0,15 M iodoacétamide (concentration finale 17 mM) et incuber à température ambiante sur l’agitateur pendant 30 min dans l’obscurité.
    7. Préparer la solution de trypsine : resuspendre 20 µg de trypsine dans 100 µL de bicarbonate d’ammonium 50 mM. Ajouter un volume correspondant d’une solution de trypsine à échantillon à 01:50 (w/w) rapport de la trypsine : protéine, veiller à ce que le pH est de 8 et incuber sur agitateur à 37 ° C pendant la nuit.
      NOTE : Ajouter le bicarbonate d’ammonium 1 M pour amener le pH à 8.
    8. Après la digestion trypsique, cool l’échantillon, centrifuger brièvement dans la centrifugeuse de paillasse, ajouter 10 % d’acide formique à pH 2 et 3 à étancher l’activité de la trypsine et aller de l’avant avec l’échantillon de dessalage.
      Remarque : Utilisez la plaque de µ-élution pour échantillon de dessalement.
    9. Condition de sorbant dans les puits de 96 puits plaque avec 200 µL du méthanol à l’aide de vide trois fois suivie par le conditionnement 200 µL d’acide formique 0,1 % trois fois. Charger l’échantillon et d’effectuer un lavage de l’échantillon avec 200 µL d’acide formique 0,1 % trois fois. Éluer l’échantillon avec 100 µL de 50 % d’acide formique acetonitrile/0.1% deux fois dans le tube de 0,5 mL de rétention faible en protéines.
      NOTE : Éluer l’échantillon lentement dans un premier temps à l’aide de gravitation suivi par vide bas.
    10. Évaporer l’éluat échantillon à sec à l’aide de concentrateur et soit procéder directement analyse par spectrométrie de masse ou de magasin à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
  2. Analyse par spectrométrie de masse
    1. Reconstituer chaque pellet (comprenant les peptides tryptiques) dans 50 à 100 µL et injecter 1 µL de spectromètre de masse.
      Remarque : Optimiser la reconstitution et l’injection de volumes pour obtenir l’intensité maximale du signal LC/MS/MS. Dans notre cas, le signal maximal (ion totale actuelle ; TIC) dans le cœur de l’analyse se situait dans la fourchette de 1E8 à 2E9.
    2. Utiliser un piège à colonne C18 (300 µm d.i. x 5 mm, 5 µm, 100 a) suivi par séparation de peptide à l’aide de la colonne C18 (75 µm d.i. x 250 mm, 2 µm, 100 a) avec un réglage de taux de débit à 300 nL/min Set la température capillaire de nano-source à 275 ° C et la tension de pulvérisation à 2 kV.
    3. Appliquer un dégradé linéaire B de 5 à 35 % pendant 90 min, 35 – 95 % B pendant 3 min, attente à 95 % B pendant 7 minutes et équilibrage à 5 % B pendant 25 min (r : 0,1 % d’acide formique/eau et B: 0,1 % d’acide formique dans l’acétonitrile). Acquérir des spectres de MS2 15 ions plus haute intensité de chaque scan MS1 mode de CID. Utiliser 3 répétitions de spectrométrie de masse pour chaque échantillon analysé.
      NOTE : Optimiser et utiliser les conditions expérimentales et les paramètres qui conviennent à vos échantillons sur l’instrument de spectrométrie de masse particulière. Les conditions et les paramètres mentionnés à l’article 5.2. ont été utilisés et optimisés dans notre laboratoire.
  3. Identification de protéines/dosage
    1. Après analyse de spectrométrie de masse, convertir les fichiers raw de spectres en fichiers compatibles mzXML à l’aide du logiciel MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. Soumettre les fichiers convertis dans moteur de recherche SEQUEST avec les critères de recherche, par exemple, UniProtKB/Swiss-Prot souris de base de données (plus à jour revue canonique) ; digest de semi enzymatique à l’aide de la trypsine (après KR /-) ; avec jusqu'à 2 raté clivages ; gamme de masses précurseur : 400 à 4 500 amu ; modification statique : carbamidomethyl (C) 57,021465 UMA ; la masse tolérance peptide : 50 ppm ; fragment de type masse : monoisotopique.
      Remarque : Autres recherche de base de données de protéine moteurs et données pipelines peut être utilisés. Si vous utilisez la base de données pour par exemple le rat, qui est moins complète que les bases de données pour les souris et les humains, vous devrez peut-être Rechercher contre la souris (ou homme) bases de données pour accroître la couverture du protéome. Dans ce cas, redondance dans les noms de protéines devront être retirés.
    3. Effectuer une analyse de la recherche. Configurez les filtres d’affichage des données. Par exemple, définir une probabilité minimale en protéines (seuil de protéines) dans le 95 ou 99 %, c'est-à-dire seulement les protéines pour lesquels une analyse statistique implique 95 ou 99 % de probabilité d’être présents dans l’échantillon seront affichera. Positionnez le filtre seuil de peptide (par exemple, 95 %), soit une probabilité minimale qui sera utilisée pour déterminer si un spectre identifie un peptide. Sélectionnez le nombre minimal de peptides qui permettra de déterminer si une protéine est présente (2 peptides au minimum pour l’identification des protéines est recommandé).
    4. Évaluer des protéines identifiées pour la qualité/quantité. Veiller à ce que les peptides proteotypic sont utilisées pour la quantification. Si l’isoforme est identifié s’assurer que c’est base sur l’observation d’un peptide trypsique constitué en une séquence d’acides aminés unique à l’isoforme spécifique. Toutes les protéines « semblables » ou hypothétiques devraient subir une comparaison pour voir si l’observé peptides correspondent à une protéine connue.

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Résultats

analyse de l’ARNm
résultats de l’ARNm peuvent être exprimées comme une distribution d’un ARNm spécifique dans chacune des fractions (Figure 3 a) ; pour la quantification, combiner des fractions de traduction polyribosomiques et comparer à la fraction non-traduction (Figure 3 b), présentant un rapport de l’abondance d’ARNm dans la traduction des fractions nontranslating. Des informations supplémentaires sont acquise en...

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Discussion

Analyse du profil de polysome permet l’étude de la traduction des protéines en analysant l’État translationnelle d’un ARNm spécifique ou le transcriptome ensemble6,7. Il est également d’une grande aide lorsque la traduction locale doit être étudié comme synaptosomes8. Traditionnellement, cette méthode consiste à séparer des mono - et polyribosomes et les ARNm associés sur un gradient de saccharose peut être couplée à génomiques ou protéomi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), centre du cœur féminin Barbra Streisand (RAG, JVE), Dorothy et E. Phillip Lyon chaise en cardiologie moléculaire (RAG), Erika Glazer doté de chaire en santé de la femme de cœur (JVE) et l’Académie tchèque des Sciences Appui institutionnel RVO : 68081715 (MS).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
PentobarbitalVortech Phamaceuticals9373pour euthanasie
HéparineSagent103424préparation de langendorff
Outils de science fine91110-10utilisé pour accrocher le cœur
Système de LangendorffRadnoti + fait maisonn/aUn système 'quatre cœurs' composé de verre soufflé sur mesure, de tubes et de bains-marie
NaClSigmaS7653-5KGTampon Krebs et gradient de saccharose
KClSigmaP5405Tampon Krebs et tampon de lyse
KH2PO42SigmaP-5504Tampon Krebs
MgSO4SigmaM7774-500GTampon Krebs
GlucoseSigmaG5767Tampon Krebs
CaCl2SigmaC1016-500GTampon Krebs
Poudre de saccharoseSigmaS0389-1KGGradient de saccharose
MgCl2Sigma208337Gradient de saccharose et tampon de lyse
Tris-baseSigmaT1503-1KGGradient de saccharose et tampon de lyse
Xylène CyanoleSigmaX-4126Gradient de saccharose
CycloheximideSigma-aldrich239763Gradient de saccharose et tampon de lyse
RNaseOUTLife TechnologiesC00019Inhibiteur de RNAse pour tampon de lyse
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021Tampon de lyse
Inhibiteur de protéase Comprimés cocktails, sans EDTARoche5056489001
Tube, paroi mince, ultra-transparent, 13,2 mL, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
UltracentrifugeuseBeckmanLE-80KUltracentrifugation des gradients
RotorBeckmanSW41Ultracentrifugation des gradients
Biologic LP (pompe)Biorad731-8300Fractionnement des gradients
BioFracBiorad741-0002Fractionnement des gradients
Eppendorf ARN/ADN Tubes à centrifuger LoBind, tube de 2 mLSigmaZ666513-100EAFraction à gradient et extraction de l’ARN
TRIzol ReagentLife technologiesAM9738Extraction de l’ARN
Luciferase Contrôle ARNPromegaL4561Extraction de l’ARN
ChloroformeFisher ScientificC606-4ARN extraction
Glycogène, grade ARNThermo Fisher ScientificR0551Extraction d’ARN
IsopropanolSigmaI9516Extraction d’ARN
EthanolSigmaE7023-1LExtraction d’ARN
iScript cDNA Synthesis KitBioRad170-8891Transcription inverse
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad175-5122PCR
quantitative miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084Kit pour l’isolement total de l’ARN
miScript II RT Kit (50)Qiagen218161Kit pour la transcription inverse des miARN
miScript Sybr Green PCR Kit (200)Qiagen218073Kit pour l’analyse de l’expression PCR en temps réel des miARN
Centrifuge 5424REppendorfPour la centrifugation de tubes de 1,5 mL ou 2,0 mL à différentes températures. Vitesse maximale - 21130 x g
Centrifugeuse 5810REppendorfPour la centrifugation de plaques PCR en temps réel à différentes températures. Vitesse maximale - 2039 x g
My Cycler ThermocyclerBio-RadPour la transcription inverse
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal CyclerBio-RadPour l’analyse PCR en temps réel
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610Pour le contrôle de la qualité de l’isolement de l’ARN
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, profil bas, paroi mince, à jupe, vert/clairBio-RadHSP9641Pour l’analyse PCR en temps réel
Microseal 'B' Plaque Sealing Film d’étanchéité, adhésif, optiqueBio-RadMSB1001Pour l’étanchéité des plaques PCR en temps réel
Recherche plus Pipette monocanale, gris ; 0,5-10 & micro ; LEppendorfUX-24505-02Pour le pipetage
pipettes PIPETMAN Classic, P20GilsonF123600GPour le pipetage
pipettes PIPETMAN Classic, P200GilsonF144565Pour le pipetage
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µ ; LGilson17011782Pour le pipetage du
glycogène, grade ARNThermo Fisher ScientificR0551Améliore l’efficacité totale de l’isolement de l’ARN
Tubes Posi-Click 1,7 mL, couleur naturelleDenvilleC2170Isolement et stockage de l’ARN ; mélange de réactifs
Tubes à cycle thermique -0,2 mL Bouchons individuels, tubes standard de 0,2 mL avec optiquementDenvilleC18098-4 (1000910)Réaction de transcription inverse
Sharp 10 Pointes de barrière de précisionDenvilleP1096-FRPour le pipetage
Sharp 20 Pointes de barrière de précisionDenvilleP1121Pour le pipetage
Sharp 200 Pointes de barrière de précisionDenvilleP1122Pour le pipetage
Pointes LTS 1 mLFiltre RaininRT-L1000FPour le pipetage
miScript Primer Assay ( 200)Qiagen(il change en fonction du miARN)Pour l’analyse PCR en temps réel
Gradient Master ver 5.3 Modèle 108BioComp InstrumentsPour la préparation des gradients de saccharose
Acide trichloracétiqueSigma AldrichT6399
AcétoneSigma Aldrich650501
Chlorhydrate de TrisAmrescoM108
dithiothreitolFisher ScientificBP172
iodoacétamideGbiosciencesRC-150
séquençage qualité trypsine modifiée, porcinePromegaV5111
bicarbonate d’ammoniumBDHBDH9206
acide formique, Optima LC/MSChemicalA117
méthanol, Optima LC/MSFisher ChemicalA454
acétonitrile, Optima LC/MSChemicalA996
Tubes Protein LoBind 0,5 mLEppendorf AG22431064
Tubes Protein LoBind 1,5 mLEppendorf AG22431081
HLB & micro ; Plaque d’élution 30 & micro ; mOasis186001828BA
Concentrateur SpeedVacThermo ScientificSavant SPD2010
sonicateurQsonicaOasis180
centrifugeuse Thermo ScientificSorvall Legend micro 21R
LC colonne de piège PepMap 100 C18Thermo Scientific160454
colonne de séparation LC PepMap RSLC C18Thermo Scientific164536
spectromètre de masseThermo ScientificOrbitrap Elite Spectromètre
MSConvert logicielProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST logicielSage-N Research, Inc.
utilisé dans la pince de des des Fisher Fisher de masse à piège ionique

Références

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