Nous rapportons des méthodes de caractérisation de la rupture des membranes de plasma induite par le MLKL en necroptosis y compris l’imagerie conventionnelle et confocale microscopie de cellules vivantes, microscopie à balayage électronique et liaison lipidique axée sur les NMR.
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Article de méthode
Caractérisation de la Rupture des membranes de Plasma induite par le MLKL en Necroptosis
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Necroptosis est un chemin de mort cellulaire programmée déclenché par l’activation du récepteur interaction protéine kinase 3 (RIPK3), qui phosphoryle et active le pseudokinase domaine kinase similaire de lignée mixte, MLKL, à se rompre ou permeabilize de la membrane plasmique . Necroptosis est une voie inflammatoire associée à des pathologies multiples, y compris l’auto-immunité, maladies infectieuses et cardiovasculaires, accidents vasculaires cérébraux, neurodégénérescence et le cancer. Nous décrivons ici les protocoles pouvant servir à qualifier le bourreau de rupture de la membrane plasmique dans necroptosis MLKL. Nous visualisons le processus de necroptosis dans les cellules à l’aide d’imagerie de cellules vivantes par microscopie de fluorescence conventionnels et confocale et dans les cellules fixes à l’aide de la microscopie électronique, qui ensemble ont révélé la redistribution des MLKL du cytosol au plasma membrane avant induction de grands trous dans la membrane plasmique. Nous présentons en vitro analyse de résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’aide de lipides pour identifier des modulateurs putatifs de médiation MLKL necroptosis. Selon cette méthode, nous avons identifié quantitatives préférences de lipide-fixation et phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) comme liants critiques des MLKL qui sont requises pour le ciblage de la membrane plasmique et la perméabilisation dans necroptosis.
Introduction
Identifier les composantes génétiques de necroptosis a facilité l’utilisation de modèles animaux pour tester l’implication des necroptosis dans la physiologie et les maladies1,2,3,4,5. Ko de RIPK3 ou MLKL chez les souris avait une implication minimale dans l’homéostasie développement et adulte, ce qui laisse supposer que necroptosis n’est....
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Protocole
1. clonage et de génération de ligne de cellules
- PCR amplifier la région de la BNB, correspondant aux résidus d’acides aminés (BNB140), 1-140 de cDNA de la MLKL humaine pour cadre standard axée sur les enzymes de restriction clonage avec la protéine de liaison oligomérisation domaine 2 x FK506 (2xFKBP ou 2xFV) et fluorescentes de Vénus protéine dans la Doxycycline (Dox) - vecteur rétroviral inductible pRetroX-TRE3G pour obtenir la BNB140- 2xFV-Venus (tableau 1, figure 1 a-B).
- Immortaliser la primaire mlkl- / - ou ripk3- / - mlkl- / - fibroblastes embryonnaire....
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Résultats
Visualisation necroptosis réglementé l’exécution dans des cellules vivantes a été possible grâce à une expression inductible d’une construction minimale de MLKL tronquée, BNB140-2xFV-Venus. Cette construction maintient la capacité d’induire la perméabilisation de la membrane plasmique et est activée par oligomérisation Dim-induite de la cassette FKBP (2xFV). Nous observons et quantifier necroptosis par microscopie des cellules vivantes d’imagerie, le suivi cinétique (toutes les.......
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Discussion
Nous fournissons des protocoles pour les techniques que nous avons combiné impliqué MLKL comme le bourreau présumé de rupture de la membrane plasmique24. En plus de déchiffrer le réseau de régulation qui régule induite par le MLKL necroptosis, ces techniques peuvent servir indépendamment pour caractériser d’autres systèmes biologiques adaptés. Concrètement, ces techniques sont des outils de découverte du milieu à faible débit.
Régulièrement, nous avons utilisé une image.......
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Clonage et génération de lignées cellulaires | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivateur plasmide | Llambi et al., 2016 | ||
| Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Chlorhydrate de blasticidine S | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Quantification de la mort cellulaire et microscopie sur cellules vivantes | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| Homodimériseur B/B AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Vert | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 Chlorure d’ammonium N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| DTT deutéré | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Oxyde de deutérium | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-&beta ;-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-&alpha ;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (cerveau, porcin) (sel d’ammonium) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (sel d’ammonium) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (sel d’ammonium) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR ou ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Imagerie par microscopie à cellules vivantes | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam ; | Thermo Fisher Scientific | Microscope | |
| électroniqueSoftware | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Analyse d’imagerie |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| , TopSpin v3.2 | Bruker, BioSpin | http://www.bruker.com | collecte de données RMN, |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ ; | Analyse des données RMN | |
| Slidebook | 3i (Innovations en imagerie intelligente) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Microscopie confocale |
Références
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nat....
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Réimpressions et autorisations
