Modèle murin d’escarres après une lésion de la moelle épinière

Résumé

Nous décrivons ici une méthode simple pour provoquer des escarres peau cliniquement pertinente (PUs) dans un modèle murin de la moelle épinière (SCI). Ce modèle peut servir dans des études précliniques à l’écran pour les thérapies différentes pour PUs de guérison chez les patients de la SCI.

Résumé

Escarres (PUs) sont communs débilitante des complications des traumatismes de la moelle épinière (SCI) et ont tendance à se produire dans les tissus mous autour des protubérances osseuses. Il, cependant, connaît peu de choses sur l’impact de la SCI sur la guérison de blessure de la peau dans le contexte des modèles animaux dans les paramètres expérimentaux contrôlés. Dans cette étude, un modèle de souris simple, non invasif, reproductible et cliniquement pertinente de PUs dans le cadre de la SCI complet est présenté. Des souris mâles adultes (Balb/c, âgés de 10 semaines) ont été rasées et épilées. Post-épilation (24h), souris ont été soumises à une laminectomie suivie de transection de moelle épinière complète (T9-T10 vertèbres). Immédiatement après, un pli de peau sur le dos des souris a été levé et pris en sandwich entre deux disques magnétiques qui s’est tenues en place avant 12 h, créant ainsi une zone ischémique qui se transformèrent en une unité centrale au cours des jours suivants. Les zones blessés a démontré un oedème tissulaire et disparition épidermique par application d’un aimant après jour 3. PUs spontanément développé et guéri. La guérison était, cependant, comparée plus lente chez les souris de la SCI pour contrôler la souris non-SCI lorsque la plaie a été créée sous le niveau du SCI. par contre, aucune différence dans la guérison a été observée entre la SCI et le contrôle des souris non-SCI lorsque la plaie a été créée au-dessus du niveau de la SCI. Ce modèle est un outil potentiellement utile pour étudier la dynamique du développement d’unité centrale de peau et la guérison après SCI, aussi bien quant à tester des approches thérapeutiques qui peuvent aider à guérir les blessures.

Introduction

Escarres (PUs) sont les principales complications secondaires de traumatique SCI¹. PUs sont des lésions localisées de la peau ou des tissus sous-jacents qui se produisent généralement sur les proéminences osseuses importantes où le poids corporel est concentré pendant que le patient est assis ou couché¹. La peau, la graisse et le muscle sont exposés à cette pression constante qui mène au développement d’ischémie localisée, une inflammation des tissus, des dommages mécaniques et nécrose^2,3.

Le développement de PUs est affecté par plusieurs facteurs locaux, y compris l’ampleur de la pression et de cisaillement, durée, humidité de la peau et la température, longévité de blessure et hygiène peau générales de chargement. Il y a aussi des facteurs systémiques qui jouent un rôle, tels que l’état physique général, OS et morphologie des tissus musculaires et force⁴, âge du patient, mesures hématologiques, sexe et des facteurs socio-économiques même, y compris l’état matrimonial, l’éducation, et revenu^4,5.

La prévention et le traitement de PUs restent des défis importants chez les patients de la SCI. SCI patients développent PUs en ~ 30-40 % des cas, avec un taux de répétition de 60 à 85 %, probablement en raison de la faiblesse du tissu cicatriciel et le manque de sensation protectrice¹. Ainsi, PUs aboutit souvent à la nouvelle hospitalisation de patients SCI et dans l’ensemble constituent un fardeau financier important (80 % vs SCI uniquement) pour le système de santé^{5,6,7,8,9 , 10}.

Au meilleur de notre connaissance, il n’y a eu aucune étude dans les paramètres expérimentaux contrôlés d’étudier l’impact de la SCI sur le processus de guérison de PU à cause du manque de modèles animaux appropriés. Est décrit ici, un modèle de souris reproductible et cliniquement pertinente de PU dans la peau. Ce modèle peut être utilisé pour étudier la dynamique de l’apparition d’unité centrale et la guérison ultérieure, ainsi que de tester des approches thérapeutiques potentiels pour empêcher d’unité centrale ou améliorer d’unité centrale de guérison dans le cadre de la SCI.

Protocole

Tous les animaux de manutention et les interventions chirurgicales ont été effectuées conformément à un protocole approuvé par le Comité de l’emploi et de Rutgers University Institutional Animal Care. Souris ont été nourries en régime normal et eau ad libitum.

1. élaboration d’Instruments chirurgicaux et Non chirurgicaux

1. Stérilisation des instruments chirurgicaux et non chirurgicaux dans un autoclave.
2. Nettoyer la table d’opération chirurgicale avec 70 % d’éthanol et de réchauffer un coussin chauffant à 37 ° C.
3. Placez le coussin chauffant sur la table d’opération et couvrez-la avec draps chirurgicaux stériles.
   Remarque : Dans toutes les procédures de survie, la technique « No Touch » est utilisée ici pour maintenir la stérilité.

2. préparation des animaux et en effectuant la laminectomie vertébrale T9-T10

1. Se procurer chez la souris adulte (Balb/c) mâle de 10 semaines. Induire l’anesthésie chez chaque animal à l’aide d’un début d’inhalateur avec 5 % isoflurane et puis ramené à 2-3 % pour maintenir la sédation pour le reste des procédures.
2. Confirmer l’anesthésie complète en ne suscitant aucune réponse à une stimulation de nociception queue/patte pincée induite.
3. Se raser les cheveux sur le dos (tête à la queue) avec une tondeuse électrique et appliquez ensuite la crème dépilatoire (3 min) pour enlever les poils restants. Enfin, laver le dos avec gommage eau/humide en cours d’exécution et retourner les animaux de leurs cages.
   Remarque : Cela est nécessaire pour éviter toute irritation supplémentaire pour la peau et la contamination chimique au moment de la blessure de la peau
4. Le lendemain, appliquer la pommade ophtalmique pour les cornées pour protéger les yeux de l’évaporation au cours de l’intervention chirurgicale et ensuite, frotter la peau avec 3 préparations alternatives de betadine scrub et 70 % d’éthanol.
5. Avec un scalpel, effectuer une incision de la peau (~1.0-1.5 cm) le long de la ligne médiane sur le dos au niveau des vertèbres T8-T12.
   Remarque : Au niveau des vertèbres est identifié en retour comptant la vertèbre de T13 utilisant l’emplacement des côtes flottantes qui correspondent au T13 vertèbre^11,12.
6. Désactivez le tissu adipeux sous-cutané pour obtenir l’accès aux muscles paravertébraux et ensuite disséquer eux lentement pour exposer les apophyses épineuses et les limbes des deux côtés.
   Remarque : Faire cette procédure très soigneusement pour éviter un saignement excessif ou toute blessure à la moelle épinière, à ce stade.
7. Effectuer une laminectomie pour exposer la moelle épinière (T9-T10 vertèbres) en décollant doucement la lame la colonne vertébrale à l’aide de pinces à microdissecting.
   Remarque : Effectuer la laminectomie afin qu’un excès de la moelle épinière est exposé pour faciliter la création de la lésion. Dans le groupe témoin, seulement la laminectomie est effectuée.

3. effectuer la T9-T10 complète de la moelle épinière

1. À l’aide de pinces, fixer la colonne vertébrale à T8 et ascenseur vers le haut à exagérer la courbure de la colonne vertébrale.
2. À l’aide des ciseaux, section de la moelle épinière entre les vertèbres T9 et T10 complètement vers le plancher du canal vertébral, afin d’assurer une transection complète.
3. Après avoir observé la transection complète sous un microscope chirurgical, appliquer un morceau de graisse sous-cutanée sur le site de laminectomie pour fournir une protection supplémentaire à la moelle épinière avant la fermeture du site opératoire.
4. Enfin, fermer la plaie et suturer les muscles paravertébraux, fascia superficiel, à l’aide de la suture continue et puis fermez la peau à l’aide d' agrafes de suture¹².
5. Post-SCI, observer les selles le lendemain ; Toutefois, gérer la vessie en évacuation manuelle de la vessie.
   Remarque : L’échelle de souris Basso (BMS) peut être utilisé pour surveiller la progression de la récupération fonctionnelle du membre postérieur post-SCI au jour 2 et puis hebdomadaire, voir supplémentaire Figure 1^11,12,13.

4. l’induction de l’escarre de peau après complète SCI

1. Immédiatement après la chirurgie de la SCI, frottez le dos de l’animal avec betadine et 70 % d’alcool.
2. Pour une unité centrale sous le site de la SCI, injecté sous la peau du dos près de l’OS sacrum, un très faible volume (10 µL) de solution de bupivacaïne 0,125 % à l’aide d’une aiguille 25 G à endroits équidistants ~0.5-1.0 cm en dehors, dans une ellipse autour du site d’application aimant.
   Remarque : Pour une unité centrale au-dessus du site de la SCI, injecter la peau du dos près de la région cervicale.
3. Soulevez un pli de peau sur le dos de la souris doucement et de ce "sandwich" entre 2 disques magnétiques (5 × 12 mm de diamètre, 2,4 g chacun, force magnétique 3800 G) (Figure 1). ^{11 , 12}
4. Immédiatement après que l’application d’un aimant, retour animaux dans des cages unique placé sur un coussin chauffant jusqu'à ce que la pleine conscience est retrouvé (Figure 1).
5. Après 12 h d’application d’un aimant, légèrement anesthésier l’animal à l’isoflurane et supprimer les aimants. Prendre une photo des sites de plaie, d’enregistrer la comparution initiale de l’unité centrale (jour heure 0 point). Couvrir la plaie avec le film de pansement transparent (3m) pour éviter la contamination ou séchage.

5. post-opératoire soins aux animaux, l’euthanasie et prélèvement tissulaire pour histologie

1. Immédiatement après la chirurgie, injecter l’animal avec 1 mL de sérum physiologique 0,9 % par voie sous-cutanée pour l’hydratation.
2. Injecter par voie sous-cutanée buprénorphine-SR (1 mg/kg) pour l’analgésie, immédiatement.
3. Injecter par voie sous-cutanée animaux quotidienne meloxicam (1 mg/kg) et céfazoline (50 mg/kg pendant 3 à 7 jours) et deux fois quotidiennes évacuation de la vessie manuelle.
4. Placer les animaux dans des cages simples et fournir de la nourriture accessible et eau ad libitum. Souris avec SCI complet peuvent marcher à l’aide de leurs pattes avant et approcher les aliments et l’eau sans aucune difficulté.
5. Retirer les pinces chirurgicales 7 jours après la chirurgie de la SCI.
6. Aux points de temps désirée après SCI et blessures de la peau, euthanasier les animaux par l’inhalation de CO₂ (3-5 min), conformément aux directives sur l’euthanasie¹⁴AVMA.
7. Recueillir des échantillons de peau blessée, difficulté à 10 % de formol pendant 24 h et ensuite stocker dans l’éthanol à 70 % à 4 ° C jusqu’au sectionnement.
8. Pour traiter les tissus, incorporer à la paraffine et générer des sections minces (5 µm) sur un microtome. Coloration à l’hématoxyline et éosine (H & E) pour visualiser la morphologie tissulaire (Figure 3). Pour les études d’immunohistochimie (Figure 4), tache sections à l’aide d’anticorps appropriés pour Ki67 (prolifération), CD31 (angiogenèse) et l’actine muscle lisse-alpha (α-SMA) tel que décrit dans Kumar et al.,¹²
   Remarque : Logiciel d’analyse image permet de quantifier l’image fonctionnalités¹².

Résultats

Ce protocole crée une unité centrale dans le cadre du SCI. complet brièvement (tel qu’illustré à la Figure 1), toutes les souris avec ou sans SCI complet toléré les aimants très bien, qui sont restés dans leur position d’origine pour le plein 12 h (Figures 1C, 1D, 1f, 1 h ). Toutes les souris mis au point deux plaies circulaires, séparés par un pont de tissu normal (Figure 1e, 1i, 1 g). La réponse initiale de ble...

Discussion

Le protocole dans la présente étude décrit un nouveau modèle expérimental de PUs d’évaluer l’impact de la SCI sur la cicatrisation des plaies. La peau PUs ont été induits via une application de 12 h de deux aimants de disque diamètre 12 mm sur un repli de peau dorsale, soit définir au-dessus ou au-dessous du site de la SCI. Les données montrent que la SCI ralentit la peau la cicatrisation chez les souris. Ce qui est important, ces observations ont été faites spécifiquement dans les blessures de la peau sous le niveau de ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aimants Master	Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO	CD14C	3800 G Force magnétique
Souris régime standard	PMI Nutrition International, Brentwood, MO		Standard Food Pellet
Isoflurane	HENRY SCHEIN Santé animale  ;	SKU 029405
ImageJ	NIH, Bethesda, MD		Logiciel d’analyse d’images
BETADINE Surgical Scrub HENRY	SCHEIN Santé animale  ;
Pommade ophtalmique  ;	HENRY SCHEIN Santé animale  ;	SKU 008897
NAIR-Lotion Décapante	Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ
ELOXIJECT (méloxicam) Injection	HENRY SCHEIN Santé animale  ;	UGS 049755	5 mg/mL, 10 mL
céfazoline sodique	HENRY SCHEIN Santé animale	UGS 054846	1 g, bouteille de 10 mL
Buprénorphine-SR  ;	ZooPharm, Windsor, CO	-	-
0,9 % Chlorure de sodium injectable USP	BRAUN, Irvine, CA	S8004-5384
10 % Neutre Buffered Formalin  ;	VWR, Radnor, PA	16004-130
BALB/C Souris mâle	Charles River Lab., Wilmington, MA	28
Applicateur stérile à pointe de coton	Puritan, Guilford, ME	SKU# : 25-806
Michel Suture	Clips Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA	12040-01
Suture chirurgicale, U.S.P.	Henry Schein Santé animale  ;	Référence 101-2636

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