Nous présentons ici un protocole pour différencier murin granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing cellules T auxiliaires (THGM) de cellules CD4 + T naïves, notamment l’isolement des cellules CD4 + T naïves, différenciation des THGM, et analyse des cellules THGM différenciées. Cette méthode peut être appliquée aux études de la régulation et fonction des cellules THGM.
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Article de méthode
In Vitro Différenciation des souris Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-production de cellules T auxiliaires (THGM)
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-produisant des lymphocytes T helper (THGM) est un sous-ensemble de cellules d’assistance T nouvellement identifié qui principalement sécrète GM-CSF sans produire l’interféron (IFN) γ ou interleukine (IL) -17 et se trouve à jouent un rôle essentiel dans la neuro-inflammation auto-immune. Une méthode d’isolement de cellules T CD4 + naïf d’une suspension de cellules individuelles des splenocytes et génération de cellules THGM de cellules T CD4 + naïve serait une technique utile dans l’étude de l’immunité à médiation cellulaire T et maladies auto-immunes. Nous décrivons ici une méthode qui le différencie des cellules T CD4 + naïf de souris en cellules THGM promues par l’IL-7. Le résultat de la différenciation a été évalué par l’analyse de l’expression de cytokines à l’aide de différentes techniques, notamment des cytokines intracellulaires coloration combinée avec la cytométrie en flux, une quantitative PCR en temps réel (PCR), et dosages immuno-enzymatiques (ELISA). Utilisant le protocole de différenciation THGM comme décrit ici, environ 55 % des cellules exprimé GM-CSF avec une expression minimale d’IFNα ou IL-17. L’expression prédominante de GM-CSF par les cellules THGM a été confirmée par l’analyse de l’expression du GM-CSF, IL-17 niveaux d’ARNm et protéines et IFNα. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour différencier les cellules T CD4 + naïf à THGM cellules in vitro, qui sera utile dans l’étude de la biologie cellulaire THGM.
Introduction
Cellules CD4 + T auxiliaires (TH) sont des éléments essentiels du système immunitaire, ayant un rôle crucial dans la défense de l’hôte contre les agents pathogènes microbiens, dans la surveillance du cancer et l’auto-immunité1,2,3. Lors de l’activation de récepteur (TCR) de lymphocytes T, cellules T CD4 naïves peuvent être différenciés en TH1, TH2, TH 17, ou réglementaires T (Treg) cellules sous l’influence de cytokines différents milieux2,4, 5. récemment, un sous-ensemble de nouveau des cellules TH , qui produit principalement des GM-CSF, a été identifié et nommé THGM6. La différenciation des cellules THGM est entraînée par l’IL-7 par le biais de l’activation d’un transducteur de signal et un activateur de transcription 5 (STAT5). Ces cellules expriment une grande quantité de GM-CSF tout en ayant une faible expression des autres TH-cell signature cytokines telles que l’IFNγ et IL-176. GM-CSF s’est avéré jouent un rôle essentiel dans le développement de CD4 + T cell-mediated neuroinflammation7,,8. Par rapport à IFNγ ou IL-17-exprimant des cellules autoréactives T, T exprimant le GM-CSF cellules transférés à sauvage souris (WT) faits une apparition précoce de la maladie et la gravité de la maladie. En outre, les cellules de T de Csf2- / - n’a pu induire encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) après avoir été transféré Moutschen aux destinataires WT, tandis que les cellules T dépourvues d’IFNγ ou IL-17 a conservé la capacité de provoquer des EAE7. En outre, un blocus de GM-CSF à l’aide d’anticorps neutralisants amélioré EAE maladie gravité8. En outre, une carence de STAT5 dans les cellules T chez les souris a entraîné dans une génération THGM diminuée et, partant, à une résistance des souris EAE développement6. Ces résultats soulignent l’importance des lymphocytes T exprimant le GM-CSFH de maladie auto-immune thérapeutiques. Ainsi, en établissant une méthode pour différencier les cellules T exprimant le GM-CSFH de cellules T CD4 + naïve serait important dans l’étude de la pathogenèse de la neuro-inflammation auto-immune et immunité à médiation cellulaire T. Toutefois, un protocole qui efficacement génère des cellules THGM de murin naïf que CD4 + n’a pas été établi.
Nous présentons ici une méthode qui se différencie des cellules THGM de cellules T CD4 naïves. Ce protocole décrit l’ensemble de la procédure, y compris l’extraction de la rate de la souris, la préparation d’une suspension de cellules individuelles, la sélection positive de CD4, la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et la cellule TH différenciation et l’analyse. Lymphocytes T helper différenciés sont analysés par cytokine intracellulaire coloration combinée avec écoulement cytometry pour déterminer l’expression de cytokines au niveau unicellulaire, par une PCR quantitative en temps réel afin de déterminer l’expression de cytokines au niveau de l’ARNm, et par ELISA pour évaluer l’expression de cytokines au niveau de la protéine. Cette méthode peut être appliquée aux études de biologie cellulaire THGM dans diverses conditions, telles que EAE, où GM-CSF joue un rôle important dans la pathogenèse.
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Protocole
Toutes les souris utilisées dans le présent protocole ont été sur le bagage génétique de C57BL/6 et logés dans des conditions spécifiques à la National University of Singapore exempts de micro-organismes pathogènes. Toutes les expériences ont été effectuées à l’aide de protocoles approuvés par le Comité de l’urbanisme de l’Université nationale de Singapour et d’institutionnels animalier.
1. réactif et préparation du matériel
- Préparer 500 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2 % sérum fœtal (SVF) et l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM.
Remarque : Conservez le tampon sur la glace tout au long de l’ensemble de la procédure pour des résultats optimaux. - Préparation de 50 mL de médias RPMI complet contenant de la pénicilline-streptomycine RPMI 1640, 10 % de SVF et 1 %. Utiliser les médias RPMI complets contenant 50 µM de β-mercaptoéthanol pour la différenciation des cellules THGM. Ajouter le β-mercaptoéthanol sous une hotte.
- Préparer 7,5 mL d’un mélange d’anticorps anti-CD3e en diluant le stock d’anti-CD3e concentrée à 3 μg/mL dans du PBS. Enduire les plaques 48 puits en ajoutant 150 μL du mélange anticorps à chaque puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant au moins 1 h ou à 4 ° C jusqu’au lendemain.
- Stériliser une paire de ciseaux et pinces et conservez-les dans l’éthanol à 70 % entre les dissections.
2. préparation des Splenocytes murins
- Euthanasier la souris (de 6 à 8 semaines) à l’aide d’une asphyxie de2 CO approuvés sur le plan institutionnel ou dislocation cervicale. Vaporiser la souris avec l’éthanol à 70 % et de le monter sur un bloc de polystyrène sur le dos. Transférer la souris dans une armoire de procéder aux étapes suivantes de la sécurité biologique.
- Tendez la peau à l’aide d’une paire de pinces et couper la peau au-dessous de la cage thoracique du côté gauche pendant environ 4 cm, à l’aide d’une paire de ciseaux. Ouvrez le sac péritonéal pour exposer la rate et utilisez une pince stérile pour extraire la rate.
- Placer une passoire de cellule 70 μm sur un tube de 50 mL et mouillez-le avant avec 2 mL de tampon. Placez la rate sur la crépine de la cellule (2 – 3 rates pour crépine d’une seule cellule) et faites-les macérer avec la fin d’un piston de seringue de 5 mL.
- Rincer la crépine et le tube plusieurs fois avec 1 à 2 mL de tampon d’isolement cellulaire jusqu'à ce que toutes les cellules sont déversés dans le tube. Jeter la crépine de la cellule et centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot cellulaire avec 5 mL de froid (4 ° C) d’ammonium-chlorure-potassium (ACK), lyse tampon (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA ; pH 7,2 – 7,4) et mélanger doucement pour 2 min. Ajouter 10 mL de médias RPMI complet pour neutraliser l’accusé de réception tampon et Centrifuger immédiatement les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant après la centrifugation.
3. séparation de lymphocytes T CD4 + des cellules à l’aide de microbilles magnétiques CD4 et une colonne de séparation cellulaire
- Resuspendre le culot dans 5 mL de tampon d’isolement cellulaire. La suspension de cellules à l’aide d’un filtre avant la séparation (30 μm) dans un nouveau tube de 15mL pour enlever tous les débris du filtre.
- Prenez 10 μl de la suspension cellulaire et faire une dilution de 10 x en ajoutant 90 μL de tampon. Prendre 10 μl de la suspension cellulaire dilué et mélangez-le avec 10 μL de trypan blue pour le comptage des cellules. Compter les cellules dans un hémocytomètre pour déterminer le rendement des cellules viables.
- Centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules 90 μL de tampon par 107 cellules. Ajouter 10 μL de microbilles magnétiques de CD4 par 107 cellules. Incuber les cellules pendant 15 min à 4 ° C. Pour des résultats optimaux, mélanger la suspension cellulaire doucement toutes les 5 min pendant l’incubation.
- Alors que les cellules sont en incubation, placez une colonne de séparation sur le support magnétique. Pré humide la colonne avec 2 mL de tampon.
- À la fin de l’incubation de cellules/perle, laver les cellules avec 5 mL de tampon et les centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon, charger l’échantillon dans la colonne de séparation cellulaire et laissez-le passer. Utiliser un tube à centrifuger de 15 mL pour recueillir la fraction de cellules CD4. Ajouter 1 mL de tampon pour laver le réservoir avant qu’il soit sec. Répétez l’étape de lavage 2 x.
- Supprimer la colonne de séparation cellulaire du support magnétique et le placer sur un nouveau tube à centrifuger 15 mL. Ajouter 2 mL de tampon d’isolement cellulaire à la colonne de séparation des cellules et appliquer le piston fermement pour forcer les cellules de la colonne.
- Centrifuger la fraction à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir des cellules CD4 +. Jeter le surnageant.
4. la purification des cellules T CD4 + Naive (CD4+CD25–CD44loCD62LSalut) par différenciation cellulaire tri et THGM activés par Fluorescence
- Resuspendre le culot de cellules CD4 + obtenu dans 500 µL de tampon. Mélanger les cellules avec un mélange d’anticorps fluorescent conjugués contenant CD4-PerCp (2,8 µg/mL), CD44-APC (2,4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL) et CD62L-FITC (10 µg/mL) (tableau 1). Incuber les cellules sur la glace pendant 20 à 30 min, tout en les protégeant de la lumière.
Remarque : Les concentrations d’anticorps ont été optimisées précédemment dans le laboratoire. Le nombre d’anticorps énumérés est pour les cellules de souris de 1 – 2. - Après l’incubation, laver les cellules avec 5 mL de tampon et centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules de 500 µL de tampon. Filtrer les cellules à l’aide une maille en nylon.
- Transférer la suspension de cellules dans un tube de FACS pour le tri des cellules. Précouche les tubes de prélèvement FACS avec 500 µL de tampon.
- Obtenir un CD4+CD25–CD44loCD62LSalut population (de naïve CD4+ T cellules) en triant les FACS. Porte de CD4+CD25– premiers et puis sélectionnez CD44loCD62LSalut les cellules de cette population.
- Recueillir les naïfs CD4+ T fractions de cellules dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules T CD4 + naïve à une concentration de 106 cellules/mL dans un milieu RPMI complet contenant 50 µM β-mercaptoéthanol.
- Aspirer les anticorps anti-CD3e utilisés pour preliminaire dans la plaque 48 puits. Cellules de semences 0,25 millions (250 µL) dans chaque puits avec l’IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µg/mL) et anti-IFNγ (10 µg/mL) (tableau 1).
Remarque : Les concentrations de cytokines et anticorps ont été optimisées précédemment dans le laboratoire pour une différenciation des cellules THGM. - Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 3 jours. Ne changez pas le milieu au cours de l’incubation.
5. l’analyse des cellules souris THGM Generated In Vitro
- À l’aide d’un microscope, vérifier la différenciation des cellules 3 d après la différenciation. Récolter les cellules et les centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Laver les cellules 2 x avec support complet de RPMI.
Remarque : Les cellules différenciées sont plus grands en taille que les cellules T CD4 + naïf. - Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de médias RPMI complet. Prenez 10 μl de suspension cellulaire et mélangez-le bien avec 10 μL de trypan blue pour déterminer le nombre de cellule avec un hémocytomètre. Diviser les cellules différenciées en trois potions pour une restimulation et d’analyse.
NOTE : Coloration Intracellular cytokine et tests ELISA nécessitent 0,5 million de cellules et analyse qPCR fonctionne avec ≥ 1 million. -
Pour la coloration de cytokine intracellulaire, relancer les cellules avec phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) (100 ng/mL) et ionomycine (1 μg/mL) en présence d’un inhibiteur de transport de protéines (1 µL/mL) pendant 4 à 6 h.
- Récolter les cellules et les taches avec un anticorps anti-CD4 (PerCP-conjugués, 0,2 mg/mL, dilution au 1/100 ; ou conjugué FITC, 0,5 mg/mL en dilution 1 : 100) pendant 30 min.
- Fixer les cellules avec 200 μL de tampon de fixation pour 20 à 60 min. Après fixation, laver les cellules 2 x avec 1 mL de tampon de perméabilisation.
- Effectuer la coloration intracellulaire avec des anticorps dirigés contre le GM-CSF (PE-conjugués, 0,2 mg/mL, dilution 1 : 100), IL-17 a (conjugué FITC, 0,5 mg/mL, dilution au 1/100 ; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, dilution 1 : 100), IL-4 (APC-conjugués, 0,2 mg/mL, dilution 1 : 100) et IFNγ (APC-conjugués, 0,2 mg/mL, dilution au 1/100 ; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, dilution 1 : 100) pendant 30 min à l’obscurité.
- Pour une analyse de qPCR de l’expression de gènes de cytokines par les cellules différenciées, activer les cellules avec plaque lié aux anti-CD3e (3 μg/mL) (recouvrant la plaque comme indiqué au point 1.3). À 3 h après la stimulation, récolter les cellules pour isoler l’ARN total utilisant un réactif de phénol RNA extraction afin de préparer le qPCR de cDNA. Le programme utilisé pour le qPCR et amorces sont répertoriés dans les tableaux 2 et 3, respectivement.
- Pour l’analyse de la sécrétion de protéine de cytokines par les cellules différenciées, relancer les cellules avec plaque lié aux anti-CD3e (3 μg/mL) pendant 24 h (recouvrant la plaque comme indiqué au point 1.3). Récolter le surnageant pour IL-17 et GM-CSF ELISA déterminer leurs concentrations de culture cellulaire.
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Résultats
Les cellules T CD4 + naifs isolées de deux souris C57BL/6 mâles de 8 semaines ont été divisés en trois parties. Une portion des cellules est différenciée en suivant le protocole décrit les cellules THGM. Une autre partie a été cultivée dans des conditions THGM en présence d’anticorps anti-IL-4 (10 µg/mL) pour tester l’influence d’un blocus de l’IL-4 dans la différenciation des THGM. La dernière partie a été cultivée dans un état de différenciation 17 T
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Discussion
Ici, nous avons décrit un protocole d’une différenciation de THGM in vitro de cellules de souris naïves CD4 +, suivie d’une analyse des cellules différenciées pour valider la méthode. À noter, rate et les ganglions lymphatiques peut être utilisés pour naïve purification de cellules T CD4 + et différenciation THGM. L’expression de cytokines déterminée par cytokine intracellulaire coloration combiné avec écoulement cytometry a montré qu’environ 55 % des cellules ont été amenées à devenir des ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette étude a été financée par des subventions de l’Université nationale santé système de Singapour (T1-2014 Oct-12 et T1-2015 Sep-10).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Capricorn inactivé par la chaleur | FBS-HI-12A | ||
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1ère Base | BUF-2040-10 | Dilué à 1x PBS dans de l’eau stérile |
| EDTA | 1ère Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x Tampon | ACKBiolegend | 420301 | dilué dans de l’eau stérile |
| Filtre cellulaire | SPL Life Sciences | 93070 | |
| Microbilles CD4 | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS colonne | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| support magnétique | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Seringue 1 mL | Terumo | SS+01T | |
| Centrifugeuse | Eppendorf Eppendorf 5810R | ||
| Trieur de cellules Sony SY3200 Trieur | Sony | Sony SY3200 Tube | |
| à centrifuger conique 50 mL | Greiner Bio-One | 210261 | |
| Tube à centrifuger conique de 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Tube | FACSCorning | 352054 | |
| 24 puits plaque de culture cellulaire | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-souris CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugué anti-souris CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-humain/souris CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-souris CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Chambre de comptage améliorée Neubauer | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Sciences de la vie | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified ; anti-souris CD3e ; anticorps | Biolegend | 100314 | |
| Hamster purifié anti-souris CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Rat purifié ; anti-souris IFN&gamma ; ; | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Biolegend | de l’anticorps IL-4 anti-souris purifié | 504102 | |
| IL-7 de souris recombinante | R& Système D | 407-ML | |
| recombinant humain TGF-bêta | R& D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycine | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug inhibiteur de transport de protéines | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Fixation intracellulaire& Kit tampon de perméabilisation | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-souris GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-souris IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-souris IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| souris GM-CSF ELISA Ready-SET-Go ! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Souris IL-17A Souris ELISA non cousue | invitrogen | 88-7371-22 |
Références
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
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