Article de méthode

Ingénierie de tissu d’épithélium pigmentaire rétinien Transplantation-convient dérivées de cellules souches embryonnaires humaines

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DOI :

10.3791/58216

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6 septembre 2018

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1U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), 2U861, I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Université Evry Val-d'Essonne (UEVE), 3I-Stem, Association Française contre les Myopathies (AFM), Centre pour L’Etude des Cellules Souches (CECS), 4Banque de tissus humain, Hôpital Saint Louis, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), 5Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, F-75012

Dans cet article

Résumé

Les auteurs décrivent une méthode pour un tissu rétinien composé de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivés des cellules souches pluripotentes humaines cultivées sur le dessus des membranes amniotiques humaines et de sa préparation pour les greffes dans des modèles animaux de l’ingénieur.

Résumé

Plusieurs pathologies de le œil sur la fonctionnalité et/ou la survie de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE). Il s’agit de certaines formes de rétinite pigmentaire (RP) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). La thérapie cellulaire est l’un des plus prometteurs stratégies thérapeutiques proposées pour soigner ces maladies, avec déjà encourageant les résultats préliminaires chez l’humain. Toutefois, la méthode de préparation de la prothèse a une incidence importante sur ses résultats fonctionnels in vivo. En effet, les cellules RPE greffés comme une suspension cellulaire sont moins fonctionnels que les mêmes cellules transplantées comme un tissu rétinien. Ici, nous décrivons une méthode simple et reproductible pour ingénieur RPE tissu et sa préparation pour une implantation in vivo . Les cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines RPE sont ensemencées sur un support biologique, la membrane amniotique humain (jambon). Par rapport aux échafaudages artificiels, ce support a l’avantage d’avoir une membrane basale qui se trouve à proximité de la membrane de Bruch où des cellules RPE endogènes sont attachés. Cependant, sa manipulation n’est pas facile, et nous avons mis au point plusieurs stratégies pour sa mise en culture appropriée et préparation à la greffe in vivo.

Introduction

RPE est crucial pour la survie et l’homéostasie des photorécepteurs avec lequel il est étroitement associé à1. Plusieurs conditions pathologiques modifient ses fonctionnalités et/ou de la survie, y compris les RP et AMD.

RP est un groupe de mutations de monogéniques héréditaires qui affectent les fonctions des photorécepteurs ou cellules RPE ou les deux2,3. On estime que les mutations qui affectent spécifiquement le RPE cellules représentent 5 % de RP2. La DMLA est une autre condition où la couche RPE est altérée, perte de la vision en fin de compte à central principal. AMD est causée par les interactions complexes entre des facteurs génétiques et environnementaux et affecte les personnes âgées4,5,6. Selon les projections, AMD sera un sujet de préoccupation pour les patients 196 millions dans le monde en 2020,7. Pour ces troubles, aucun remède efficace n’existe, et l’une des stratégies proposées est la transplantation des nouvelles cellules RPE afin de compenser les morts/non-fonctionnel préexistante RPE cellules8.

Le mode de formulation du produit final doivent être greffés est essentiel pour assurer les meilleurs résultats fonctionnels. Les cellules RPE injectés sous forme de suspension cellulaire, en dépit d’être une méthode simple et directe de la livraison, soulèvent des préoccupations au sujet de leur survie, l’intégration et la fonctionnalité9,10,11,12 , 13. les scientifiques développent plus des formules complexes pour livrer engineered tissu rétinien9,13,14,15,16. Dans ce contexte, nous avons développé une méthode originale pour produire in vitro RPE des tissus qui pourraient être utilisés pour transplantation9.

Les banques de cellules RPE dérivés de cellules souches embryonnaires humaines (ES) sont utilisés dans le présent protocole. Cependant, alternative RPE de cellules provenant de sources différentes cellules (cellules souches pluripotentes induites par l’homme, les cellules primaires de RPE, etc.), les banques et différenciées avec une méthode différente sont également appropriés pour ce protocole. Il comprend la différenciation dirigée de protocoles à l’aide de cytokines et/ou petites molécules17,18,19,20,21,22.

Pour être transplantés, l’ingénierie tissulaire doit être préparé sur un échafaud. En quelques années, les échafaudages différents reposent sur un polymère ou sur une matrice d’origine biologique13,23,24. Ici, le substrat biologique utilisé est le jambon, mais les autres substrats, comme les membranes dénudées de Bruch, pourraient être mises en œuvre. La méthode décrite ici a l’avantage d’utiliser un échafaudage biologique qui concerne davantage l’environnement natif de RPE.

ES cellules dérivées RPE des cellules humaines sont cultivées pendant au moins 4 semaines afin d’être entièrement organisé comme une monocouche de pavés. À ce stade, l’épithélium obtenu est fonctionnel et polarisé9. Enfin, comme ce tissu rides facilement, il est enchâssé dans une fine couche d’un transporteur d’hydrogel pour lui donner plus de rigidité et d’élasticité et de le protéger pendant la procédure d’injection. Ce produit est ensuite stocké à 4 ° C jusqu’au greffage.

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Protocole

Tous les matériaux humains utilisés dans le présent protocole ont été utilisés conformément à la réglementation de l’Union européenne. La lignée de cellules ES humaine utilisée dans cette étude a été dérivée d’un embryon unique. Le couple qui avait fait don de l’embryon a été pleinement informé et ont donné leur consentement pour un don anonyme. Une lignée de cellules ES humaine cliniques de qualité a été dérivée de cet embryon, s’est inclinée, qualifiée et correctement documentée par les cellules Roslin (UK). Jambons ont été achetés dans des conditions stériles pendant une césarienne chez les mères qui ont signé un consentement éclairé pour le don de placenta selon les directives de l’hôpital (APHP, Hôpital Saint Louis).

1. préparation des milieux de Culture et réactifs

  1. Préparation de la milieu de culture cellulaire RPE
    1. Pour préparer le milieu de culture cellulaire RPE, ajouter le substitut de sérum de 4 % (20 mL pour un volume final de 500 mL) et 1 000 x dilué 2-mercaptoéthanol (500 µL pour un volume final de 500 mL) solution à 1 % Eagle′s milieu essentiel minimum (MEM) des acides aminés non essentiels (5 mL pour une finale volume de 500 mL) de glycémie élevé moyen (DMEM) de l’aigle modifié de Dulbecco (475 mL pour un volume final de 500 mL).
  2. Préparation du milieu transport/conservation
    1. Pour préparer le milieu de transport/conservation, ajouter 1 % de pénicilline-streptomycine (5 mL pour un volume final de 500 mL) de CO2-média indépendant (495 mL pour un volume final de 500 mL) et le conserver à 4 ° C.
  3. Remise en suspension de l’enzyme de la thermolysine
    1. Préparation d’une solution mère de la thermolysine
      1. Pour préparer une solution de la thermolysine, décongeler la thermolysine poudre, qui a été stockée à-20 ° C, température ambiante.
      2. Que l’activité enzymatique peut être variable d’un lot à l’autre, calculer cette activité basée sur le certificat d’analyse fournie avec la poudre de la thermolysine du lot à utiliser. Diviser le « activité protéase neutre calculé = ANPC » (indiqué dans le certificat d’analyse) par 181 (qui est le poids moléculaire de tyrosine). Le résultat obtenu correspond à l’activité enzymatique totale de la poudre de la thermolysine fourni (U/flacon).
      3. Préparer une solution à 200 U/mL en ajoutant du volume d’eau correspondant à l’activité enzymatique totale (U/flacon) divisée par 200 (U/mL).
      4. Dissoudre l’enzyme en pipettant également, l’eau qui a été ajoutée en haut et en bas. Vortex la solution pour 30 s et vérifier si la poudre a été complètement suspendue. Pipetage plus peut-être être nécessaire pour une dissolution complète.
      5. Partie aliquote de la solution mère et conserver à-20 ° C.
    2. Préparation d’une solution de travail de la thermolysine
      NOTE : La thermolysine solution doit être établie le jour du traitement jambon.
      1. Décongeler les aliquotes de stock de la thermolysine 200 U/ml à-20 ° C. Diluer la solution mère de x 200 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) afin d’obtenir une activité enzymatique finale de 1 U/mL. Préparation de 40 mL pour traiter les taches de jambon 1 – 4.
      2. Filtrer la solution thermolysine grâce à un avant filtre 0,2 µm.
  4. Remise en suspension de gélatine
    1. Préparation de la solution de gélatine 20 % et le bloc
      Remarque : La solution de gélatine 20 % et le bloc peuvent être préparés jusqu'à 1 semaine avant utilisation.
      1. Réchauffer le CO2-média indépendant à 42 ° C au bain-marie pendant 30 min (jusqu'à 1 h). Dans un tube de 50 mL, ajouter 10 g de gélatine à 40 mL de réchauffé CO2-média indépendant et vortex la solution.
      2. Dissoudre la gélatine pendant 30 à 60 min à 42 ° C. Vortex chaque 10 min pour homogénéiser la solution.
      3. Une fois que la solution est homogène, ajouter 4 mL de la solution de gélatine 20 % à quatre récipients de culture de 6 cm. Éviter les bulles. Ajouter un film de paraffine en plastique pour protéger les plats et laissez agir la solution à se solidifier à 4 ° C.
    2. Préparation de la solution de gélatine 8 %
      Remarque : La solution de 8 % de gélatine peut préparer la veille de l’utilisation et stockée à 4 ° C.
      1. Réchauffer le CO2-média indépendant à 42 ° C pendant 30 min (jusqu'à 1 h). Dans un tube de 50 mL, ajoutez 4 g de gélatine à 46 mL de réchauffé CO2-média indépendant et vortex la solution.
      2. Dissoudre la gélatine pendant 30 à 60 min à 42 ° C. Ajouter un film de paraffine en plastique pour protéger le tube et le garder dans un bain-marie à 37 ° C si il doit être utilisé le jour même, ou conserver à 4 ° C si il doit être utilisé plus tard.

2. thermolysine traitement des Membranes amniotiques humaines

  1. Lavage de la membrane amniotique humain
    1. Ont fourni en petits morceaux (environ 30 x 30 mm) fixé à un échafaudage en nylon, soit déjà à 4 ° C dans du PBS ou congelés de jambons. Si fourni congelés, décongeler les membranes à 37 ° C dans un incubateur pendant 30 min.
    2. Lavez les membranes :
      1. Placer 1 – 4 membranes dans un flacon de 250 mL contenant 80 mL de PBS. Utiliser des bouteilles autant que nécessaire.
      2. Agiter chaque bouteille dans un agitateur de plaque à haute vitesse pendant 5 min, puis jetez le PBS. Ajouter 80 mL de PBS et répéter.
  2. Traitement de la thermolysine
    1. Ajouter 40 mL de la solution de travail de la thermolysine (1 U/mL) par bouteille contenant les membranes (1 – 4 membranes par bouteilles ; maximum de 3 bouteilles à la fois).
    2. Agiter les flacons pendant 5 min à 450 tr/min, puis vortex eux pendant 30 s. Répéter 1 x.
    3. Jeter la solution thermolysine et ajouter 80 mL de PBS.
    4. Agiter les flacons pendant 5 min à 450 tr/min. Jeter les PBS et ajouter 80 mL de PBS. Répéter 3 x.

3. fixation des Membranes amniotiques humaines sur un Insert de Culture

  1. Utilisez une pince longue stérile (qui peut atteindre le fond de la bouteille) pour supprimer les jambons un et de transférer chaque jambon dans un plat de culture de 10 cm contenant 10 mL de PBS.
  2. Dans un nouveau 10 cm boîte de Petri contenant 10 mL de PBS, un lieu des membranes avec le nylon face vers le bas. Deux des quatre clips qui sont utilisés pour fixer la membrane au nylon détacher.
  3. Insérez l’anneau plus petit de l’insert de culture entre le nylon et la membrane.
  4. S’assurer que la membrane couvre le plus petit anneau complètement. Couper la deuxième partie de l’insert de culture sur le dessus de la membrane. La membrane basale du jambon est vers le haut à l’intérieur de l’insert de culture. Détachez les deux derniers clips.
  5. Coupé avec des ciseaux stériles, l’excédent de membrane en dehors de l’insert de culture si nécessaire. Avec une pincette, transférer la membrane fixée dans l’insert de culture à une plaque de 12 puits, ajoutez les PBS et stocker la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
  6. Répéter ces opérations (de l’étape 3.2 à 3.5) avec les autres membranes.

4. dégel et l’ensemencement des cellules l’épithélium pigmentaire rétinien sur des Membranes amniotiques humaines

  1. Décongélation des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien
    1. La Banque de cellules RPE est gelée à 1 million de cellules par flacon cryogénique dans l’azote liquide. Décongeler les fioles cryogéniques autant comme l’exige (350 000 cellules sont ensemencées par membrane).
    2. Préparer un tube de 15 mL contenant 3 mL de milieu RPE par flacon cryogénique. Une fois le flacon est décongelé, transférer les cellules dans chaque tube. Répétez cette opération pour les autres flacons.
    3. Homogénéiser (pipette de haut en bas plusieurs fois à remettre en suspension les cellules dans le milieu de la RPE) et prendre 10 µL de la solution de la cellule et le transférer dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 10 µL de bleu trypan. Place 15 µL de cette solution dans une chambre de comptage, puis comptez le nombre de cellules viables (ne pas colorée en bleu) sous un microscope avec un objectif 4 X. Répétez cette opération pour les autres flacons.
    4. En attendant, centrifuger les tubes de 15 mL à 110 x g pendant 5 min. jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules à 700 000 cellules/mL.
  2. Ensemencement des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien dans des membranes amniotiques humaines
    1. Retirez la plaque de 12 puits contenant les membranes de l’incubateur.
    2. Aspirer le PBS. Ajouter 500 µL de la suspension cellulaire établie à l’étape 4.1.4 dans le centre de l’insert de la culture. Ajouter 1 mL de milieu RPE à l’extérieur de l’insert de culture (à l’intérieur du puits). Répétez pour les autres membranes.
    3. Placer la plaque de 12 puits contenant les membranes dans l’incubateur.

5. entretien des Cultures de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien sur des Membranes amniotiques humaines

  1. Renouveler la moyenne 2 x par semaine, généralement le lundi et le vendredi, jusqu'à au moins 30 jours de la culture.
  2. Aspirez le milieu à l’intérieur et à l’extérieur de l’insert de culture pour chaque puits et la renouveler avec un milieu frais (1 mL en dehors de l’insert de culture et 500 µL à l’intérieur). Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.

6. préparation de la correction de l’épithélium pigmentaire rétinien destinés à la Transplantation

NOTE : À partir de 30 jours de la culture, le tissu est prêt pour la transplantation.

  1. Chaud la solution de 8 % de gélatine dans un bain d’eau à 37 ° C pendant 30 min. remplir la chambre interne de la vibratome avec froid CO2-média indépendant (à 4 ° C).
  2. Placez le bloc de gélatine 20 % dans le vibratome.
    1. Prendre la boîte de Petri de 6 cm contenant le bloc de gélatine 20 % dans le réfrigérateur. À l’aide d’un scalpel, découper un bloc de 5 cm x 5 cm. Collez le dessus du bloc au support avec une colle cyanoacrylate ou son équivalent.
    2. Placez une lame neuve dans le vibratome.
    3. Ajuster le niveau du bloc jusqu'à ce qu’il soit au même niveau de la lame de rasoir.
    4. Remplir la baignoire autour de la prise en charge de frais CO2-média indépendant à 4 ° C. Couper le bloc avec le vibratome avec une vitesse moyenne jusqu'à ce que le bloc est coupé uniformément, conduisant à une surface lisse. Définir la position 0.
    5. Aspirer le milieu autour du bloc de gélatine jusqu'à ce qu’il est complètement sec et ensuite prendre la plaque de culture de 12 puits contenant des tissus de l’incubateur à 37 ° C.
    6. À l’aide de pinces, ouvrir avec précaution l’insert de culture sur le dessus du bloc de gélatine. Couper avec des ciseaux, toutes les parties de la membrane qui ne contiennent pas de cellules (à l’extérieur de l’anneau où les cellules ne sont pas cultivées). Aspirez le milieu résiduel ensemble.
    7. Ajouter 1 mL de la solution de 8 % de gélatine liquide à 37 ° C afin de couvrir les membranes. Retirer délicatement l’excédent. Attendez 5 à 8 min pour permettre à la gélatine solidifier.
    8. Ajouter frais de CO2-média indépendant (à 4 ° C) au bain jusqu'à ce que la membrane est couverte.
    9. Coupe avec le vibratome à une position de-100 µm, avec une vitesse moyenne, étant conscient de la façon dont le bloc se comporte. À la fin de la section, veillez à conserver l’orientation du tissu.
    10. Avec un scalpel, couper un coin pour identifier l’orientation de la section.
    11. Recueillir la membrane intégrée dans de la gélatine avec une spatule et le placer dans une plaque de 6 puits remplie avec le support de conservation à 4 ° C, jusqu’au greffe dans le œil du destinataire.
    12. Au moment de la transplantation, ajuster la taille de l’implant à la taille de le œil destinataire sous un microscope chirurgical (1-3 pour les rats, 10 à 15 mm2 pour les primates non humains).

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Résultats

Jambons contiennent une couche épithéliale qui doit être retirée avant l’ensemencement des cellules RPE. Un traitement enzymatique de la membrane est exécuté avec la thermolysine sous agitation. Afin de ne pas perdre la polarité de la membrane (l’épithélium est d’un seul côté), il est fixé sur un support dont la composition pourrait être différente selon le fournisseur (Figure 1 a). Vérifier l’adhérence de la membrane pour son soutien à cette étape et ajouter...

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Discussion

Nous avons décrit une méthode pour la culture des cellules RPE sur un échafaudage biologique et sa préparation pour l’implantation dans des modèles animaux. Une des étapes critiques du protocole est le maintien de l’orientation du jambon tout au long de la procédure jusqu'à ce que son inclusion dans la gélatine. En effet, l’épithélium native de la membrane est enlevé et sa membrane basale devient exposé9. Les cellules RPE doivent être semées sur le dessus de cette membrane basale. Lors de la prépa...

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Déclarations de divulgation

Olivier Goureau est l’inventeur en attente de brevets liés à la génération des cellules rétiniennes de cellules souches pluripotentes humaines. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs aimeraient remercier Jérôme Larghero et Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, France) pour leur contribution au cours de la mise en place de la méthode décrite ici.

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’ANR [GPiPS : ANR-2010-RFCS005 ; SightREPAIR : ANR-16-CE17-008-02], la Fondation pour la Recherche Médicale [programme de Bio-ingénierie - DBS20140930777] et de LABEX revivre [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau et Christelle Monville. Il a été pris en charge par NeurATRIS, une infrastructure de recherche translationnelle (Investissements d’avenir) pour les biothérapies en Neurosciences [ANR-11-INBS-0011] et INGESTEM, l’infrastructure nationale (Investissements d’avenir) ingénierie pour pluripotentes et cellules souches différenciées [ANR-11-INBS-000] à Christelle Monville. Karim Ben M'Barek a bénéficié de bourses de recherche de Stempole DIM et LABEX revivre [ANR-10-LABX-73]. J’ai-tige fait partie de l’Institut de biothérapies des maladies rares, prises en charge par l’Association Française contre les Myopathies (AFM)-Téléthon.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Armoire de biosécurité stérileTechGen InternationalSans objet
Système d’élimination des déchets liquides pour l’aspirationVacuubrandBVC 21
CO2-controlled +37  ; ° ; Incubateur à cellules CThermo Electron CorporationBVC 21 NT
200  ; et micro ; Pipette L : P200GilsonF144565
1  ; Pipette mL : P1000GilsonF144566
Aide à la pipetteDrummond75001
+4  ; ° ; C réfrigérateurLiebherrSans objet
VibratomeLeicaVT1000S
Ciseaux finsWPI501758
Pince (x2)WPI555227F
Bain-marieGrant subaqua proSUB6
Balance de précisionSartoriusCP225D
CentrifugeuseEppendorff5804
MicroscopeOlympusSC30
Agitateur à bascule horizontalIKA-WERKEIKA MTS 214D
VortexVWRLAB DANCER S40
Scalpel jetableWPI500351
film de paraffine plastiqueVWRPM992
0.200 µ ; m filtre à seringue à usage uniqueSARTORIUS16532
Seringue sans aiguille 50 mLDutscher50012
Flacons 250 mLDutscher28024
15 mL stériles FalconDutscher352097
50 mL stériles Falcon tubesDutscher352098
insert de cultureScaffdexC00001N
60  ; mm disches de culture cellulaire : B6Dutscher353004
12 puits plaque de culture cellulaireCorning3512
plaques de culture 6 puitsCorning3506
lames de rasoirTed Pella, Inc121-9
Colle cyanoacrylateCastorama3178040670105
PBS 1x (500  ; mL)SigmaD8537
ThermolysineRoche5339880001
DMEM, hyperglucose, GlutaMAXInvitrogen61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)Invitrogen12618-013
MEM-NEAA (100x)Invitrogen11140-035
b-mercaptoéthanol (50  ; mM)Invitrogen31350-010
Pénicilline/StreptomycineInvitrogen15140122
CO2-indépendantGIBCO18045-054
GélatineMERCK104078
membrane amniotique humaineBanque de tissus Hôpital Saint-Louis (Paris, France)Sans objet
tubes

Références

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