Article de méthode

Détection de l’activité de la Phospholipase C dans l’homogénat de cerveau de l’abeille

DOI :

10.3791/58173

⸱

14 septembre 2018

 ,  , 
1Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour tester les effets inhibiteurs des agents pharmacologiques sur la phospholipase C (PLC) dans différentes régions du cerveau de l’abeille, nous présentons une analyse biochimique pour mesurer l’activité du PLC dans ces régions. Cet essai pourrait être utile pour comparer l’activité PLC entre les tissus, ainsi que chez les abeilles présentant des comportements différents.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’abeille est un organisme modèle pour l’évaluation des comportements complexes et des fonctions cérébrales supérieures, telles que l’apprentissage, la mémoire et la division du travail. Le corps du champignon (MB) est un centre de cerveau supérieur a proposé d’être le substrat neuronal de comportements complexes abeille. Bien que les études antérieures identifié des gènes et protéines différentiellement exprimés dans la ROM et des autres régions du cerveau, l’activité des protéines dans chaque région n’est pas encore pleinement comprise. Pour révéler les fonctions de ces protéines dans le cerveau, analyse pharmacologique est une approche possible, mais il faut d’abord confirmer que des manipulations pharmacologiques modifient en effet l’activité de la protéine dans ces régions du cerveau.

Nous identifié précédemment une expression plus élevée des gènes codant la phospholipase C (PLC) en les MBs que dans d’autres régions du cerveau et évalués sur le plan pharmacologique l’implication du PLC dans le comportement des abeilles. Dans cette étude, nous avons biochimiquement testé deux agents pharmacologiques et confirmé qu’elles ont baissé d’activité PLC dans la ROM et des autres régions du cerveau. Nous présentons ici une description détaillée de la façon de détecter l’activité PLC dans l’homogénat de cerveau des abeilles. Dans ce système de dosage, homogénats provenant de différentes régions du cerveau sont réagit avec un substrat fluorogène synthétique, et fluorescence provenant des activités PLC est quantifiée et une comparaison entre les régions du cerveau. Nous décrivons également notre évaluation des effets de certains médicaments inhibiteurs sur l’activité PLC en utilisant le même système. Bien que ce système est probablement affectée par les autres composés endogènes fluorescence et/ou l’absorption des éléments d’analyse et des tissus, la mesure de l’activité PLC à l’aide de ce système est plus sûr et plus facile que celui utilisant l’analyse traditionnelle, qui nécessite des substrats. La procédure simple et manipulations permettent d’examiner l’activité PLC dans le cerveau et d’autres tissus des abeilles en participant à différentes tâches sociales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’abeille européenne (Apis mellifera L.) est un insecte eusocial, et les abeilles femelles Voir la reproduction de caste-dépendante et fonction de l’âge de division du travail. Par exemple, dans la caste stérile des abeilles dénommé « travailleurs », des individus plus jeunes nourrissent les couvées tandis que les plus âgés fourrage de nectar et pollen à l’extérieur de la ruche1. Apprentissage et la mémoire capacité est extrêmement importante dans la vie de l’abeille, parce que les butineuses doivent à plusieurs reprises, aller et venir entre les sources de nourriture et de leur nid et puis communiquer les emplacements des bonnes sources alimentaires à leurs congénères par le biais de danse communication1. Des études antérieures ont démontré que le MB, un centre du cerveau plus élevé chez les insectes, est impliqué dans la capacité d’apprentissage et la mémoire des abeilles2,3,4. Expression différentielle des gènes et des protéines ont été identifiées dans les différentes régions du cerveau de l’abeille5,6,7,8,9,10 ,11, ce qui suggère qu’elles sont liées aux fonctions uniques de chaque région du cerveau. Bien que l’inhibition pharmacologique ou l’activation d’une protéine d’intérêt est une approche très utilisée pour révéler la fonction de la protéine à l’abeille comportement12,13,14, on ne sait pas si tous les médicaments ont des effets fonctionnels dans différentes régions du cerveau de l’abeille. La validation des fonctions de ces drogues renforcera les conclusions dans les études de pharmacologie comportementale.

Ici, nous nous concentrons sur PLC, l’un des enzymes impliqués dans la cognition de souris15,16,17,18. PLC déclencheurs calcium signalisation par dégradants phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) dans l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3) et diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP3 ouvre IP3 récepteurs sur le réticulum endoplasmique (re), aboutissant à la libération des ions de calcium de l’ER. Le calcium libéré active fois calcium/calmoduline-dépendante de protéine-kinase II (CaMKII) avec la calmoduline et la protéine kinase C (PKC) en présence de DAG. Les deux protéines kinases sont impliqués dans l’apprentissage et la mémoire22,23, compatibles avec l’implication de PLC dans ce processus. Automates programmables sont catégorisés en sous-types, y compris la PLCβ, PLCγ et PLCε, basée sur leurs structures20. Chaque sous-type PLC intervient dans un contexte différent de20, et des gènes codant ces sous-types sont exprimés différentiellement dans différents tissus. Nous avons démontré précédemment qu’abeilles MBs expriment des gènes codant pour des sous-types PLCβ et PLCε à des niveaux plus élevés que le reste des régions cérébrales24, et que deux inhibiteurs de la pan-PLC (édelfosine et néomycine sulfate [néomycine]) diminuent l’activité PLC dans différentes régions du cerveau et, en effet, affecter la capacité d’apprentissage et la mémoire des abeilles24.

Traditionnellement, l’activité enzymatique de PLC a été mesurée selon radiomarquées PIP225, qui nécessite des installations, l’équipement et une formation appropriée. Récemment, un substrat fluorogène synthétique de PLC a été établie26, rendant facile évaluer l’activité PLC en laboratoire standard. Nous présentons ici un protocole détaillé pour détecter l’activité PLC dans différentes régions du cerveau de l’abeille en utilisant le substrat fluorogène et ensuite tester les effets inhibiteurs de l’édelfosine et la néomycine sur PLC dans ces tissus. Parce que le protocole nécessite des manipulations de base seulement, elle peut être applicable aux études de l’activité PLC dans d’autres tissus ou zones du cerveau chez les abeilles affectées à des tâches sociales différentes.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. prise d’alimentation des abeilles

  1. Acheter des colonies d’abeilles chez un distributeur local.
  2. À l’aide d’un filet à insectes, attraper les abeilles ensileuses qui retournent à la ruche avec des sacs de pollen sur leurs pattes. Transférer les abeilles dans un tube conique en plastique standard de 50 mL et le capuchon du tube (Figure 1). Mettre le tuyau sur la glace pour anesthésier les abeilles.
    NOTE : Porter les vestes désignés pour l’apiculture éviter les piqûres d’abeilles. Soins infirmiers abeilles peuvent également être collectées selon l’expérience. Attraper les abeilles de l’infirmière, observer le comportement de l’abeille sur le peigne de cire et intercepter les abeilles infirmière, qui pousser leurs têtes dans des cellules de couvain pour nourrir les larves, par l’aile ou le thorax à l’aide de la pince à épiler. Ensuite, placez les abeilles dans un tube en plastique de 50 mL, bouchon du tube et mettez-le sur la glace, comme mentionné à l’étape 1.2.
  3. Capturer les 12 butineuses au hasard.
    Remarque : Ce protocole utilise deux abeilles par lot, résultant en six lots. Plusieurs abeilles peuvent être capturés dans un tube, et le nombre d’abeilles dans un tube unique n’est pas important, comme les abeilles dans chaque lot sont conjuguent plus tard (Voir l’étape 3.1.1). Conserver le cool tube en été, car la température élevée dans le tube blesse les abeilles.

2. dissection du cerveau de l’abeille

  1. En laboratoire, placer le tube de 50 mL sur glace pendant au moins 30 min6 à anesthésier les abeilles.
  2. Pour préparer la phase de dissection, pliez un morceau de cire dentaire en deux (la taille est environ 3,5 x 7,5 cm) et l’introduire dans un plat en plastique (60 x 15 mm).
    Remarque : La cire pliée maintient fermement les broches de l’insectes.
  3. Sous un microscope binoculaire, séparer la tête de l’abeille de son corps avec des pincettes et fixez-le sur la cire dentaire en insérant les broches de l’insectes à la base de chaque antenne de tenir l’extrémité antérieure de la tête en position vers le haut (Figure 2A).
    Remarque : Laver les pinces avant utilisation, à l’aide de l’éthanol ou l’eau stérilisée.
  4. Verser suffisamment de solution saline (0,13 mol/L de NaCl, 5 mmol/L de KCl et 1 mmol/L CaCl2-2 H2O) sur la tête pour le couvrir. Percer la tête avec les chevilles si la tête de la flotte dans la solution. Utilisez une solution saline glacée, si nécessaire.
    Remarque : Toutefois, ce protocole fonctionne sans le sérum physiologique froid.
  5. Retirer les antennes à l’aide de la pince à épiler (Figure 2B).
  6. Faites une coupe horizontale près les bases des antennes et longitudinalement à la frontière des yeux composés, à l’aide d’un scalpel. Ensuite, faites une coupe horizontale en haut de la tête. Retirer la cuticule pour ouvrir une fenêtre sur le cerveau (Figure 2C).
    Remarque : Si nécessaire, laver le scalpel avec l’éthanol ou l’eau stérilisée avant utilisation.
  7. Retirez les rétines des ocelles et les trachées sur la surface antérieure du cerveau, à l’aide de la pince à épiler (Figure 2D).
  8. Développez la coupe à la frontière des yeux composés, sur le dos et sur le ventre, en utilisant le scalpel (Figure 2E). Ensuite, enlever le tissu conjonctif entre la cuticule des yeux composés et des rétines en insérant les pinces directement sous la cuticule de l’oeil (Figure 2F).
  9. Jeter la cuticule des yeux composés. Prenez l’extrémité dorsale des rétines des yeux composés avec des pincettes et déplacer les pinces en direction ventrale à décoller avec précaution les rétines (Figure 2G).
  10. Retirez soigneusement les trachées restantes sur la surface antérieure du cerveau, à l’aide de la pince à épiler (Figure 2H).
  11. Couper le tissu conjonctif entre le cerveau et dans les tissus, à l’aide de la pince à épiler et disséquer le cerveau de la capsule céphalique (Figure 2H).
  12. Décollez les trachées sur la surface postérieure du cerveau, à l’aide de la pince à épiler (Figure 2j’ai).
  13. À l’aide d’un scalpel, couper la connexion entre la SBM et autres régions du cerveau à côté les lobes verticaux, qui font partie de la SBM (Figure 2J).
  14. Place les MBs disséqués et autres tissus cérébraux dans des tubes de 1,5 mL et rapidement congeler avec neige carbonique ou l’azote liquide (Figure 2K). Conserver les tissus congelés à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
    NOTE : Gérer l’azote liquide avec les gants désignés et la ventilation pour éviter l’étouffement et brûlure froide. La glace sèche doit également être manipulée avec soin avec des gants. Le protocole peut être suspendu ici. La dissection et l’entreposage du cerveau tissus devraient être effectués une abeille à la fois pour éviter la dégradation des protéines.

3. préparation des homogénats de cerveau

  1. Ajouter 10 µL de tampon homogénéisation comprenant 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L de KCl et 1,0 mmol/L CaCl2 à la gelée tissu cérébral et homogénéiser les tissus dans le tube de 1,5 mL par pression manuelle avec un pilon en plastique. Caresser le tissu au moins 200 x.
    Remarque : Effectuez les manipulations décrites à l’article 3 sur la glace. Utilisez un pilon raccord droit dans le tube à défoncer suffisamment les tissus, qui flottent facilement dans la mémoire tampon d’homogénéisation.
    1. Transférer la solution de tissu homogénéisé dans le tissu suivant dans le lot et homogénéiser le tissu de la même manière.
      Remarque : Les abeilles dans chaque lot sont associés à cette étape. Ce protocole utilise six lots.
  2. Ajouter 30 µL de tampon de l’homogénéisation.
  3. Centrifuger l’échantillon homogénéisé tissus pendant 10 min à environ 900 x g27 et 4 ° C.
  4. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL et il centrifuger à nouveau pendant 20 min à environ 9 500 x g27 et 4 ° C.
  5. Placer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Conserver l’homogénat à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
  6. Déterminer la concentration de la protéine bicinchoninic acide (BCA) essai sur.
    1. Diluer 2,5 µL de l’homogénat avec 17,5 µL d’eau stérilisée (donc diluer l’homogénat huit fois) et d’utiliser tous l’homogénat dilué.
      NOTE : L’homogénat d’échantillonnage à l’aide d’une micropipette doit être effectuée avec soin en raison de sa haute viscosité.
    2. Effectuer le test BCA à l’aide de 0, 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 et 2,0 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) dans 20 µL comme normes.
      Remarque : Modification l’échelle de l’essai BCA comme nécessaire, fondée sur le volume de l’homogénat et échantillons standards. Le protocole peut être suspendu ici.

4. PLC réaction dans des homogénats de cerveau

  1. Préparer la solution de la fluorogène substrat WH-1526 dissous dans l’eau stérilisée à 50 µmol/L et le stocker à-80 ° C.
    NOTE : Couvrir les solutions contenant le substrat d’aluminium pour éviter la décoloration.
  2. Préparer le prémélange de réaction dans le volume requis pour atteindre la composition suivante à 10 µL du mélange réactionnel : 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L de KCl, 1,0 mmol/L de CaCl2, 2,0 mmol/L le dithiothréitol, 50 mg/L, BSA et 12,5 µmol/L WH-15.
  3. Diluer l’homogénat avec le tampon de l’homogénéisation, le cas échéant.
  4. Mélanger le prémélange de réaction et l’homogénat contenant 1,3 µg de protéines dans un tube de réaction en chaîne (PCR) polymérase afin d’obtenir un volume final de 10 µL du mélange réactionnel.
    1. Préparer deux types de mélanges de contrôle pour l’analyse statistique : mettre l’homogénat mais pas WH-15 en mélange (mélange de contrôle 1) et vice versa (mélange de contrôle 2).
      NOTE : Préparer les mélanges réactionnels et contrôle des mélanges sur la glace pour éviter la dégradation des protéines et la réaction du PLC. Contrôle des mélanges 1 et 2 sont utilisés pour détecter la fluorescence de l’homogénat et le substrat libre, respectivement.
  5. Rincer le tube et il incuber dans un thermocycleur pendant 30 min à 25 ° C.
  6. Arrêter la réaction en ajoutant 2 µL de 25bis de l’éthylène glycol mmol/L (β-aminoethylether)-N, N, N', N'-tétraacétique.
    NOTE : Les quantités de protéine appropriée et des temps de réaction varient selon les expériences. Ainsi, pour optimiser les conditions de réaction, il peut être nécessaire de répéter les procédures décrites dans les étapes 4.1-5.3 dans les expériences préliminaires en changeant le temps protéine montant et d’incubation jusqu'à ce que la fluorescence augmente linéairement. Pour référence, lorsque l’homogénat provenant des autres régions du cerveau est utilisé, la réaction fonctionne habituellement linéairement avec 1,3 µg ou moins de protéines dans les 30 min, mais la linéarité diminue avec au moins 2,7 µg de protéines ou avec une durée d’incubation de 90 min ou lo nger.

5. détection de la Fluorescence provenant des activités PLC

  1. Centrifuger le mélange réactionnel et mélanges de contrôle pendant 5 min à environ 310 x g28 et transférer 10 µL du liquide surnageant dans différents puits sur une microplaque 384 puits applicable pour la détection par fluorescence.
    Remarque : Pour éviter la décoloration et une contamination par la poussière, couvrir la plaque avec une feuille.
  2. Rincer la microplaque à l’aide d’une centrifugeuse pour la microplaque.
  3. Mettre la plaque dans un lecteur de microplaques et détecter la fluorescence avec une triple technique.
    Nota : Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont 344 nm et 530 nm, respectivement. Le cas échéant (selon le lecteur de microplaque), mélanger les mélanges d’échantillon pendant 5 s avant chaque détection. Le protocole peut être arrêté ici.

6. test de l’Action inhibitrice des Agents pharmacologiques

  1. Préparer les solutions d’édelfosine et la néomycine aux concentrations appropriées et de les stocker jusqu'à l’utilisation : édelfosine à 5,0 mmol/L et -20 ° C ; néomycine à 550 mmol/L et 4 ° C.
  2. Lors de la préparation du prémélange de réaction, tel que décrit à l’étape 4.2., ajouter des inhibiteurs à prémélange pour obtenir les concentrations finales appropriées : édelfosine, 1,0 mmol/L ; néomycine, 0.55 mmol/L.
  3. Ajouter l’homogénat pour les mélanges de prémélange et appropriées de contrôle de réaction comme au point 4.4.
    1. Préparer trois types de mélanges de contrôle : mettre l’homogénat et inhibiteur, mais pas le substrat en mélange de contrôle 1 ; Ajoutez le substrat et inhibiteur mais pas l’homogénat dans le mélange de contrôle 2 ; et de mettre l’inhibiteur, mais pas l’homogénat ou substrat en mélange de contrôle 3.
  4. Effectuer la réaction de PLC et la détection de la fluorescence comme décrit aux étapes 4,5 à 5,3.

7. analyse statistique

  1. Pour la détection de l’activité PLC utilisant les mélanges décrits à l’article 4, calculez la fluorescence obtenue par réaction entre le PLC et le substrat en soustrayant la fluorescence émise de l’homogénat ou substrat libre comme suit.

    FL (activité PLC) = Fl (mélange de réaction) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)}
    ​
    NOTE : Fl (activité PLC), Fl (mélange de réaction), Fl (ctrl 1) et Fl (ctrl 2) désignent bona fide fluorescence provenant d’activités PLC, fluorescence détectée dans le mélange réactionnel et de mélanges de contrôle 1 et 2, respectivement.
    1. Après la mesure de la fluorescence dans les mélanges comme décrit aux points 4.1 à 5,3, calculer Fl (activité PLC) selon l’équation à l’étape 7.1, puis la moyenne Fl (activité PLC) de la triple technique pour chaque homogénat.
    2. En utilisant la moyenne Fl (activité PLC) de la triple technique obtenu à l’étape 7.1.1, calculer à nouveau le Fl moyenne (activité PLC) de réplicats biologiques des MBs et autres régions du cerveau et de comparer les valeurs entre les tissus cérébraux.
  2. Pour l’examen de l’activité PLC en présence d’inhibiteurs en utilisant les mélanges décrits à l’article 6, calculer la fluorescence provenant de la réaction entre l’homogénat, substrat et inhibiteur comme suit.

    FL (activité PLC avec inhibiteur) = Fl (mélange de réaction) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3)

    NOTE : Ici, Fl (activité PLC avec inhibiteur) est bona fide fluorescence provenant des activités PLC en présence de l’inhibiteur. FL (mélange de réaction), Fl (ctrl 1), Fl (ctrl 2) et Fl (ctrl 3) sont des signaux de fluorescence détectées dans le mélange réactionnel, mélange de contrôle 1, contrôlent le mélange 2 et contrôle mélange 3, respectivement.
    1. Après la mesure de la fluorescence dans les mélanges comme décrit aux points 6.1 à 6,4, calculer Fl (activité PLC avec inhibiteur) selon l’équation à l’étape 7.2. Ensuite, obtenir la moyenne Fl (activité PLC avec inhibiteur) de la triple technique pour chaque homogénat.
    2. À l’aide de la valeur moyenne calculée à l’étape 7.2.1, calculer la moyenne Fl (activité PLC avec inhibiteur) de réplicats biologiques provenant de chaque tissu cérébral. Comparer le Fl (activité PLC avec inhibiteur) et la Floride (activité PLC) obtenu à l’étape 7.1.2 dans chaque tissu de cerveau.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Concentrations de protéine dans des homogénats de cerveau :
Nous avons préparé des homogénats utilisant des abeilles de l’ensileuse. Les concentrations de protéine calculé dans des homogénats de l’originales sont indiquées à la Figure 3. Les concentrations de protéine approximative dans l’homogénat original étaient comme suit : 1,5 mg/mL dans les MBs et 2,3 mg/mL, dans d’autres régions du cerveau. Nous avons utilisé deux abeilles par lot e...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’examen biochimique de l’activité de la protéine est profondément important pour comprendre la signalisation moléculaire dans le cerveau, parce que l’activité d’une enzyme est affectée par diverses molécules, comme substrats et inhibiteurs et peut, ainsi, passer le long d’avec comportement animal (p. ex., apprentissage et mémoire)5. Dans les études de l’abeille, enzymes comme dépendante de l’AMP cyclique protéine kinase A, protéine kinase dépendante du GMP cyclique, PKC, CaMKII phosphory...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figure 4 b - 4D a été modifiée de Suenami et al. 24 avec la permission de biologie ouvert. Les auteurs sont reconnaissants à l’éditeur pour l’autorisation. Ce travail a été soutenu par le Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) à Shota Suenami et Ryo Miyazaki.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227Le kit de réactifs pour la mesure de la concentration en protéines
Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampoules 2mg/mLThermoFisher Scientific23209Les échantillons standard utilisés dans le dosage BCA Cire
de paraffineGC13B1X00155000141Cire dentaire utilisée comme étape de dissection
Épingle à insectesShigaN° 0Acier inoxydable, tête solide
PLCglowKXT BioKCH-0001Un substrat fluorogénique de
PLC microplaque à 384 puitsCorning4511Plaque à faible volume, à fond rond de couleur noire
Lecteur de microplaques Gemini EMDispositifs
EdelfosineSanta Cruz Biotechnologysc-201021inhibiteur
pan-PLCSulfate de néomycineSanta Cruz Biotechnologysc-3573inhibiteur pan-PLC
moléculaires

Références

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